Estabilidad conformacional de las proteínas (2015)

Resumen Español
Universidad Universidad de Valencia (UV)
Grado Bioquímica y Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Estructura de macromoléculas
Año del apunte 2015
Páginas 8
Fecha de subida 20/03/2016
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T-4: ESTABILIDAD CONFORMACIONAL DE LAS PROTRINAS PLEGAMIENTO Proceso de adquisición de la estructura funcional de las proteínas (sólo realizan su función si tienen la estructura correcta o ESTRUCTURA NATIVA).
No se puede conocer con precisión la estructura que adoptará una proteína a partir de su secuencia.
EXPERIMENTOS DE ANFINSEN Propuso una hipótesis termodinámica según la cual: la estructura 3D de la conformación nativa de una proteína es aquella que, en condiciones fisiológicas, tiene la menor energía libre de Gibbs para el sistema. /Las proteínas buscan plegar los aa de manera que tenga el menor coste de energía posible./ 1) Anfinsen trabajó con la ribonucleasa para ver como varía la funcionalidad y las características espectrométricas con la variación de temperatura. A medida que esta aumentaba, bajaba la actividad protéica y la espectrometría daba disoluciones turbias simultáneamenteDESNATURALIZACIÓN. Además, vió que si bajaba la temperatura, la proteína volvía a la estructura nativaRENATURALIZACIÓN.
De esto dedujo que el plegamiento: -Depende de las condiciones del medio: influyen factores físicos (T y P) y químicos (pH, disolvente, agentes caotrópicos=compiten por hacer los p de H: Urea y Cloruro de guanidinio).
-Es reversible y cooperativo: (sigmoide) al aumentar un poco la T sólo se da más libertad a los enlaces pero se mantiene la estructura hasta llegar a ciertas condiciones en las que un cambio muy tenue de T puede hacer que se desnaturalice.
A 50% de desnaturalización habrá unas partes de la molécula estarán desnaturalizadas y otras en estructura nativa pero no en un término intermedio.* -La estructura primaria determina la terciaria: sólo con la estructura 1 la proteína sabe llegar a la 3 (2º nivel del código genético).
E. DESNATURALIZADA (random coil) -Irregular, variable y abierta -Ausencia de estructura 2 -Pocos enlaces intramoleculares -Zonas hidrófobas expuestas (efecto hidrofóbico: tiende a renaturalizarse) E. NATIVA -Regular, compacta -Rica en estructura 2 -Enlaces intramoleculares La estructura nativa se formará espontáneamente si la estructura 3 supone una ∆G negativa con respecto a la forma desnaturalizada.
¿Cómo se puede formar un núcleo hidrofóbico con un esqueleto polipeptídico (CO y NH) polar? ¿Y las cadenas laterales? La polaridad se reduce al establecerse los enlaces de H en la estructura 2.
El mayor número de p de H se establece en hélice α que abunda en el núcleo de las proteínas.
Hay un sesgo: los residuos polares se encuentran en la parte más expuesta al agua y los hidrofóbicos en el interior de la proteína. En proteínas de membrana la parte “incrustada” está formada por residuos hidrofóbicos en forma helicoidal (+p de H) y los polares en la parte de la proteína que está fuera de la membrana, en contacto con el agua.
MECANISMOS DE PLEGAMIENTO A) En ocasiones la proteína puede llegar a su estructura nativa sin impedimentos.
En otros casos las proteínas, antes de adoptar sus estructuras nativas se encuentran con intermediarios estables de plegamiento o barreras cinéticas: estructuras con cierto grado de estabilidad que dificultan que la proteína pueda llegar a su estado funcional.
B)Molten globule: intermediario de plegamiento. Es una definición fenomenológica (se ha observado, no es algo teórico). Estos intermediarios se han caracterizado mediante RMN: conservan la estructura secundaria pero no la terciaria (no se han encontrado funcionales), hay una mayor accesibilidad del disolvente y son altamente dinámicas.
C)Barrera cinética: son más difíciles de superar ya que son más estables que MG.
-Papel de los puentes disulfuro: Los puentes disulfuro deben realizarse entre los residuos de cisteína correctos para que se forme la e. nativa.
(Exp Anfinsen 2) Al desnaturalizar la proteína en el exp1 no se rompían los puentes disulfuro, por eso la molécula era capaz de renaturalizarse. Si se desnaturaliza con urea y βmercaptoetanol (reductor) los p. disulfuro se rompen y no se puede renaturalizar sólo oxidando la molécula, hace falta diálisis para separar la urea (que compite por los p disulfuro) de la proteína y que esta pueda ensayar las estructuras.
