1-Regulación a nivel de estructura (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Biología molecular de la célula
Profesor R.
Año del apunte 2017
Páginas 38
Fecha de subida 18/10/2017
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TEMA 1: REMODELACIÓN DE LA CROMATINA Y SU PAPEL EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN  Introducción a los temas 1-3: En primer lugar debemos preguntarnos, por qué nos interesa la regulación de la expresión génica. Esto es así porque de ese modo podemos responder a por qué hay tipos diferentes de células como las epiteliales, neuronales… todas ellas son células diferenciadas que provienen de la misma célula.
Si partimos de una única célula, el cigoto, que se va desarrollando, ¿cómo es posible que tengamos diferentes tipos celulares? Los diferentes tipos tienen la misma cantidad y secuencia de ADN, pero hay algo que hace que las células diferenciadas se comporten de manera diferente, ¿qué mecanismos lo permiten? Al analizar los distintos tipos celulares encontramos distintos tipos y niveles de ARNm y de proteínas, es decir, tenemos una expresión diferencial. Dentro de la cantidad de genes total, se expresan unos u otros, pudiendo a ves coincidir, pero incluso con diferentes niveles de expresión entre distintos tipos celulares.
La regulación de la expresión génica diferencial es la que permite la diferenciación celular y la diferente respuesta a estímulos y nutrientes.
Cuando estos mecanismos reguladores fallan, dan lugar a patologías graves. Si el fallo se produce en etapas embrionarias, tendremos una teratogenia, en cambio si se da en un individuo desarrollado, da lugar a un cáncer.
 Posibles niveles de regulación: Cuando hablamos de expresión génicas, estamos refiriéndonos a que a partir de la secuencia de un gel obtenemos una determinada cantidad de producto funcional activo, es decir, la cantidad de proteína o ARN funcional que obtenemos de un gen determinado.
La expresión génica es el producto final activo de un gen, pero para llegar al final, es necesario pasar por distintas etapas, estas etapas tienen una regulación.
A nivel transcripcional, pasamos de ADN a ARN (transcrito primario), pero a nivel postranscripcional tenemos un ARNm maduro, del que se puede tener control de su vida media, se puede transcribir a proteína, la cual puede necesitar o no una activación para ser funcional… 1 Nosotros vamos a centrarnos en todos estos mecanismos. En función del gen encontramos unos mecanismos u otros.
El nivel postranscripcional es el que tiene mayor variedad de mecanismos de regulación, pero el grueso de la regulación se da a nivel transcripcional.
Primero se necesita pasar el filtro del nivel transcripcional, no todos los genes tienen el nivel postranscripcional.
A nivel transcripcional, tenemos principalmente dos mecanismos, a nivel de la estructura de la cromatina y a nivel del ensamblaje de la maquinaria de transcripción.
 Expresión génica diferencial: Para analizar la expresión diferencial a nivel final, podemos analizar la expresión de proteínas o ARN en distintos tipos celulares. . Es más práctico con proteínas, pero a veces es más fácil con ARN. Ambas se suelen complementar Esto lo hacemos con una electroforesis bidimensional para proteínas.
La primera separación se hace por punto isoeléctrico, en un gradiente de pH. Luego se coge el isoelectroenfoque, que es fino y se pone en un gel de acrilamida. Ahora hacemos una separación por peso molecular del polipéptido desnaturalizado. Cada punto observado es un polipéptido, pero si la proteína consta de 3 subunidades, se verán 3 puntos diferentes, porque está desnaturalizada. Para la observación, se suele teñir con plata para mayor sensibilidad. A partir de aquí podemos coger una muestra de un péptido (una macha) y con la espectometría de masas podemos identificas de qué proteína se trata.
Podemos observar que hay proteínas comunes en tejidos diferentes, es lo que se llaman las proteínas house keeping. Suelen estar a niveles similares en distintos tipos celulares. También podemos encontrar proteínas específicas que se expresan diferencialmente y otras proteínas que se expresan en distintos tejidos, pero en distintos niveles. Todo esto da información acerca de si un determinado gen está activo o no. También se usa para comparar muestras patológicas con no patológicas.
2 Para el ARN tenemos diferentes técnicas.
Empezamos por la RT/PCR, que es una PCR a tiempo real. El ARNm es copiado a ADNc (complementario) y se incrementa exponencialmente, pero por el agotamiento de determinadas sustancias necesarias para seguir replicando el crecimiento se frena. Por lo tanto nos interesa solo la fase exponencial. La cantidad de ARN en fase exponencial es proporcional a la cantidad que había al inicio.
El procedimiento que se lleva a cabo es el siguiente: Se selecciona el ARN de una proteína como la ovoalbúmina y se toman cantidades conocidas de este. Con cada cantidad, calculo cuántos ciclos son necesarios para tener una cantidad de ARN determinada. Cuanta menos cantidad de ARN inicial, más ciclos necesitaré para llegar a la misma cantidad de amplificación. De este modo obtengo una recta patrón y la represento en log para que sea una recta y no una curva.
Ahora repito el experimento con mi muestra, fijo el mismo umbral y gracias a la recta patrón puedo saber qué cantidad de ARN tenía al comienzo.
Otra técnica es el Microrray, esta consiste en que sobre un soporte, que es una placa de vidrio tratada, a esto se le llama chip de ADN. Se depositan oligonucleótidos de ácido nucleico de genes que yo sé que se expresan en un tejido, como por ejemplo el pulmón.
Cogemos genes de páncreas, epitelio… y los pasamos a ADNc (ADN complementario), que es más estable.
Tejido → ARNm → ADNc (mediante la transcriptasa inversa) Al ADNc, le puedo poner el primer nucleótido marcado fluorescentemente. Así veré fluorescencia en los puntos donde haya complementariedad. Solo tendré señal en los puntos donde estén genes que se expresan en mi tejido (pulmón). La fluorescencia es proporcional a la cantidad.
3 Por último, la secuenciación del ARN o la ARN-seq, es una secuenciación masiva que permite tomar un ADN, fragmentarlo al azar y añadir a esos fragmentos un adaptador químicamente, es decir, añado nucleótidos y ya tengo el adaptador. Tengo la secuencia conocida para ahcer los primers, que me permiten iniciar la polimerización. Cada vez que se añade un oligonucleótido se ve fluorescente.
Esta es una técnica de fragmentos cortes, entre 200 y 300 nucleótidos. Voy ensamblando fragmentos porque puedo hacer encaje de secuencias. Es la etapa más complicada. La cantidad que tengo es proporcional a la cantidad de ARNm.
Puedo ver qué regiones se transcriben, si hay intrones y según el nivel puedo ver a expresión del gen en ese tipo celular.
Tenemos cambios en la expresión génica a corto y largo plazo.
