TEMA 7 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 24
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 7 de l'assignatura Biologia Molecular: Obtenció de gens o de fragments de DNA per clonar.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 7 – Obtenció de gens o de fragments de DNA per clonar Tipus de genoteques Necessitem saber quin fragment volem clonar. No és el mateix si vull clonar un gen eucariota que si vull clonar qualsevol fragment o bé un genoma. Els genomes eucariotes són molt grans i ens volem quedar només amb la part codificant del genoma. Depenent del que busquem, si per exemple busquem un gen eucariota, ens interessa (al menys inicialment) partir del mRNA que expressi el gen que ens interessa clonar. Anirem a construir una genoteca o llibreria de cDNA  aïllem el mRNA total de la cèl·lula (màxim de pur possible) i mitjançant la transcriptasa inversa transformar-lo en cDNA de doble cadena. Cada un d’aquests cDNA s’unirà a un vector i en aquest conjunt de vectors transformaré cèl·lules.
Anem a construir genoteques genòmiques si ens interessen regions reguladores i hem d’assegurar-nos que no hi hagi contaminacions tot extraient el DNA genòmic. El fragmentarem, obtindrem n fragments i el nombre de fragments serà molt més gran que no pas amb la genoteca de cDNA, mitjançant la reacció de lligament el ficarem a un vector, transformaré cèl·lules i cada una d’aquestes donarà lloc a una colònia que porta un fragment en concret diferent i plaquegem per anar a trobar el fragment que m’interessa.
1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Esquema de creació d’una genoteca genòmica Extreure tot el DNA genòmic. Un cop extret assegurant la font d’on prové i no contaminació. Fem una digestió parcial utilitzant (normalment) un sol enzim de restricció perquè hi ha múltiples dianes.
Fem digestió parcial perquè - - Després necessitem fer una etapa de centrifugació per eliminar fragments del genoma o massa llargs o massa curts per poder unir-los al vector (els vectors no accepten qualsevol mida de DNA) Ens hem de quedar amb la mida òptima perquè pugui transformar. Pots estar perdent informació del genoma i interessa que la genoteca tingui tot el genoma sencer (a trossos però sencer).
Restricció parcial d’un DNA Hem de reconstruir el genoma i interessa fer digestió parcial perquè si tenim tots aquests fragments cada un d’aquests va a parar a un clon, extraiem i el seqüenciem.
Tot i conèixer la seqüència com ordenes les seqüències?  En canvi, si fem 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) digestions parcials hi haurà fragments que hauran tallat en determinades dianes i tindrem un fragment més gran i solapats, amb seqüències solapades. Pot ser també, doncs, que no hagi tallat en una diana però si l’altre i tindrem sempre fragments amb seqüències solapades i un cop seqüenciem els fragments podem veure les coincidències, fer aparellaments i veure com continua tot plegat, aconseguint ordenar les seqüències. Si no haguéssim fet digestions parcials no podríem ordenar-ho perquè no coneixem la seqüència original. Necessito digestions parcials per poder reconstruir la seqüència.
(TORNANT A LA IMATGE ANTERIOR A AQUESTA): Per tant, quan fem la genoteca i la digestió parcial, centrifugació i tot treure de sobre fragment solapats no ens traiem de sobre informació i abans de fer la reacció de lligament s’agafen els fragments generats, el que fem és addicionar linkers. Un linker és una seqüència de DNA curta que al seu interior té la seqüència reconeguda per un enzim de restricció. Del conjunt de n fragments faig una etapa de metilació utilitzant les metilases que reconeixen justament la diana de restricció que afegiré als linkers i si tinc dianes internes pels fragments quedaran metilades i no podran ser tallades. Afegim els linkers amb diana de restricció per un enzim de restricció i els fragments amb els linkers afegits, els fragments quedaran intactes i a cantó i cantó tindré els linkers n vegades, una per 3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) cada fragment. Extracció del DNA genòmic, digestions parcials, metilacions de les dianes dels fragments (metilasa que reconeix la diana per un enzim de restricció determinat) i un cop metilat addiciono els linkers i després tallo amb l’enzim de restricció per assegurar-me que s’ha unit al linker adient per poder unir-se al vector i generar la genoteca.
Es fa perquè no es pot assegurar que s’hagin seleccionat per mida i no tinguin dianes internes, per això metilen les dianes internes abans d’afegir els linkers (s’uniran a l’extrem i extrem) i posteriorment es posa l’enzim de restricció que només tallarà pels extrems.
Tindrem, al final, milions de clons que cadascun porta un fragment diferent quan hàgim fet la reacció de lligament amb les cèl·lules transformades.
Quan infectes una cèl·lula bacteriana i es veuen calves de fag. Clapes de lisi.
Fem un rastreig d’una genoteca per trobar la seqüència que ens interessa. Es fa utilitzant sondes marcades radioactivament. Com ho fem per rastrejar les genoteques ho explicarem quan donem com es construeixen les genoteques.
Preparació d’un cDNA: síntesi de la primera cadena Construcció de genoteca de cDNA mitjançant mRNA. Interessa clonar gens eucariotes. Necessito aïllar el mRNA i és molt important aïllar-lo d’una cèl·lula que estigui expressant el gen i amb transcriptasa inversa el passem a cDNA de doble cadena. Cada fragment lligat al vector...