-Isomerización de la Prolina:para que se forme la estructura nativa, todos los aa deben estar en forma trans. Esto suele ocurrir ya que en la mayoría, la diferencia de estabilidad entre cis y trans es grande porque se reducen las repulsiones de cadenas laterales (1000:1). Esto no ocurre en los residuos de Prolina que, al ser ciclada, la diferencia de estabilidad es menor (4:1) y es más frecuente que adopte forma cis lo que impide llegar a E.N.
PLEGAMIENTO IN VIVO Problema: -El plegamiento debe hacerse acoplado a la síntesis de la proteína en el ribosoma (luego puede que no se pueda plegar bien por falta de espacio o interferencias; la célula está llena de cosas).
La célula selecciona las condiciones de plegamiento mediante CHAPERONAS MOLECULARES: -Ayudan a plegarse a proteínas nacientes o acabadas de sintetizar.
-Previenen y corrigen errores de plegamiento en condiciones de estrés (Hsp: Heat Shock Protein DNA-J y DNA-K en procariotas).
Sistemas enzimáticos que aceleran/ayudan el plegamiento: -Proteina-disulfuro isomerasas y Peptidil-prolil isomerasas CHAPERONAS PROCARIOTAS 70% de las proteínas se pliegan solas ya que hay menos impedimentos en la celula Otras necesitan DNA-K/J para plegarse.
Otras además necesitan el sistema GroEL -GroES CHAPERONAS EUCARIOTAS Pocas proteínas se pliegan solas. Usan: Hsp 40 y 70 para plegar al salir del ribosoma.
Algunas además PDF (prefoldina) para ayudar Hsp90 para plegar y señalizar a dónde tiene que ir la proteína tras su síntesis Sistema TRIC (similar a GroEl-GroES) GroEL-GroES Proporciona un entorno de condiciones favorables para que la proteína pruebe diferentes estructuras 3 hasta llegar a la nativa.
1)La proteína se une a la parte hidrófoba por efecto hidrofóbico (se esconde).
2)Cambio conformacional: cistrans al añadir ATP a trans y liberar ADP cis. Además, se suelta groES y se coloca uno nuevo en la nueva parte cis.
3)Hay un tiempo limitado para que se hidrolice el ATP y la proteína se pliegue en la estructura nativa. 4)Si no lo consigue, se libera pero como sigue siendo hidrófoba puede volver a unirse a la chaperona.
Antes de liberar la proteína ya doblada, una no doblada se puede unir a la parte trans y, una vez liberada, comenzar su plegamiento.
¿Cuándo comienza a plegarse una proteína? Antes de que la proteína haya acabado de sintetizarse ya se están empezando a formar sus estructuras secundarias. Trigger factor: proteína que se une a los ribosomas y tiene una cavidad con una zona hidrófoba donde la proteína puede formar la estructura secundaria antes de acabar su síntesis.
Algunas proteínas comienzan su plegamiento en el túnel de salida del ribosoma. Esto se supo por microscopía de fluorescencia de transmisión basándose en que si irradias un aa este se activa y puede activar a uno si está suficientemente cerca. Se escogieron 2 aa que, en cadena estirada no se activarían juntos pero en α-hélice sí t se vio que emitían fluorescencia dentro del ribosoma.
PROTEÍNAS INTRÍNSECAMENTE DESORDENADAS Representan un gran porcentaje de las proteínas en organismos superiores (en levadura son 1/3 de las proteínas) y participan en su regulación. Proporcionan ventajas ya que pueden adoptar un gran número de conformaciones e interaccionar con diferentes moléculas para dar respuestas complejas (como navajas multiusos).
PATOLOGÍAS RELACIONADAS CON EL PLEGAMIENTO Hay chaperonas que se encargan de doblar proteínas parcialmente plegadas no funcionales.
-Algunas forman agregados amorfos estables interaccionando entre sí que son malos para el organismo. Las chaperonas pueden evitar esto.
-También pueden formar estructuras extremadamente estables: fibras amiloides que son responsables de ciertas patologías (amiloidosis).
Estas dos agrupaciones son más estables que la forma nativa porque se basan en interacciones intermoleculares para estabilizarse, mientras que la nativa sólo se basa en intramoleculares.
Las células tratan de eliminar estos agregados mediante los PROTEOSOMAS que detectanlas proteínas etiquetadas (las “malas”) y las degradan en secuencias más cortas o aa libres que se pueden reutilizar.
Las proteínas desnaturalizadas que se agrupan formando agregados fibrilares producen AMILOIDOSIS. Existen varias enfermedades que se deben, no a un agente patógeno, sino al plegamiento erróneo de las proteínas. Las distintas enfermedades se deben al mal plegamiento de distintas proteínas pero todas tienen características comunes: -Parte de las proteínas normales sufren un cambio estructural, pasan a formar un intermediario de plegamiento con mucha hoja β que forman oligómeros solubles y que al agruparse forman fibras amiloides y estas, a su vez, placas amiloides que producen la degradación de tejidos.