4  Diferenciación celular: Una célula diferenciada, como una célula de cartílago, en determinadas condiciones en un medio de cultivo puede volver a lucir como una célula no diferenciada o fibroblasto. Si este fibroblasto se cultiva en el medio de fibroblasto, continúa siendo un fibroblasto, pero si se cultiva en un medio idóneo para células de cartílago, pasa a ser de nuevo una célula cartilaginosa.
Se pensó que el hecho de que la célula de cartílago volviera a fibroblasto era un proceso de desdiferenciación total, pero esto no es así.
Las células no diferenciadas no tienen silenciados una serie de genes, que sí lo están en células específicas. Parecía que se podía llegar a una célula no diferenciada.
Si hacemos el mismo procedimiento que hemos nombrado antes, pero esta vez con una célula que nunca se haya diferenciado, tanto en el medio del fibroblasto como en el del cartílago, sigue siendo una célula no diferenciada. Es decir, que la célula que ya ha sido diferenciada está comprometida con el estado diferenciado del cartílago y no la podemos convertir en una célula nerviosa, no podemos obtener una célula de otro tejido diferente al cartílago.
Una célula diferenciada tiene ciertas marcas que le permiten tener su patrón de célula diferenciada a pesar de que se divida a largo plazo, aunque cambiemos las condiciones.
Además de esto, se observó que para una misma señal no siempre se obtiene la misma respuesta en el tejido. Si tratamos con estrógeno el oviducto de una gallina o el hígado, tendremos respuestas diferentes, sin embargo ambas células tiene la misma dotación genética, es decir, no hay pérdidas de material genético, sólo está silenciado. En el proceso de diferenciación del oviducto se ha silenciado el gen del vitelo y en el del hígado el gen de la ovoalbúmina. Esto siempre va a pasar en estos tejidos, no es reversible.
Así que tratando ambos tejidos con estrógeno, en el oviducto solo obtendremos ovoalbúmina y en el hígado solo vitelogenina.
Esto es un campo de estudio interesante porque sería ideal tener células desdiferenciadas a partir de una diferenciada, se podrían hacer autotransplantes y no habría problema del rechazo.
5  En casos particulares una célula diferenciada puede dar origen a un adulto: En la naturaleza se puede hacer esta reversión de célula diferenciada a desdiferenciada, por ejemplo, a partir de un tejido concreto de la planta como la raíz, se puede obtener una sección, y de esta obtener células a partir de estas células se puede desarrollar una plántula, que dará lugar a una planta adulta nueva. Con esto se demuestra que el proceso de diferenciación es reversible. La desdiferenciación es posible en la naturaleza, es un mecanismo automático.
En pluricelulares es más complejo, pero aun así se ha conseguido hacer clonaciones, como de una rana. Para ello se aíslan células epiteliales del intestino (células diferenciadas), el núcleo de estas se inyecta en un huevo no fertilizado al que se le ha eliminado su núcleo. Con este procedimiento, en muy pocos casos (2%) se da el desarrollo embrionario y se obtiene una rana adulta. Se vuelve a ver que es un proceso posible.
El oocito sin núcleo es importante porque tiene una serie de factores de transcripción y otros elementos que permiten que el ADN pueda hacer la reversión, queremos descubrir cuáles son.
La oveja Dolly fue el siguiente caso de estos experiemntos.
 Efectores en la regulación de la expresión: Tenemos un conjunto de proteínas reguladoras y ARN, en cada organismo el nombre es diferente, por ello es mejor entender el mecanismo en general. Se descubrió el ARN regulador hace tan solo algunos años y ahora está cobrando mucha fuerza.
  Proteínas reguladoras: proteínas directamente implicadas en el proceso, y/o proteínas diseñadas para interaccionar con las anteriores, y con secuencias de DNA o RNA. Proteínas modificadoras de cromatina, y de interacción con dichas modificaciones.
ARNs reguladores: “small ARNs” (ARNi).
6  El control transcripcional: 3 posibilidades A nivel de control transcripcional tenemos 3 posibilidades, la tercera es combinación de las dos primeras.
a) Haciendo que la cromatina no sea accesible. Aunque llegue señal, como en el oviducto, y el receptor esté activo, al igual que el factor de transcripción, al no ser accesible la cromatina, no se puede iniciar la transcripción.
b) Podemos tener la cromatina en un estado abierto, no existe ninguna restricción àra que la proteínas reguladora se una a su secuencia de reconocimiento. Cuando llega la señal, la proteína que es el factor de transcripción puede unirse y se puede dar la activación de la transcripción, lo que se necesita es que el factor de transcripción se transcriba o que llegue la hormona determinada.
c) Es una combinación de los dos procesos anteriores la cromatina está temporalmente compactada, pero ocasionalmente se descompacta y se puede dar la unión de la proteína transcriptora.
El proceso que hemos llamado c) anteriormente también se da en células diferenciadas.
En procariotas (bacterias) siempre se da el caso b), siempre tiene si genoma abierto. La regulación se da por proteínas activadoras y represoras.
En eucariotas sí que funciona el a), así no se necesitan transcribir represores, porque ya es inaccesible para los transcriptores.
7  Definición de epigenética: La epigenética es el estudio de cambios heredables en la función génica que se producen sin un cambio de la secuencia del ADN.
Todas las modificaciones reversibles de la cromatina y el ADN que afectan a la expresión génica.
Es la regulación a nivel de cromatina, son todas las modificaciones de la cromatina que afectan a la expresión génica y son heredables. Cuando hay diferenciación celular se compactan ciertas regiones del genoma, esto se da para que, por ejemplo, una neurona nunca exprese la insulina porque ese no es su papel, solo tiene activo el pack de genes que le corresponde.
 Repaso sobre la estructura de la cromatina: Llamamos cromatina al conjunto de ADN y proteínas.
El nucleosoma está compuesto por 5 clases de histonas, pero de cada una de ellas tenemos subtipos, excepto de la H4, que es una variante muy conservada. Las otras sí tienen variantes evolutivamente.
Las histonas tienen carga neta positiva porque son ricas en aminoácidos como la Lys o la Arg.
Esto le permite interactuar con el ADN, que es negativo. El primer contacto entre amba estructuras es eléctrico.
El peso molecular de las histonas es relativamente bajo. Se organizan en octámeros, siendo todas parte del núcleo del nucleosoma menos la H1.
Las histonas núcleo tienen en común 3 hélices α, que dan lugar al plegamiento completo, que es un plegamiento tipo histona. Esto permite que polimericen entre ellas.
8 La estructura del nucleosoma se ha obtenido por difracción de rayos X, la H2A y H2B son externas y la H3 y H4 internas. Hay contacto físico entre las histonas y el ADN.
Con este plegamiento del ADN, las secuencias de reconocimiento no van a ser accesibles.