- Síntesi d’un híbrid DNA:RNA  Mètode oligo(dT) Com passem de mRNA a cDNA?  hi ha diferents estratègies per sintetitzar tant la primera cadena (copia directa del mRNA) com la segona cadena de cDNA.
Com sintetitzem la primera cadena?  Partim de la meva barreja de mRNA i justament utilitzo la cua de poliA. Afegim un encebador que sigui un oligoT i aquest serà complementari a la cua de poliA i això són n cadenes de missatger i permeto que es doni la hibridació entre la cua de poliA i els nucleòtids. Afegim la transcriptasa inversa i els dNTP. Enzim amb DNA polimerasa però que copia d’un motlle que és RNA (transcriptasa inversa). Necessita l’encebador que serà l’extrem complementari de la cua de poliA dels mRNA. Els 4 dNTP i la transcriptasa inversa utilitza això com a encebador per copiar la cadena de RNA que serà complementària a la de mRNA.
Un aspecte important és que comencem per l’extrem 3’ del mRNA i hem d’arribar a l’extrem 5’. Perquè realment es puguin copiar totes les cadenes de mRNA s’ha de trencar l’estructura secundària de mRNA i si no és així quan arribi a un loop es desenganxa i no acaba de copiar. Tractem les cadenes amb productes com serien aldehids.
De vegades aquest oligoT porta unit una seqüència que conté una diana per un enzim de restricció. Afegim un linker perquè posteriorment aquests linkers serviran per tenir les cues adients per unir-los al vector. Aquest oligoT s’aprofita i fem que tingui un linker. Una manera és entrar-lo en aquest punt d’aquí.
Al final del procés tindre per cada un dels mRNA de la barreja un híbrid de RNA:DNA.
4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Mètode random primers L’altre mètode és partir de random primers (mètode alternatiu). Podem afegir el oligoT complementari de la cua poliA i encebadors primers relativament curts (5-8 bases) i és fàcil que trobin llocs als mRNA que siguin complementaris. Els encebadors podran hibridar amb el conjunt de mRNA.
Enlloc de tenir un únic encebador tenim més d’un encebador, amb la qual cosa és més fàcil que la transcriptasa inversa pugui copiar la longitud total dels mRNA. Un cop fet el procés d’hibridació hem de tancar la cadena i falta l’etapa d’edició per DNA lligasa.
Tindrem un tros que creix fins un punt determinat i queda la cadena oberta.
Necessitem que es tanquin les cadenes que han anat creixent.
5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Preparació d’un cDNA: síntesi de la segona cadena Quan sintetitzem la segona cadena partim d’híbrids de DNA:RNA. Es representen els híbrids a la imatge anterior i la continua és la de DNA i la discontínua la de cDNA. Es tracta amb solució alcalina escalfant, tot provocant la degradació de RNA. Es degrada la cadena de RNA del meu híbrid.
Una altra manera de degradar la meva cadena de RNA és utilitzar ribonucleasa H (enzim del llistat del tema 5) amb capacitat de degradar les cadenes de RNA dels híbrids de DNA:RNA.
Obtinc tot un conjunt de cadenes de cDNA. Es crea un artefacte quan la transcriptasa inversa es fa treballar in vitro i aquests conjunts de cDNA es doblen sobre si mateix i formen una espècie de autoaparellament deixant un extrem 3’ que servirà d’encebador per la síntesi de la segona cadena de cDNA. Hem d’afegir el fragment de Klenow de la DNA pol1 i els dNTPs. Creixerà copiant la primera cadena i tindrem un cDNA de doble cadena unit per l’extrem formant un llaç de cadena senzilla. Un cop he acabat de sintetitzar la segona cadena necessito tractar el segon fragment que està unit amb un llaç de cadena senzilla mitjançant la nucleasa S1, 6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) tallarà els llaços dels extrems que fan nosa. Aquesta digestió s’ha de fer en condicions molt controlades perquè tot i tenir preferència per tallar DNA de cadena senzilla si la deixo fer també degradaria DNA de cadena doble i això no interessa.
Com això de vegades és difícil hi ha estratègies alternatives. Si hem fet aquest procés correctament obtindrem un cDNA de longitud total.
Una altra estratègia per sintetitzar la cadena és el de desplaçament d’osca. Partim de la barreja d’híbrids DNA:RNA i es tracten amb ribonucleasa H. Si tractem aquests híbrids amb aquests enzims i a temps controlat no es degrada completament o no té temps per degradar el RNA dels híbrids i tenim algunes cadenes amb fragment situats en diferents posicions formant aparellament de bases, si afegim DNA pol sencera + 4dNTP utilitzarà els encebadors i començarà a copiar de 5’3’ i 3’5’ Queden fragments de RNA però si fem servir la DNA pol1 té activitat exonucleasa 5’3’ per eliminar de les cadenes sintetitzades el fragment de RNA. Com la cadena ha crescut, tot i eliminar el fragment es torna a reomplir el forat.