-Suele afectar al tejido nervioso: Enfermedades neurodegenerativas.
ALZHEIMER Agregación de proteína APP (proteína precursora de amiloidosis), no se conoce su función en estado no patológico. Se encentra en las membranas celulares y se une con la β-secretasa que la hidroliza y genera un péptido de 40-42 aa que tiene elevada tendencia a formar agregados .
La α y β secretasa cortan un fragmento grande de la proteína que vuelve a ser cortado por la γ secretasa.
Al cortar la α y la γ secretasa no pasa nada pero si actúan la β y γ parte de la proteína transmembrana queda desanclada y libre en el medio acuoso y, al ser hidrófoba, tiende a formar agregados (sobre todo el de 42aa).
Existen mutaciones que aceleran la aparición del Alzheimer y otra que reduce la probabilidad de tenerlo en un 50% En cerebros con Alzheimer hay 2 estructuras anormales: -Placas βamiloides: depósitos densos de proteína y material celular que se acumulan alrededor de las neuronas y causan los síntomas.
-Haces neurofibrilares: fibras enrolladas dentro de las neuronas.
La enfermedad produce una degeneración del tejido cerebran: neuronas con menos ramificaciones y conexiones.
ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES Acumulación de agregados de la proteína prión PrP en el cerebro de mamíferos.
-PrPc: proteína normal de función desconocida, rica en héliceα.
-PrPsc: plegamiento patológico con agregados β.
Enfermedad de carácter hereditário, favorecida por mutaciones de la proteína prión.
Transmisión inefectiva: el prión es el agente infectivo, se puede adquirir por ingesta en grandes cantidades.
En condiciones normales es muy poco probable que se dé la forma infectiva pero, si se ingiere/incorpora la proteína en forma patológica (prión), esta actúa como catalizadora para la formación de más formas patológicas. Es peligrosa la forma semiplegada de la proteína ya que tiende a formar agregados.
Esta enfermedad fue de las primeras que se asumió que era debida a proteínas mal plegadas.
Aunque al inicio no se creía en esta teoría, se demostró al eliminar el gen que codifica para esta proteína en un organismo e infectarlo con la proteína patógena y ver que este no enfermaba. Esto se debe a que se necesita tener la proteína endógena (codificarla) para que puedas desarrollar la enfermedad (el prión necesita “convertir” a proteínas normales y que estas formen agregados; por sí solo no hace nada).
¿Cómo demostrar la hipótesis priónica? Versión priónica de los postulados de Koch: La enfermedad original tiene que poder reproducirse en un individuo receptor a partir de priones obtenidos de un donador infectado, crecidos y purificados in vitro.
PARKINSON Se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy, agregados filamentosos de la proteína α-sinucleína en el citoplasma de las neuronas. Parece un proceso relacionado con el mal funcionamiento del mecanismo de degradación de proteínas (proteosoma). Un factor que aumenta el riesgo de aparición de estos agregados es la duplicación del gen que codifica para esta proteína. Esto se extiende por formación de vesículas/secreción de agregados que pasan de una neuroa a otra e induce la formación de más agregados.
*La α-sinucleína se encuentra cerca de las membranas y puede formar hojas β que forma agregados que puede formar anillos y estos poros celulares no regulados lo que origina un desequilibrio osmótico (desregulación de Ca2+). (Ver a continuación) OTRAS -Poliglutaminosis: si hay más de 35 glutaminas seguidas se forman agregados. Huntington, Kennedy, ataxias espinocerebrales… -Taupatías: esclerosis lateral amiotrófica, Pick… *Todas estas enferemedades se deben a cambios conformacionales a hojas β pero no todos los agregados son patológicos.
Nueva hipótesis de trabajo: formación de poros Estudios recientes muestran que las protofibrillas (oligómeros con 6-8 monómeros) que adoptan estructuras globulares pueden ser suficientes para inducir la patología celular. Estos oligómeros pueden formar poros no regulados en las membranas celulares que dejen pasar iones (Ca+2) y desestabilizar el balance osmótico llevando al colapso celular.
Aproximaciones terapéuticas -Chaperonas químicas: moléculas pequeñas que se unen a las proteínas e impiden su mal plegamiento.
-Priones: proteínas (anticuerpos) que se unen a las proteínas para alterar el mal plegamiento.
*En Alzheimer: -Péptidomiméticos: pequeñas secuencias de aa derivadas del péptido β-amiloide que se unen a esta proteína e impide que forme agregados.
-Inhibidores no peptídicos: igual pero sin ser péptido.
-Moduladores de secretasas: activador de la α e inhibidor de la β.
-Inmunoterapias con anticuerpos.
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