El nucleosoma está formado por 200 pares de bases. 146 están alrededor del núcleo de histonas y las restantes son parte del enlace entre nucleosomas.
Los extremos N-ter de las histonas están orientados hacia el exterior. Estas colas son importantes a la hora de estructurara la cromatina.
En la imagen B) vemos ADN sin histona H1, vemos que está más laxo que en la imagen A). En esta última, con H1, está organizada en zig-zag, que es el que permite el siguiente nivel de estructuración.
Las regiones con H1 no tienen transcripción activa, las zonas que sí se transcriben no tienen H1, que es lo que se conoce como fibra de 10 nm. Esta sería la hebra abierta que hemos vistos anteriormente.
 Estructura de la fibra de 30 nm El siguiente nivel que tenemos es la fibra de 30 nm, a este nivel de condensación no tenemos transcripción. Tenemos lo que se conoce como tetranucleosoma, es decir, 4 nucleosomas que interaccionan 2 a 2. Este es el modelo más aceptado pero no es el único.
9  Efecto de la histona H1 sobre la fibra de 30 nm La H1 lo que hace es cerrar las dos vueltas de ADN alrededor del octámero de histonas, así hace que cambie el camino del ADN entrante y saliente del nucleosoma.
Los N-ter son importantes en la interacción nucleosoma-nucleosoma.
La Lys 16 de la H4 interacciona con el H2A, la H2B con cargas negativas permite su acercamiento.
Tenemos una cinta helicoidal con 2 hileras de nucleosomas por vuelta, de modo que no se permite la transcripción.
 La fibra de 30 nm está estructurada en lazos La fibra de 30 nm puede hacer lazos entre 50.000 y 200.000 pares de bases, es decir, lazos bastante grandes. El lazo interacciona con la matriz nuclear, MAR (región de unión a la matriz), en división se denomina SAR. Esto permite que tengamos dominios de ADN aislados unos de otros.
Si el lazo se descompacta y pasa a 10 nm no tiene por qué afectar al lazo contiguo. Un lazo puede alterar su estructura sin afectar a los lazos contiguos.
10  Compactación hasta el cromosoma metafásico Los siguientes niveles de compactaciones son muy controvertidos, pero está claro que hay más compactación, la heterocromatina, que son regiones densas de cromatina vistas con microscopía electrónica.
Esto sería ADN silenciado, como pasaba con el gen de la vitelogenina en el oviducto. La eucromatina es menos compacta.
La compactaciones no son irreversibles, se puede cambiar de condición, puede pasar de 30 a 10nm , pero el 10% del genoma no se puede descompactar nunca, esta es la heterocromatina.
En división celular tenemos más compactación, como es el cromosoma, que es inactivo a nivel transcripcional, solo pretende ser segregado.
 Evidencias sobre la estructura de la cromatina en las regiones con genes activos En microscopía electrónica vemos que la cromatina que está siendo usada por la ARN polimerasa contiene nucleosomas, por lo tanto, los nucleosomas no estorban a la transcripción. Pero es necesario que el nucleosoma no sea tan estable, la ARN polimerasa tiene que ser capaz de desplazar el nucleosoma de delante para poder seguir.
También se necesitan cambios en la zona promotora para que sea accesible, por ello, a veces es necesario desestabilizar los nucleosomas.
11  La cromatina activa muestra mayor sensibilidad a digestión con DNasa 1 El silenciamiento tiene que ver con la estructura de la cromatina. Los fragmentos de ADN silenciado son los más compactados. La heterocromatina en organismos superiores está reprimida en células diferenciadas e impiden que esos genes estén activos.
La fibra de 10 nm puede ser transcrita, pero a partir de la de 30 nm no. La cromatina activa (o potencialmente) está en forma de fibra de 10 nm.
La DNasa 1 es una endonucleasa que corta al azar, no corta por los extremos de la hebra, sino que corta por dentro. Además estos cortes no dependen de la secuencia como ocurre con las enzimas de restricción.
Conociendo un genoma puedo predecir los puntos de corte de las enzimas de restricción, pero no los de DNasa.
Cogemos 2 tejidos diferentes A y B, con expresión diferencial, es decir, que A tiene algún gen que no se expresa en B y viceversa.
Cogemos la cromatina (DNA + proteínas) y la sometemos a una digestión parcial. No debemos poner ni mucha DNasa (cortaría tanto que me quedo son DNA) ni mucho ADN.
Una vez realizada la digestión, aislamos la proteína del DNA, es decir, purificamos el DNA.
El DNA resultante tendrá un bandeado que no podré comparar, por ello cortamos con una enzima de restricción que me da un mapa de corte que puedo predecir. Sé que mis genes de interés están en un punto concreto.
La DNasa habrá cortado por las zonas accesibles, por lo tanto no tendrá acceso a las zonas de superenrrollamiento, sino que cortará por la zona de collar de perlas (10 nm). Además aprovecho las dianas de restricción con las enzimas de restricción, que me van a cortar igual en el tejido A y B. Las diferencias de corte serán solo por el tratamiento con la DNasa.
Esto se carga en un gel de agarosa. Lo cargamos en pocillos con tiempos crecientes.
Quiero buscar un gen X, que está en la parte descompactada en A y en la compactada en B, y un gen Y que está en la parte compactada en A y descompactada en B.
12 Diseño para ello una sonda marcada fluorescentemente.
Una vez hecho el gel, tengo que transferirlo a una membrana porque el gel es un soporte húmedo y no se puede dar correctamente la hibridación con la sonda. La membrana suele ser de Nilon o de celulosa. En ella ponemos un tampón para controlar las condiciones y pongo las sondas del gen X e Y. Cuando las sondas encuentren su diana se unirán (porque el DNA está previamente desnaturalizado) y veré bandas fluorescente donde estén los genes de interés.
En el tejido A, sabemos que se expresa el gen X y vemos que con el tiempo, o, lo que es lo mismo, con el aumento de digestión de la DNasa se va perdiendo señal. Esto se debe a que por azar la DNasa cortará en la zona donde esté el gen. Por otro lado, el gen Y, que es inactivo en el tejido A, no se ve alterado por el tiempo de digestión ya que está protegido por la estructura de la cromatina. En B pasará exactamente lo mismo pero al revés.
Podemos así llegar a la conclusión de que las zonas con genes activos están descompactadas.
Podríamos preguntarnos ahora, ¿entonces, la descompactación se da solo para la transcripción? La respuesta es no. Los genes que se expresan poco están previamente descompactados en la mayoría de los casos. Esto se puede ver con el mismo experimento. Pero en la transcripción además de estar en estado de 10 nm, los nucleosomas tienen que poder alterarse, moverse… para que la polimerasa pueda anclarse y desplazarse.