Al final de tot, haurà crescut i eliminat i reomplert. La pega és que tenim un encebador en un dels extrems, com elimini el extrem no tenim res d’encebador per poder reomplir i es pot perdre informació de l’extrem 5’ dels mRNA. Si ho hem fet ben fet tenim un cDNA de longitud total. Pot ser difícil conservar l’extrem 5’ però no sol ser problema 7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) perquè presenten una regió líder i tràiler que no són codificants. Si perdem aquesta part no és codificant pel gen.
Partir sempre del conjunt de híbrids de DNA:RNA. Permet addicionar nucleòtids sense partir de cap motlle.
En vermell trobem el RNA, les quals les eliminem posant-les en solució bàsica i escalfant. Em quedo exclusivament amb la cadena de cDNA. Un cop eliminat, afegim la transferasa terminal (permet addicionar nucleòtids al extrem 3’). Si afegim només guanina o només un tipus de nucleòtid farà cua de guanines o de x nucleòtid.
Afegim un oligoT (seqüència de citosines) que serà complementària de la cua de guanines afegides en 3’. Hibrida amb la cua de guanines afegida i altre cop el que fem és utilitzar aquest oligoC per tenir un motlle de DNA amb el qual el fragment de Klenow farà servir d’encebador. No hem de tractar amb nucleasa S1. Podem fer la còpia de la segona cadena de cDNA. En aquest cas el oligoC afegit pot portar incorporat un linker amb una diana per després tallar i enganxar el fragment.
Ús de linkers o adaptadors Imprescindible per lligar el conjunt de fragments de cDNA al meu vector. Unim les meves molècules de cDNA a linkers. Què passa?  Puc afegir els linkers i és un fragment de DNA amb una seqüència determinada que té una diana per un enzim de restricció conegut amb el qual tallarem el vector per unir el conjunt de cDNA. Ningú m’assegura que dins el cDNA hi hagi dianes internes que corresponguin a la mateixa seqüència de diana de restricció per l’enzim que volem utilitzar al linker. Necessitem la metilasa específica que reconegui la seqüència i es bloquegin les dianes internes.
Afegim un linker, per exemple que reconegui una seqüència per EcoRI. Un cop fet la reacció de lligament i es posen els linkers a cantó i cantó, tallem amb EcoRI i si hi ha dianes per EcoRI tindrem cDNA de doble cadena pels extrems del vector. Quan estic sintetitzant la cadena i fem servir un oligoT aquest pot portar ja el linker. Hi ha vegades que per estalviar-nos l’etapa de metilació i després haver de tallar podem demanar 8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) linkers pre-tallats. Hi ha extrems que corresponen als extrems que em deixarien després d’haver tallat. Hi ha linkers que acaben amb extrems cohesius directament. Es barregen amb aquests linkers i els cohesius quedaran sobresortint. Millora el rendiment final i la meva genoteca contindrà tots els gens que en principi s’estan expressant en aquella cèl·lula.
Directament anem a lligar amb el meu vector un cop addicionats els linkers. Si tenim un plasmidi, n colònies portaran el vector amb un fragment de cDNA i cadascun d’aquests correspon a diferents fags.
Pot haver representat a la genoteca tots els fragments possibles. Si son genòmiques han d’haver tots els genomes possibles.
Quan parlàvem dels diferents tipus de gens presents al genoma normalment tenim gens que són d’alt nivell d’expressió i aquest dona moltes copies, es transcriu molts cops i tindrem molts mRNA que s’hauran transcrit d’aquell gen.
Podem tenir gens amb un nivell d’expressió mig o baix i d’altres amb molt baix.
Evidentment, això sol constituir un 90% del mRNA total. Podem tenir més d’un però pot donar moltes copies. El que dóna especificitat cel·lular són els que més s’expressen i els que són constitutius són els que hi ha poques còpies. Interessa tenir moltes copies dels que fan poques copies i que hi siguin tots, perquè si falla un com s’expressen tan poc ens carreguem la genoteca.
Com ha de ser la genoteca per assegurar al 100% de que hi hagi contingut del genoma? 9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Estimació de la mida d’una genoteca Existeix una formula empírica que em permet estimar com de grossa ha de ser una genoteca (ja sigui de cDNA o genòmica) per assegurar que trobem el 100 de les sequencies de RNA.
N = nombre de clons necessari (mida de la genoteca) per assegurar la probabilitat de gairebé el 100% per tenir contingut qualsevol dels mRNA p = probabilitat n = nombre mínim de colònies que hauria de rastrejar Per una genoteca de cDNA => n = n gens que cadascun d’aquests ens dóna un nombre determinat de còpies i això es divideix pel % de RNA respecte el total Cèl·lula de mamífer i agafem els RNA que corresponen a només 14 còpies.
30% de tot el RNAm que podem aïllar.
Nombre de seqüències de mRNA diferents que hi ha en cadascuna d’aquestes fraccions.
Suposem que d’aquests que donen 14 copies hi ha 11.000 Aquests RNA són poc abundants i sabem que hi ha 11.000 diferents i els volem tots dins de la genoteca però aquests 11.000 només són un 30% de la genoteca i volem que aquests 11000 siguin un 100%.
Què fem?  11.000/30 * 100  quants hauria de tenir aquí  37.000 clons o colònies diferents (Això seria lo mínim per poder tenir aquests Apliquem l’altre formula i necessitaríem un mínim suposant que tot ha funcionat a la perfecció per assegurar una probabilitat del 100% de que hi hagi tots aquests (170.000 clons).
Per tenir present qualsevol fragment del genoma però en aquest cas n és el nombre mínim de colònies a rastrejar perquè tot el genoma estigues en la genoteca. Com calculo N?  dividint la mida del genoma per la mida mitja dels fragments obtinguts P passat a tant per 1 i les kb passades a parells de bases N s’expressa en nombre de clons Dins d’una genoteca (ja sigui de cDNA o genòmica) com ho fem per buscar el fragment que ens interessa?  Es pot automatitzar. Les genoteques es poden 10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) comercialitzar. Hi ha maneres de picar les colònies i distribuir-les de manera que es faciliti trobar el fragment d’interès.
La gràcia de tot això és com ho fem per fer el rastreig. Es rastregen de la mateixa manera ja siguin de cDNA com de genoma.
Estratègies per facilitar la presència de gens poc expressats 1. Fraccionar el mRNA total per mida (ultracentrifugació).  un cop tenim aïllat el mRNA, millor la ultracentrifugació zonal i trenquem la estructura secundària (tractar amb substàncies com formaldehid prèviament). Si més o menys conec la mida del fragment em quedaré amb la fracció que tingui els mRNA de la mida que m’interessa i no construeixo la genoteca amb el total de mRNA sinó amb el conjunt que tenen la mida que volem. Mitjançant un procés in vitro fem traducció dels mRNA. Agafo un kit i el mRNA s’unirà al ribosoma tot sintetitzant proteïna per tots els mRNA que hi hagi. Un cop fem el procés de traducció. Si tenim un sistema o mecanisme per detectar les fraccions que ens interessen. M’asseguro d’agafar la fracció que conté el mRNA que realment m’interessa (no sempre es pot fer). La condició és tenir un sistema per detectar la proteïna que s’està produint i l’altre condició és que la proteïna s’hagi plegat correctament per poder ser reconeguda pel sistema de detecció.
2. Fraccionar el cDNA per mida  una altre possibilitat amb la qual guanyo (ja he fet totes les passes i he transformat el mRNA en cDNA i separat per mida). El cDNA és més estable, no es degrada tan fàcilment com el mRNA, es pot separar per ultracentrifugació de CaCl, però pot ser que la transcriptasa inversa salti i no obtinguem un cDNA de longitud total. Afegim linkers a cantó i cantó per poder lligarlo al vector corresponent. Si falla això, realitzar un fraccionament del cDNA m’elimina (avantages): - Elimina còpies de cDNA parcials - Elimina aquelles molècules que no han incorporat la cua 3. Alineament de polisomes per immunoprecipitació  no va molt bé però pot ser utilitzar com alternativa. Un polisoma és un mRNA al qual s’han unit els ribosomes i està a punt de ser traduït. Com més hagi avançat més fragment tindrem traduït. Es tracta d’agafar el conjunt de mRNA i fer que es tradueixin in vitro exactament com abans. Necessito també alguna cosa que em reconegui la proteïna d’interès (codificada pel mRNA i gen corresponent). Aquest anticòs s’unirà a la proteïna (correctament plegada) i, per tant, puc afegir a tots aquests polisomes que estan traduint els mRNA afegir un anticòs. A partir d’aquí, la barreja de polisomes traduïts amb el anticòs que reconeix la proteïna i agafem la barreja i l’apliquem a una columna de cromatografia i unir una proteïna A. Aquesta proteïna A es troba a la paret d’estafilococs Aureus té la capacitat de reconèixer i unir-se a la regió variable tant de les cadenes pesades com de les lleugeres. Els anticossos es poden separar tractant-se amb una proteasa i donen un fragment anomenat Fc i (Fab)2.
La gràcia de la proteïna A és que pot reconèixer la part comuna de les immunoglobulines. El conjunt de missatgers estan essent traduïts i el meu anticòs és específic per aquesta proteïna. Un cop afegit l’anticòs, carrego una barreja a la columna cromatogràfica que té boles recobertes per la proteïna A i aquestes són 11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) específiques per la regió Fc de l’anticòs. Quan passi la barreja i faci rentats el que quedarà unit serà el polisoma. Vols el polisoma per aïllar el mRNA. Si puc dur a terme aquest procés una possibilitat és aconseguir això. En principi només queden units els polisomes que expressen la proteïna que ens interessa. Construïm la genoteca amb pocs mRNA i amb enriquits dels que ens interessen. Pocs cops serveixen i no sempre tenim els anticossos necessaris, un cop es tradueix in vitro s’ha de plegar correctament i no sempre tens anticossos que reconeguin fragments policlonals. És difícil que funcioni però va molt bé quan funciona.