 Análisis de la posición de nucleosomas El objetivo del experimento es purificar nucleosomas individualizados para conocer el orden de los mismos. Sabemos que el DNA está íntimamente asociado a los nucleosomas.
Para no perder el nucleosoma, se una formaldehído, que entrecruza los grupos amino de las proteínas con los de las bases nitrogenadas de modo que forma un enlace covalente (por eso es cancerígeno).
Ya tengo la cromatina aislada y ya fijada. Uso la nucleasa micrococal (que es como la DNasa). Esta corta en el DNA enlazante, si se deja mucho tiempo termina degradándolo todo. Tengo, de este modo, el nucleosoma íntimamente unido al DNA.
Para recuperar solo el DNA se hace una técnica de inmunoprecipitación. Se usa un anticuerpo que reconoce una histona, el anticuerpo (que está unido a agarosa o sacarosa, es decir una resina) arrastra al nucleosoma y de este modo se elimina la proteína.
Por último, secuenciamos los fragmentos de DNA que tenemos como resultado y así tenemos las secuencias que están en contacto con el nucleosoma.
13 Existe otro método para llegar a las mismas conclusiones, pero este es más laborioso y específico (solo se ha hecho con S. cerevisiae). Primero se necesita un agente mutante de H4, que cambie la Ser por Cys, para luego hacerla reactiva.
La Cys modificada la hace reaccionar con un compuesto muy reactivo que cuando se somete a tratamiento con peróxido de hidrógeno y cobre, se rompe el DNA. Entonces tenemos las secuencias, el nucleosoma y nos falta el punto donde estaba centrado el nucleosoma.
Recordamos que es un método muy específico, solo se ha hecho en levaduras.
Nos interesa la transición de la fibra de 10 nm que es activa a la de 30 que es inactiva, pero se sabe poco de los mecanismos que lo llevan a cabo.
 Elementos que modulan los cambios en la estructura de la cromatina 1. Complejos de remodelación dependientes de ATP El nucleosoma no es una entidad 100% estable, sino que hay un equilibrio de asociacióndisociación, si bien, este se encuentra desplazado al estado asociado.
Cualquier modificación en las histonas del núcleo puede afectar a este equilibrio, sobre todo si afecta a la carga, porque si recordamos la primera interacción es eléctrica.
También afectan modificaciones en la rotación del DNA, porque cambia la topología y cambia también el equilibrio.
Los complejos de remodelación son complejos proteicos que dependen de ATP, es decir, gastan energía. Estos complejos siempre tienen una unidad ATPasa que se usa para clasificarlos en familias, porque las otras subunidades son variables, se van intercambiando.
Estos complejos remodelan la cromatina cambiando su estructura con el gasto de energía.
Hay 3 mecanismos de actuación:    Modificación de la estructura del nucleosoma: Esto se hace introduciendo un giro que hce que cambie la topología. El DNA no está ya íntimamente unido, y así la proteína reguladora puede unirse o la DNasa 1 puede cortar.
Desplazamiento del nucleosoma.
Eliminación del nucleosoma: Se da en regiones reguladoras para que sea accesible para la transcripción, en zonas donde hay enhancers… su eliminación puede ser temporal o permanente.
14 Las familias más conocidas son: o o o SWI/SNF (BRM y BRG1): El nombre SWI viene de switch. SNF es un tipo de SWI.
ISWI (NURF): Imitating SWI.
Mi-2 (NURD) Algunos complejos de remodelación dependientes de ATP también pueden intercambiar histonas. Lo más frecuente es que intercambie las histonas H2A y H2B, que son las más externas. Pero también pueden intercambiar un octámero completo. Esto permite introducir octámeros o dímeros modificados, es decir, que contengan una variedad de histona que le da una particularidad que no tienen las histonas estándar.
Los complejos de remodelación remodelan la cromatina. Se pensaba que los complejos de remodelación solo actuaban en descompactación, pero también pueden funcionar compactando. Esto depende de la situación celular y las señales que reciba.
Los complejos de remodelación más estudiados son los que se encuentran recuadrados en rojo.
¿Cómo saben los complejos de remodelación a qué zona tienen que ir a descompactar o compactar? Tienen diferentes mecanismos:    Reconocimiento de variantes de histonas: Hay histonas modificadas que señalizan ven aquí y compacta o al contrario.
Reclutamiento por factor de transcripción: Hay una entrada coordinada y cooperativa de señales que ponen en marcha la transcripción.
Estructura del propio DNA: Este proceso ocurre rara vez, pero es cierto que la estructura del DNA puede actuar de reclamo para el complejo de remodelación.
Además tenemos moduladores:     Señal química: Puede tanto activar como desactivar el complejo modulador.
Modificación postraduccional: Es una modificación del propio remodelador, como puede ser la fosforilación.
Intercambio de unidades: Esto puede actuar también en un sentido o en el otro. SWI, por ejemplo, según la composición de subunidades actúa en un sentido o en otro.
También se puede asociar con factores activadores o desactivadores.
15 2. Modificaciones de histonas Las modificaciones de histonas pueden alterar la relación de nucleosomas entre sí.
Las histonas tienen sus N-ter hacia el exterior y estos permiten la interacción entre nucleosomas mediante enlace iónico, que favorece la sucesión de histonas.
Si modificamos la Lys 16 del N-ter y le quitamos la carga, se modifica la interacción entre nucleosomas ya que cambia la afinidad. El cambio de cargas de la histona hace que pierda afinidad por el DNA, por tanto se hace menos estable, estamos desplazando el equilibrio.
Las modificaciones pueden señal de una proteína de reconocimiento que puede reclutar complejos de modificación o transcripción.
 Acetilación de histonas: Está relacionada con la actividad transcripcional. La acetilación se da en Lys y en el N-ter de fuera del octámero. Al obtener la acetil lisina hemos perdido carga y con ellos perdemos interacción eléctrica entre nucleosomas y entre histonas y DNA.
16 Se favorece de este modo la descompactación del material genético. La acetilación está relacionada con zonas de transcripción activas.
Hay proteínas que tienen microdominios para reconocer acetilaciones concretas y solo en esa posición.
En la imagen vemos las posibles acetilaciones en las 4 histonas núcleo.
Las acetilaciones son llevadas a cabo por las HATs, las de tipo B actúan en el citoplasma mientras que las A en el núcleo (estas son las que más nos interesan a nosotros).
Las de tipos A actúan como efectores de modificaciones postraduccionales. Cuando se descubrieron se dijeron que eran proteínas que activaban la transcripción, pero no se sabía cómo.
Las proteínas que desacetilan son las HDACs, que están asociadas a complejos de represión.
 Metilación de histonas También tiene luegar en el N-ter de las histonas. Se da en Lys, pero a diferencia de la acetilación, la metilación también se puede dar en Arg. Si bien es más frecuente en Lys que en Arg.