4. Selecció del material de partida  és crític per les genoteques de cDNA perquè a una genoteca de cDNA tenim presents els mRNA que passem a cDNA. Aquests representen NO EL CONJUNT DE GENS DE LA CELULA SINÓ ELS QUE S’ESTAN EXPRESSANT. L’ideal serà aïllar aquest tipus de cèl·lula. Si el gen en concret només s’expressa en un sol tipus de cèl·lula intentaré disgregar el teixit.
Aquell conjunt de cèl·lules que sé que està expressant el gen que m’interessa. És important obtenir molt bé el material inicial a partir del qual aïllaré els mRNA.
5. Protocols d’aïllament i precipitació de RNA més efectius per addició de “carriers” (rRNA, poli I, poli I- poli C)  aquells gens que hi ha moltes copies, algun em precipitarà. Els que hi ha poques còpies igual no ens precipita cap. Hi ha protocols que faciliten el procés de precipitació dels mRNA. Addició en el moment de precipitació que són carriers. Com més hi ha, més precipita i com més precipita més arrosseguem. Aquests RNA que afegim han de tenir la condició de ser rRNA, poli Inosina, doble cadena de poli I-poliC. No poden passar a ser cDNA quan faci el procés de conversió de mRNA a cDNA. Guanyo amb això tenir petits nuclis de condensació que ajuden a precipitar i que no quedin mRNA perduts al sobrenedant (sobretot els que fan un numero petit de copies).
6. Ús d’adaptadors  fer servir linkers pretallats amb l’enzim de restricció.
Estalviem l’etapa de metilació, tallar amb enzim de restricció... qualsevol procés que elimini etapes em fa augmentar el rendiment de la tècnica. Hi ha processos combinables.
7. Amplificació per PCR dels cDNAs emprant encebadors complementaris a les cues afegides  aquells que hi ha poques còpies també tindran poques copies al cDNA. Afegim els linkers a cantó i cantó i sabem la seqüència d’aquests linkers.
Tots els mRNA tenen els linkers. Abans de passar a cDNA podem fer un procés d’amplificació per PCR del conjunt de mRNA fent servir encebadors complementaris als linkers. Després de n cicles de PCR augmentem la probabilitat de lligar els fragments de baix nombre de copies a un vector i tenir-los presents a les genoteques.
Anar a buscar el fragment d’interès i hem de fer un rastreig de genoteca: 1. Rastreig fent servir sondes marcades radioactivament (hibridació)  veurem com es dissenyen aquestes sondes un cop sapiguem com fer el rastreig.
12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) N colònies amb n clons i piquem amb un escuradents les colònies. Disposició en array plaques amb pouets. És llarg, laboriós...
Rastreig d’una genoteca per hibridació amb una sonda marcada radioactivament El que fem és agafar una membrana de nitrocel·lulosa i la col·loquem damunt de la placa on tenim totes les colònies creixents. La placa té una marca i la membrana de nitrocel·lulosa té una altre marca, les fem coincidir. Una part de les colònies queden adherides a la membrana i treballem amb la membrana. Tractem la membrana amb medi bàsic (lisi de cèl·lules i desnaturalització del DNA). El DNA de cadena senzilla té afinitat per quedar adherit a la membrana i en els llocs corresponents a cadascuna de les colònies. Agafem una sonda que tingui una seqüència complementaria del gen o fragment de DNA que busquem. Agafo la membrana, la poso a una bossa, afegim la sonda, permetem que hibridin. Paper fotogràfic a sobre. Autoradiografia. Només aquelles colònies que tenen DNA complementari a la sonda apareix ennegrit. Agafem l’autoradiografia, anem a la placa mare i comparem tot col·locant en la mateixa orientació. Pico les colònies, les faig créixer, extrec DNA, seqüencio i obtinc la meva seqüència.
13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Resultat real de quines colònies hibriden amb la sonda i recuperar-les de la placa mare. Com dissenyo això perquè hibridi amb el que m’interessa i no amb alguna cosa que doni falsos positius?  (o al menys obtenir el mínim possible).
Pouets amb medi de cultiu i vaig picant les colònies i podem posar-ho en plaques.
Passo d’un conjunt de colònies desordenades a colònies molt ben ordenades en files i columnes. Un cop transferides les colònies a les plaques podem fer múltiples repliques de la placa mare. Podem obtenir n plaques amb n pouets. Cadascun d’ells tindrà una 14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) colònia diferent i podem agafar un aparell dissenyat per encaixar amb els pous i es passa a una altre placa. Tindrem una distribució en files i columnes corresponent a la placa mare. Ho podem fer n vegades i cadascuna de les plaques generades fem lo mateix que hem explicat abans de la membrana de nitrocel·lulosa. Trobarem que les ennegrides són les que hibriden amb la sonda. podem aconseguir rèpliques i rastrejar la genoteca amb més d’una sonda alhora. És molt fàcil anar picant a diferents plaques.
Rastreig d’una genoteca quan coneixem la seqüència de la proteïna Disseny de la sonda o d’on la puc obtenir? 1. Fer servir un gen homòleg obtingut d’una altre espècie. Per exemple, si busco el gen de la insulina humana però potser tinc el gen que codifica per la insulina d’un primat.