Podemos tener mono-, dio trimetilaciones, y todas significan cosas diferentes.
Si nos fijamos en la carga, esta se mantiene, así que la metilación no debería afectar a la interacción con el DNA o entre histonas. Entonces, ¿cómo remodela la estructura del DNA respecto cuando no hay metilaciones? Funciona mediante una serie de proteínas de reconocimiento. Tenemos una batería de proteínas de reconocimiento que reconocen las modificaciones. Estas proteínas son muy específicas, actúan solo sobre determindas histonas y sobre Lys concretas de estas histonas. Además son capaces de reconer si se trata de una mono, di- o trimetilación. Es frecuente que tengan un dominio que se llama cromodominio, pero en este caso hay más variedad de dominios de reconocimiento.
Las metilaciones se dan en H3 y H4 (las dos internas), a diferencia de la acetilación que se podía dar en cualquier histona, incluída la 1.
Si nos centramos, por ejemplo, en H3, vemos que se metila la Arg 2, Lys 4, pero que por ejemplo la Arg 8 no se metila. Tener Lys o Arg no implica que sea modificada, solo que las modificaciones que se encuenrtan están en Lys o Arg.
La acetilación siempre significaba descompactación, pero la metilación no necesariamente. El efecto que tenga la metilación es indirecto, depende de la maquinaria que reclute la proteína 17 que la reconoce. Es un maquuinaria diferente según el dominio que sea metilado. Así que puede significar tanto compactación como descompactación.
En H3, tenemos metilaciones (trimetilaciones), por ejemplo en Lys 4, en Lys 26, Lys 36 y Lys 79, estas son claramente activadores de la transcripción, descompactan la cromatina, son marca de eucromatina, es decir, de fibra de 10 nm.
Sin embargo, si la metilación se da en Lys 9, Lys 27, reprimen la transcripción, la cromatina se compacta. Tienen, como vemos consecuencias opuestas a las anteriores, son marca de heterocromatina.
Hay un efecto competitivo entre metilación y acetilación. Cuando hay metilación en la Lys 9 de H3 se excluye la acetilación de la misma. Además hay un efecto cooperativo en el cual si se da la metilación en Lys 9, se promueve una metilación en Lys 14, es decir una cercana. Pero si hay metilación en Lys 9, se inhibe la acetilación de la Lys 14, no solo se inhibe la de Lys 9, sino también la de Lys 14. Tiene sentido porque tienen efectos opuestos.
Por el momento, se ha visto que la metilación de Arg siempre causa descompactación.
Al principio se pensaba que la metilación solo tenía luegar en la diferenciació celular, cuando se crea la heterocromatina, por lo tanto se creía que era un proceso estático. Es cierto que hay genes que siempre están compactados, pero hay otros con transiciones, es decir que las metilaciones son reversibles, como en Lys 9 o Lys 26.
Las enzimas que catalizan la metilación son las histona metiltransferasa (HMTs). Utilizan 5adenosilmetionina como dador de metilos, es un metabolito de la via del folato. Factores SET de mamífero.
Se ha descubierto que también hay desmetilasas. Estas hacen una desmetilación oxidativa. Hay 2 familias que la llevan a cabo, una es la vía del LSD, que produce FADH2 y formaldehído. La otra es la familia de las jumonji (JmjC), que da succinato.
Estas vías usan metabolitos presenten en la célula. De modo que el estado nutricional del individuo afectan a estas vías.
18  La expansión de la metilación a través del complejo policomb y la proteína de heterocromatina HP1 Vamos a ver cómo se propaga la marca de la metilacón. La metilación de Lys9 de H3, es reconocida por HP1 (heterocromatin protein) gracias a su cromodominio. HP1 recluta una histonametiltransferasa, que propagando así la metilación desde Lys 9. La tendencia normal es que la heterocromatina se propague.
Podríamos preguntarnos que quién es la primera proteína ue marca la Lys 9, es el complejo policomb, dx un complejo de modificación de histonas con actividad HMT, que está relacionado con el desarrollo embrionatio.
No se sabe cómo llega a su destino, pero está claro que no se hace por azar. Modifica Lys 9 y Lys 27, desde la Lys 9 se propaga por la HP1.
Si este proceso no se para, toda la cromatina acabaría compactada. Por lo tanto, tiene que haber algo que pare el proceso, este es diferente en cada célula y es llevado a cabo por aisladores que reconocen la secuencia de nucleótidos, es decir, una secuencia unida no covalentemente. Las proteínas que reconocen el aislador hecen que este esté activo.
 Aisladores (insulators) Para que un aislador esté activo, la proteína de reconociemto del aislador tiene que ser producida por la célula. De esta manera un aislador de neurona no estará activo en una célula intestinal, si no el silenciamiento de genes sería mas o menos igual en todas las células y por tanto todas las células erían iguales.
19 El aislador tiene la función de parar la propagación de la cromatina silenciada, heterocromatina o inactiva a nivel transcripcional. Esto permite generar dominios compactados y descompactados.
Los aisladores limitan el efecto de otros elementos reguladores que afectan a un gen.
Los enhancer activan la transcripción. El enhancer A limita su efecto al gen A porque el aislador está activo, si no estuviera activo actuaría sobre el gen B, porque los enhancer son capaces de actuar a distancia. Lo mismo ocurre con B.
En cada tipo celular todos los aisladores no están activos, en un tipo celular determinado, a lo mejor, el enhancer A actua sobre el gen B.
o o o Permiten compartimentar regiones activas y no activas.
Evitan que el efecto de elementos de genes reguladores cercanos actúen más allá del lugar deseado.
Permiten expresión independiente de posición (transgénicos).
 Elementos de control local “locus-Control Region” (LCR) El LCR es un elemento de control que activa la transcripción, pero lo hace manteniendo descompactada la región a la que afecta, es decir es transcripcionalmente activo. Si tenemos un aislador en medio, se limita su efecto, pero como no lo hay no pasa nada.
El cluster de las globinas está bajo control de un LCR, se sabe que este LCR es capaz de activar un gen u otro progresivamente según la diferenciación celular. Primero, en etapas de embrión, activa ε, luego α y en adulto, sobre todo β, pero también δ (que son las hemoglobinas adultas).
Si nos llevamos estos genes a otra célula del mismo tipo celular y hacemos la inserción, según la posición donde se inserte será más o menos activo, incluso inactivo.
Vemos que aunque tenga varias copias del gen tal vez no aumenta la expresión del gen, o que es muy baja. Lo que ocurre es que, dependiendo de la posición del genoma donde se integre la expresión es mayor o menor. Si se inserta en heterocromatina, no se va a expresar, lo mismo si le afecta un sileciador, en cambio si no tiene un elemento de control, su expresión es muy alta.