2. Fer servir la immunoprecipitació dels polisomes. Costa, és poc probable (mRNA).
3. Normalment és la que més vegades es fa servir. Aïllar una proteïna codificada pel gen que estic buscant (si busquem gens, si busquem parts no codificants s’anirà a buscar per una altre part). Agafem la proteïna, la fragmenten a trossos, separem els fragments i cadascun d’aquests es poc seqüenciar (degradació de Edman). Si conec la meva seqüència de la meva proteïna, com conec el codi genètic puc convertir la seqüència d’aminoàcids del fragment proteic en nucleòtids.
Codi genètic degenerat i la metionina i el triptòfan són els únics que no tenen més de un triplet per codificar aquest aminoàcid. No hi ha cap proteïna que estigui només codificada per metionines i triptòfans i per tant tindrem diferents opcions de triplets. La opció que tenim (més correcta) és fer totes les construccions possibles i utilitzar oligos degenerats. (Preferim els triptòfans i metionines, anar a triar els fragments que tinguin el màxim nombre possible). Conèixer entre 6 o 7 15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) aminoacids SEGUITS de la proteïna i això equival a 18 – 21 bases. Faig totes les construccions possibles, dels quals només un serà complementari de la seqüència de la sonda. hi ha poca probabilitat de que hi hagi falsos positius.
4. Sintetitzar un sol oligonucleòtid que serà més gran (36 – 39 pb) que equival a uns 12 – 13 aminoàcids seguits. Ús de codons de l’espècie buscada. Buscaré que hi hagi triptòfans i metionines.
Rastreig d’una genoteca: detecció immunològica Detecció del producte d’expressió, és a dir, la proteïna. En aquest cas, evidentment, intentem trobar en cada colònia la proteïna codificada per aquell gen. Això només serveix per genoteques de cDNA. Les genòmiques les construïm fragmentant el genoma i ningú em garanteix que estigui el genoma sencer.
Hem de tenir construïda la genoteca en un vector d’expressió (abans donava igual si s’expressava o no el gen). Hem de posar tots els cDNA darrere d’una regió promotora.
Això s’ha de poder transcriure i traduir fins a proteïna. A part d’utilitzar un vector d’expressió tots els fragment de cDNA haurien d’entrar en la orientació correcta i haurien d’entrar en fase o mantenir la pauta de lectura. Amb això volem dir que si clonem tallem amb un enzim de restricció A i tenim els fragments obtinguts amb A. Pot entrar amb una orientació o amb la contrària. Si entra amb la contrària i volem detectar el producte d’expressió no servirà per res. Com això no ho controlaré, ens està dient que tindrem un 50% de clons que entraran amb la orientació correcta i un 50% de clons que no entraran amb la orientació correcta.
Després del promotor ha de venir el RBS i ha de venir el primer triplet de inici. El meu gen ha d’estar en fase amb el meu primer AUG, sinó s’expressarà el que li doni la gana.
Com aconsegueixo que com a mínim aquest 50% de orientació correcta entri en fase?  es fan servir vectors que entre el que és la regió promotora i el punt on començaré a enganxar els cDNA està separat per una seqüència de nucleòtids en el que utilitzo 3 vectors diferents però en cadascun d’aquests vectors la seqüència està escurçada en una base. Si l’escurço amb una base, alguna d’aquestes 3 ha d’entrar en fase si o si (perquè anem per triplets). Per construir les genoteques es fan servir els vectors 16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) d’expressió i el mateix vector que té una diferència d’una sola base. Tenim una sola probabilitat entre 6 de tenir les colònies que expressen el cDNA en la orientació correcta i en fase.
Si aconsegueixo fer això el sistema de rastreig és molt semblant al per hibridació.
Posem un filtre de nitrocel·lulosa per saber la orientació. Queden les colònies enganxades amb la mateixa distribució de la placa i ho lisem (afinitat per unió de proteïnes) i incubem la membrana per exemple amb un anticòs que reconegui la proteïna que estic buscant. Detecció de la proteïna codificada pel gen que estic buscant. Per poder fer el sistema de detecció necessito un anticòs primari específic per la proteïna que estic buscant i procedeixo al revelat amb un anticòs secundari que reconeix la fracció constant del anticòs primari. Pot estar marcar amb un fluoròfor, estar unit a un enzim que transforma el substrat en un producte que emet color, fluorescència, luminiscència... l’anticòs secundari porta alguna cosa marcada radioactivament o bé els esmentats anteriorment. Detecció immunològica.
17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Fent servir una proteïna d’unió a la buscada: Hi ha una altre possibilitat que podem fer servir però anem a suposar que estem buscant una proteïna que sabem que s’uneix a una proteïna que en tenim en prou quantitat. Estarà marcada també.
Si estem buscant un enzim també podem afegir substrat que si s’expressa l’enzim donarà una cosa que té color.
Tot això només en el cas que la proteïna que estem buscant sigui un enzim.
Tot això dins de rastreig per producte d’expressió.
Necessitem que la proteïna estigui plegada correctament.
Rastreig d’una genoteca: cromosome walking Quan construïm una genoteca genòmica pot ser que quan la construïm el gen quedi a trossos i cada tros quedi a un clon diferent. Hauríem de poder buscar aquest gen dins de la genoteca. Part del genoma eucariota conté regions que no contenen informació codificant (no sempre son gens).