En cambio, vieron que si se llevaban el LCR junto con el gen que nos interesa siempre funcionaba el aumento de expresión, independientemente de la posición dentro del genoma. Esto se descubrió haciendo transgénicos, sobre todo en plantas.
20 Con el LCR siempre está abierta la cromatina en la zona de influencia de este. Introducen un cambio estructural en la región: cromatina abierta.
El LCR es específico del tejido, es decir, que un LCR que funciona en la piel y lo quiero introducir en una célula pancreática tal vez no funciona porque a lo mejor el páncreas no sintetiza las proteínas que se unen a este.
Es posible que el LCR sea un enhancer, se parecen demasiado, pero el LCR al actuar a distancias más largas se le ha dado otro nombre.
Hay enfermedades causadas por que el LCR no es activo, y las globinas no se expresan, es una enfermedad letal ya que no se puede hacer recambio de hemoglobina.
Las secuenias MAR también pueden ser aisladores, tenemos dominios diferenciados. Un factor de transcripción es cuelquier proteína que afecta a la transcripción, unas se unen al DNA y otras no. Un silenciador sería también un factor de trasncripción.
 Propagación del patrón de metilación durante la replicación Todo esto no serviría de nada si cada vez que se divide la célula pierde su marca. Las células resultantes tienen que ser igual que la madre, no tiene que sufrir todo el proceso de diferenciación de nuevo, tiene que tener la heterocromatina que le toque.
Cuando hay división tenemos heteroduplex y hay un reparto euitativo de las histonas antiguas y de nueva síntesis. Pueden ser octámeros viejos y nuevos, pero la mitad de las H3 van hacia uno y otro lado. Lo único que tiene que pasar de nuevo es que se propague. Por tanto, se replica el DNA y a la vez se replica el patrón de hetrocromatina. Este patrón de heterocromatina es el que establece el tipo celular, se para cuando interesa y se deja abierto el resto.
 Ubiquitinación Es un caso particular, no se añade un grupo, sino que se añade una cadena polipeptídica a la histona. Esto solo ocurre en H2A y H2B (solo en las externas). La ubiquitinación no ocurre en el N-ter, sino en la estructura plegada, en el dominio globular .
En H2A ocurre en Lys 119 y en H2B en Lys 123.
21 La ubiquitina tiene carga neta negativa, pero es ese su efecto, sino que tiene proteínas de reconocimiento que hacen que haya cambios en la estructura de la cromatina.
La poliubiquitinización es para degradación de proteínas, pero si es monoubiquitinización, se altera la función de la proteína.
Efecto de la ubiquitinización de histonas: Lo que ocurre cuando se ubiquitina la H2A, es que se compacta. Cuando decimos que se compacta es que cuando se estudia la encuentran en una zona compactada de heterocromatina.
En cambio si la ubiquitinización se da en H2B, esto causa la descompactación, de modo que se activa la transcripción.
La metilación de la Lys 27 promueve la ubiquitinización de H2A, ambas rutas llevan al mismo destino. Hay un intercambio de información y cooperación, es el cross talk. El complejo policomb también puede ubiquitinizar H2A.
La ubiquitinizacion H2B promueve la metilación de la Lys 4 de H3. Hay una señal cruzada y un refuerzo.
La ubiquitinación de histonas afecta al reclutamiento del factor de elongación de la transcripción: La ubiquitinación de H2A unhibe la transcripción, porque inhibe que se produzca el reclutamiento de FACT. Por otra parte la ubiquitinación de H2B estimula el reclutamiento de FACT, facilitando así la transcripción.
22  Sumoilación o SUMO (small ubiquitin-related modifier) o SUMO proteina de ~10 kD , similar estructura a la ubiquitina. Con < 20% identidad de secuencia.
La SUMO es parecida a la ubiquitina, su mecanismo es parecido. El proceso de adición con ubiquitina ligasa o SUMO ligasa es parecido, pero las consecuencias son diferentes.
La SUMO siempre actúa sobre H2A y H2B, y siemrpe causa la compactación de la cromatina, es decir, reprime la transcripción.
Cuando las histonas son sumoiladas, reclutan histonas desacetilasas que eliminan acetilos y permite la desactivación de la zona.
 Fosforilación de histonas La fosforilación de histonas se da en Ser y Thr del N-ter (normalmente) en cualquiera de las 4 histonas del núcleo del nucleosoma, incluso en la H1.
Al fosforilar tenemos un cambio de cargas, ya que introducimos una carga negativa, esta en una modificación típica en la cromatina descompactada (hay un caso en el que no, pero no entraremos en eso). La carga negativa afecta a la interacción entre nucleosomas y con el DNA, además tenemos proteínas de reconocimiento de una modificación específicas (como hemos visto en casos anteriores, pueden actuar en cualquiera de las modificaciones).
En H3, por ejemplo, la Ser 10 puede ser fosforilada, lo que se ha visto es que si hay fosforilación en la Ser 10, no puede haber metilación en la posición 9, y viceversa, es un proceso bidireccional.
Vemos de nuevo el intercambio de información o cross talk.
Por otro lado, la fosforilación en la Ser 10 favorece la acetilación de la Lys 14 y 9, es decir, se refuerza la marca que va en un sentido. Esto se lleva a cabo por proteínas quinasa específicas para cada histona.
El síndrome de Coffin-Lowry es debido a que la quinasa que fosforila H3S10 , es decir, la Ser 10 de H3, no está activa. Esto causa problemas de desarrollo y retraso mental, al afectar a diversos genes tiene consecuencias generales.
23 El fallo de estos mecanismos tiene consecuencias muy graves ya que pertenecen a la parte alta de la regulación de la extresión.
 Efecto de la fosforilación de histonas Cuando tenemos organismos sometidos a estrés como la levadura, se inhibe la transcripción y traducción, se para todo el programa de la célula, porque lo prioritario es que la célula sobreviva a esa situación.
Si por ejemplo se tiene sometida a estrés térmico, tiene que haber una serie de genes de defensa, como los de respuesta a choque térmico. Estos deben ser transcritos y traducidos, por lo tanto tienen que saltarse el control.
Los genes de respuesta a choque térmico se encuentran fosforilados en esas condiciones y así mantienen la cormatina descompactada, manteniéndose activos. El resto de genes que no son de respuesta a choque térmico están infrafosforilados.
Se han visto casos concretos, como en respuesta a factores de crecimiento, que es el caso de Cmyc y C-fos que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Son prooncogenes ya que cuando se desregulan dan lugar a cáncer.
El factor de crecimiento causa una cadena de fosforilación con quinasas, de este modo se fosforila C-myc y C-fos. En humanos se encuentran fosforilados ante la presencia de factores de crecimiento, debido a la presencia de las quinasas. Así se activa la división celular.