La tècnica que rep el nom de recorregut cromosòmic o chromosome walking. Tenim un fragment o gen i quan construïm la genoteca queda fragmentat a trossos on cadascun d’aquests ha quedat unit a un vector diferent i dona lloc a una colònia diferent. Cadascun d’ells estarà on estigui a la genoteca.
Puc fer un rastreig de la genoteca amb una sonda marcada radioactivament. Suposem que podem dissenyar una sonda complementaria a un extrem del meu gen. La dissenyo i rastrejo. Detecto un clon i suposem que el piquem, fem créixer el cultiu, aïllo el fragment i seqüencio tot el insert que conté el meu clon. A banda de la regió complementaria de la sonda utilitzada coneixerem un tros mes de la seqüència d’aquest fragment. Amb aquest tros que sobra dissenyo una sonda diferent de l’altre (no complementària a la primera).
18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) A partir d’aquí, amb aquesta segona sonda complementaria al fragment d’on s’havia tret. Com els fragments estan solapats trobarem aquest fragment A però també el B. A banda de la regió complementària de la segona sonda puc conèixer un tros més de la seqüència. Es torna a dissenyar una sonda complementaria a aquest tros del segon clon i torno a realitzar el procés.
Per la primera sonda necessites un mínim coneixement del fragment que estem buscant.
Ordenem els fragments i com hi ha trossos que coincidiran (estan solapats). I reconstruïm el gen. Es fa servir per reconstruir gens en genoteques genòmiques i també per seqüenciar genomes sencers.
Fins ara el que hem vist és que podem fer genoteques o bé genòmiques o bé de cDNA. Podem també aconseguir fragments per clonar sense haver de passar per genoteques. Per exemple, realitzant PCR.
Obtenció d’un fragment de DNA per clonar per PCR amb dianes de restricció en els extrems 19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Com obtenir un gen sense passar per una genoteca (partint de DNA genòmic) Oligonucleòtids dissenyats el màxim específic possible. Per poder aïllar mitjançant PCR i DNA genòmic el fragment o gen d’interès el disseny de oligos ha de ser molt bo. Oligos dels extrems del meu gen. Necessitem conèixer seqüències dels extrems del gen. Màxim d’específic possibles.
Afegim els oligos o encebadors, polimerasa termoestable i fem reacció de PCR.
Després de n cicles el producte majoritari obtingut és el que hi ha entre els dos encebadors afegits.
Volem DNA genòmic extremadament pur i oligos altament específics perquè agafi el gen d’interès.
Si afegim linkers que tinguin una diana de restricció coneguda (oligo específic per la zona que volem). Al final de n cicles de PCR haurem aconseguit amplificar el fragment que porta a cantó i cantó dianes per l’enzim corresponent. El producte majoritari de PCR tindrà linkers a cantó i cantó que al aplicar els enzims de restricció deixaran extrems cohesius i així poder lligar aquest fragment al vector que sigui per una reacció de lligament.
RT – PCR (reverse transcription + PCR) 20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) A partir del mRNA total. Primer agafo el conjunt de mRNA aïllats. A partir de mRNA que es passa en cDNA i es crea una segona cadena de cDNA.
Dissenyo un primer que sigui complementari per sintetitzar la primera cadena de cDNA, complementari a un extrem del meu missatger específicament que estic buscant perquè sinó s’amplificaria un altre fragment que potser no interessa perquè el genoma és molt gran i potser coincideix amb altra seqüència. A partir d’aquí desnaturalitzo els híbrids cDNA:DNA que s’hagin format i afegim un primer complementari a la cadena de cDNA sintetitzada per la polimerasa. L’encebador sintetitzarà la segona cadena de cDNA. A canto i cantó faig servir els encebadors i amplifico només els fragments d’interès. Puc tallar amb els enzims que sigui i queden els extrems. Estratègies per obtenir fragments per clonar sense passar per la genoteca. Encebadors que amplifiquin exactament allò que vull.
Síntesi química d’oligonucleòtids en fase sòlida (mètode de les fosforoamidites) La síntesi química avui dia esta automatitzada i podem encarregar-les a cases comercials. Si són petits són barats. Si volem sintetitzar un gen sencer, no necessito un oligo de 30 bases sinó un carro i dues cadenes que siguin complementaries. La síntesi d’oligonucleòtids no té un rendiment del 100% i la síntesi química implica que la cadena la fem créixer addicionant nucleòtids on cada addició és una etapa de reacció.
Si tenim 12 bases seran 11 etapes de reacció.
Avui dia s’han aconseguit etapes de reacció molt eficients. Per enganxar dos nucleòtids (etapa de reacció) s’ha aconseguit un rendiment de 90%. Al cap de 11 etapes es redueix un 30% de rendiment.
Avui dia s’aconsegueix un 98% i després de 11 etapes es transforma en un 80%. Com més etapes més disminueix el rendiment.
El mètode de síntesi química en fase sòlida (la cadena de oligos es fa créixer ancorada en una matriu solida) i és el mètode del fosforoamidites. Com s’aconsegueixen aquestes elevades eficiències?  no entrem en detall però es busquen condicions termodinàmicament favorables per la unió d’un nucleòtid amb un altre amb solvents aquosos i s’aconsegueix també modificant químicament els nucleòtids que anem addicionant.