La H1 puede ser fosforilada, cuando esto sucede, contribuye al mecanismo de control impidiendo que HP1 (que se une a la Lys 9 de H3) se una. Contribuye a que la cromatina se mantenga abierta.
24  Resumen del efecto de las modificaciones de histonas La acetilación de lisina se puede dar también en H1, aunque no aparece en la tabla. Se da en el N-ter,  Resumen de las modificaciones en las 4 histonas del núcleo del nucleosoma Además de las modificaciones que hemos visto, podemos añadir la biotinilación, citrulinación, ADP ribosilación, isomerización y glucosilación (H3, H2B). Además de los que tenemos representados tenemos más procesos y se descubrirán más con el tiempo.
Realmente lo que nos interesa extraer de las modificaciones y todos los procesos que hemos visto es encontrar el patrón global.
De modo que según el patrón de modificaciones que tengamos sepamos que significa una cosa u otra (compactada o descompactada). Esto es lo que se conoce como el código histona y son modificaciones postraduccionales.
Tenemos ciertas proteínas capaces de reconocer las modificaciones y traducirlas en expresión. La HP1, por ejemplo, solo reconoce la metilación de H3, la 14.3.3 solo la fosforilación de la Ser 10 en H4. Y estas atraen a ciertas proteínas que interaccionan entre sí.
25  Dominios proteicos implicados en la unión a histonas modificadas Se conocen cada vez más proteínas que actúan como lectoras de modificación.
Se ve que en general cuando hablamos de acetilación tenemos bromodominios (es un dominio con un plegamiento determinado que permite interacciones específcas).
En reconocimiento de metilación encontramos proteínas con cromodominios. El dominio Tudor también reconoce la metilación al igual que el dominio MBT (malignan brain tumor). Todos ellos están en la parte alta de la cascada, así que su desregulación tiene graves consecuencias. A estos tres dominios proteicos se les conoce como la familia real.
Hay dominios menos importantes, más promiscuos, que reconocen acetilaciones, metilaciones… como por ejemplo el PhD finger y el 14-3-3.
La célula siempre aprovecha lo que tiene y le da una función nueva para que se haga lo que nos interesa.
26  Comunicación cruzada de las distintas codificaciones y código histona Tenemos un patrón de modificaciones reconocidas por proteínas específicas sobre las cuales interaccionan proteínas que causan una respuesta como reclutar complejos de remodelación. Hay proteínas que reconocen un patrón concreto de modificaciones cercanas, y reclutan así factores de remodelación.
Si es HP1 la que recluta, será para compactación, pero si recluta una proteína de reconocimiento de acetilos, lo hará el complejo será descompactar.
Si tenemos una ubiquitinación de Lys123, s refuerza con la metilación de Lys79 y Lys4, son descompactantes.
La metilación de la Lys9, inhibe la fosforilación de la Ser10 y a la inversa.
o o Mecanismos de modificación: excluyentes, dependientes, y de cooperación en captación de proteínas reguladoras.
Las proteínas reguladoras son reclutadas por reconocimiento del patrón de modificaciones→ Código histona.
3. Variantes de histona Además de las 4 histonas núcleo estándares, existen otras variantes de todas las histonas menos la H4. La H4 es la más conservada evolutivamente, es la que ha sufrido menos mutaciones, por tanto no se conocen variantes.
Existen más variantes que las que veremos, pero es para hacernos una idea.
27  Variantes de la H2A Conocemos la H2AX, H2AZ y macroH2A, cuando las alineamos vemos que la variabilidad está en el C-ter.
o H2AX: Vemos que tiene una extensión en C-ter, aquí encontramos varias Ser fosforilables. Está implicada en reparaciones de DNA, como rotura de la doble hebra.
Cuando se produce la rotura de la doble hebra, los complejos de remodelación hacen que se sustituyan dímero de histonas por otros con H2AX.
H2AX actúa reclutando la maquinaria de reparación del DNA. La fosofrilación de la cola de Ser es fundamental para reclutar los factores de reparación.
o H2AZ: Esta es más controvertida. Está implicada en la expresión génica. Cuando la vamos a localizar está en regiones transcritas activamente, está implicada en descompactación de la cromatina. Se encuentra con la H3.3. Como las dos se suelen encontrar en regiones activamente transcritas se induce que tal vez permiten la descompactación de la cromatina.
H2AZ y H3.3 se relacionan con una mayor inestabilidad del nucleosoma. Si reconstruimos in vitro un octámero de histonas, el constituido por las estándar tiene una estabilidad X, pero al sustituir la H3 por H3.3 tiene menor estabilidad, y al sustituir H2A por H2AZ, todavía menor. Al ser menos estable es más fácil de movilizar y es más fácil transcribir.
o macroH2A: Es una variante de la H2A que se encuentra en el cromosoma X inactivo, el corpúsculo de Bahr. Esta es una cromatina más condensada de lo normal. La inactivación del cromosoma X es al azar en cada célula. Se sabe que el que es inactivado sufre un recambio proteico de la H2A por la macroH2A, esto genera una cromatina más densa.
Lo que se pretende es que el cromosoma quede inactiva, así que no debe expresarse nada de él, por eso está tan compacto.
28  Variantes de la H3 Se conoce la H3.3 y la CENP-A.
o H3.3: como hemos visto antes, está asociada con la H2AZ en la expresión génica, ya que mantiene la cromatina activa transcripcionalmente.
o CENP-A: Se encuentra en el centrómero, es un poco más larga que H3 y genera un nucleosoma con sentido de giro inverso, por tanto se cree que genera regiones más compactas.
4. Metilación del DNA En procariotas, la metilación se da en adenosinas, mientras que en eucariotas superiores de da en citosinas. El carbono 5 de la citosina es el punto de metilación. Obtenemos así la 5-metilcitosina. Entre el 2 y 7% de las citosinas están metiladas, de las cuales el 90% están en dinucleótidos de citosina guanina.
El DNA Z se da cuando tenemos una alternancia entre purina pirimidina, con altas concentraciones de sal y cuando hay metilaciones en la citosina. Esta conformación del DNA se relaciona con DNA no activo transcripcionalmente. La metilación del DNA es represora de la transcripción.
La metilación en procariotas y eucariotas tiene que ver con la reparación del DNA.
En los primeros estudios se buscaban enzimas de restricción que cortaran por CG, y otra enzima que corte por CG pero que no lo haga cuando la C está metilada.
La enzima Msp1 no es inhibida por metilación, pero Hpa2 sí.
Se toma DNA aislado de una especie y se somete a digestión con cada una de las enzimas, posteriormente se analiza el patrón obtenido.
En función de si la secuencia central está metilada o no, el patrón cambia.
Si no está metilada las dos enzimas nos van a dar el mismo patrón de digestión, pero si está metilada, Hpa2 es inhibida y por lo tanto en vez de dar dos bandas cortas nos va a dar una larga, de mayor peso molecular. De este modo podemos ver dónde están las metilaciones.