Etapes: 1. Partim d’un primer nucleòtid a l’extrem 3’ de la cadena i mitjançant l’OH en 3’ l’unim a la matriu solida de sílica a la qual penja una cadena de n grups CH2 i s’uneix covalentment al OH del primer nucleòtid.
2. Per aconseguir, per tant, que reaccioni aquest grup hidroxil a la cadena hem de bloquejar el grup OH 5’ amb un grup químic i hem de bloquejar tots els grups químics dels anells de les bases nitrogenades que tenen capacitat de reacció.
3. Un cop ancorat el nucleòtid a la matriu afegim el següent nucleòtid. Aquests estan bloquejats en el OH 5’ i tots els grups químics. El grup OH 3’ s’afegeix el grup anomenat fosforoamidita. Aconseguim un grup fosfat altament reactiu, busquem reaccions amb un rendiment molt elevat. Un cop enganxat el nucleòtid a la matriu hem de desenganxar el meu OH5’ perquè es pugui enganxar al següent nucleòtid en 3’.
21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 4. Afegim el següent nucleòtid i amb tots els grups protegits i el grup OH modificat.
Atac nucleofílic del grup OH sobre el fosfat i salta el grup químic i em queda el grup OH 5’ del primer nucleòtid unit al fosfat i comença a recordar al enllaç fosfodièster. Anem afegint la resta de nucleòtids. Desprotegim el grup OH 5’ i addicionem el nucleòtid següent. Suposem que al final aconseguim la cadena que volem sintetitzar. Oxidem el grup fosfat perquè comenci a recordar al enllaç fosfodièster 3’5’ i només em queda anar desprotegit els grups OH units als P i desprotegir els grups químics de les bases nitrogenades. Tallem la cadena unida covalentment a la matriu inert, aïllar-la i purificar-la.
Això seria la manera de sintetitzar oligos.
22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Si volem sintetitzar un gen sintètic quan té sentit fer-ho? Quan el gen no és molt gran i coneixem la seva seqüència sense ambigüitat. Té sentit fer-ho quan volem sintetitzar un gen que codifica per una proteïna d’uns 100 aminoàcids, és a dir, una proteïna que tingui aproximadament 300-360 parells de bases. No podem fer seqüències molt més llargues de 100 bases.
1. Síntesi de una cadena amb la seqüència d’interès (coneguda) de 100 bases i cadena senzilla  purificació 2. Síntesi de la cadena complementària també de 100 bases  purificació 3. Barrejar 1 i 2 i permetre la hibridació. Si ho barrejo, com són complementàries ho fem de tal manera que pugui formar aparellament de bases i deixo un extrem que sobresurti.  purificació 4. He sintetitzat de les 300 bases o parells de bases només 100 parells de bases.
Repetir de l’1 al 3 i obtenir un segon fragment, el qual anomenarem B i deixa als extrems una petita part sense aparellar que ha de ser complementària al fragment A.
23 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 5. Barrejar el fragment A amb el fragment B. La part complementària farà hibridació i pot ser que quedin forats. Necessitem treballar amb DNA polimerasa 1 + 4 dNTP per omplir els forats i després tancar les cadenes amb DNA lligasa. Quan hem fet això, purificar.
6. A partir d’aquí, un cop tenim tot això unit hem de repetir les etapes 1 i 2 i aconseguir un altre fragment complementari del fragment B, el qual serà anomenat fragment C.  purificar 7. Barrejar el fragment A-B (punt 5) amb el fragment C (punt 6). La part complementària farà hibridació i pot ser que quedin forats. Necessitem treballar amb DNA polimerasa 1 + 4 dNTP per omplir els forats i després tancar les cadenes amb DNA lligasa. Quan hem fet això, purificar.
8. Al final de tot, si ho he fet bé aconseguiré poca quantitat d’alguna cosa que serà el meu gen. Com tenim poca quantitat per poder unir-lo al vector afegim encebadors a cantó i cantó de seqüències oposades i el sotmetem a PCR per obtenir grans quantitats i així poder lligar-lo al meu vector.
Té sentit per proteïnes relativament petites, coneixem la seqüència i és aproximadament de 100 aminoàcids. Si sumem etapes el rendiment baixa. Es sumen els rendiments i es va perdent. Una cosa es aconseguir un fragment de 100 i un altre de 600.
Quan el gen és molt més gran no val la pena i es busquen altres alternatives. Això té sentit en un gen relativament petit.
Una altre estratègia es fer PCR-assemblatge  es poden sintetitzar completament genomes bacterians i també sintetitzar un cromosoma sencer de llevat (eucariota inferior).
Un fragment amb 100 bases i un altre fragment complementari en l’altre extrem. Un altre fragment. Així contínuament, permetem la hibridació i per PCR això va creixent.
És una manera però es pot fer molt més econòmic que el mètode anterior. El que passa és que no tot és tan fàcil i tan maco com aquí.
24 ...

Tags:
Comprar Previsualizar