Esto se puede hacer para genes concretos pero no para gran escala.
29  Método utilizado a gran escala para determinar el patrón de metilación Hoy día se sabe que la citosina puede estar metilada o no.
En condiciones de tratamiento con bisulfito (siempre en concentraciones bajas), sufre una desaminación, que la convierte en uracilo.
Aislamos el DNA, y secuenciamos el DNA sin tratar y el tratado con bisulfito. En el que está sometido al tratamiento, veré timina en vez de citosinas metiladas. Al comparar las dos secuencias solo se mantendrán las citosinas que no están metiladas. Así podemos tener el patrón de metilaciones de un hígado con cáncer y compararlo con uno sano.
De momento esto no sirve para hacer la cura, pero si para el diagnóstico. Los cánceres más agresivos dan un patrón concreto, los menos otro. Así se puede determinar qué clase de quimioterapia administrar al paciente.
La metilación del DNA se asocia con la inactivación de genes: metilados en tejidos donde no están activos e inframetilados donde están activos.
Ejm. Tyrosina amino transferasa está inframetilada en hígado respecto a otros tejidos. Esto se da así porque solo se expresa en hígado. Vemos que otra vez es un mecanismo de control diferencial para tejidos o células en situaciones diferentes.
 El DNA desmetilado se muestra más sensible al tratamiento con DNasa1 La metilación es un sistema de regulación habitual en la expresión génica. Tenemos regiones silenciadas en todos los tejidos, pero otras no.
Un gen metilado es más sensible al tratamiento con DNasa1, a más tiempo o más cantidas no se degrada la banda, pero si no está metilado es más sensible.
Que el DNA metilado sea más resistente a la digestión con DNasa1, indica que la cromatina con DNA metilado es más compacta.
30  La metilación del DNA también se propaga durante las divisiones celulares Tenemos DNA metilasas específicas que se encargan de mantener el patrón de metilación.
a) Metilación de novo: Es llevada a cabo por la Dnmt 3a o Dnmt 3b.
b) Mantenimiento de la metilación: Se lleva a cabo por la DNmt 1.
En replicación, pasa la DNA polimerasa y tenemos una hebra de nueva síntesis donde no tenemos metilaciones, tenemos el DNA hemimetilado. La Dnmt 1 metila la otra hebra, que lo hace ya completamente metilado.
Las metilaciones participan en la corrección de errores en la replicación. Un mecanismo de corrección es el Missmatch repair: Cuando acaba de pasar la nucleasa y hay un error de nucleótidos que no se aparean correctamente, tenemos un desapareamiento, y en un futuro una mutación. Tenemos un sistema que detecta la hemimetilación, de este modo sabe cuál es la hebra parental y, por tanto, dónde tiene que hacer la corrección.
La modificación de la heterocromatina se hereda de célula a célula, se heredan por jemplo las marcas de metilación en la Lys 9. Lo mismo pasa con el DNA, la célula hija hereda el patrón de metilación en la célula madre.
 Metilación del DNA     Hay transferencia del patrón durante la mitosis (mantenimiento de la metilación). DNMT1.
También hay metilación de novo afectada por factores ambientales y nutricionales, a través de otras metiltranferasas (DNMT3A y B).
Todas las metiltransferesas implicadas dependen de SAM (Sdenosil-metionina).
El patrón de metilación cambia frente a condiciones ambientales, el stress y la edad (hipometilacion global con la edad y en Cáncer, pero hipermetilacion en algunas regiones concretas).
Por esta razón, dos gemelos que tienen igual material genético, y son separados se diferencian, porque el entorno causa cambios en la expresión génica.
31  La metilación del DNA ejerce su efecto en la cromatina mediante las alteraciones en la modificación de histonas Vemos que la modificación postraduccional de histonas y DNA están relacionados. Se refuerzan una a la otra.
La metilación en CG es reconocida por la MeCP2 (matilation citosin protein), que recluta histonas metiltransferasas que metilan las histonas, por ejemplo la Lys 9 y causan compactación.
La metilación del DNA recluta a MeCP2 que a su vez permite que las histonas sean desacetiladas.
La disfunción de MeCP2 está relacionada con el síndrome de Rett. Este síndrome se manifiesta a los 2 años de vida y da una regresión en el desarrollo neuronal, pérdida del habla… Ratón defectivo en MBD1 presenta defectos en el sistema nervioso.
 Las modificaciones y variantes de las histonas además afectan al estado de metilación del DNA    Se ha descrito que HP1 es capaz de reclutar DNA metiltransferasas.
El complejo policomb también interacciona con DNA metiltransferasas.
H2A.Z inhibe la metilación del DNA Hp1, también recluta las 3 proteínas metilasas de DNA que hemos visto.
Cuando HP1 se una Lys 9 (que replica el patrón metilación), también replica patrón de DNA, puede reclutar las 3.
El complejo policomb también puede introducir metilaciones en el DNA.
Normalmente vemos proteínas que se unen al DNA, como la policomb o bien proteínas que reconocen histonas modificadas, pero hay modificadores que son RNA, a nivel de cromatina actúan poco pero hay algunos casos en los que se da esta regulación. Normalmente actúan mas a nivel de regulación postranscripcional.
32  Resumen del restablecimiento del patrón de la cromatina durante la replicación La replicación del DNA está acoplada a la replicación de la estructura de cromatina, el establecimiento de las zonas de cromatina es un poco posterior a la replicación, pero también tiene lugar en el replisoma. Una vez que se sintetiza la hebra complementaria, los dímeros de histonas antiguos se disocian y se asocian aleatoriamente en las hebras de nueva síntesis.
Las histonas de nueva síntesis se diferencian de las antiguas porque tienen una acetilación específica, ya que vienen del citoplasma. Esta acetilación es borrada posteriormente. Esto sirve para para saber cuál es la H3, por ejemplo, nueva y cuál la antigua, de modo que se respete la marca parental.
En el proceso interviene el complejo MCM, donde se cree que los dímeros quedan transitoriamente asociados para dárselos a las hebras nuevas.
Participan también una serie de chaperonas de histonas (ASF) que impiden la agregación de las histonas de manera aleatoria.
También se encuentra el complejo CAF, que es un complejo de ensamblaje de la cromatina.
 El RNAi puede inducir cambios en la estructura de la cromatina La inhibición de la expresión mediada por RNAi actúa predominantemente a nivel postranscripcional pero en algunos casos concretos puede actuar a nivel de compactación de la estructura de la cromatina.
De los moduladores proteicos se sabe mucho más, porque los moduladores de RNA son mucho más recientes, aunque llevan estudiándose algunos años, pero tenemos menos información.
Estos RNA moduladores se conocen de manera global como RNAi (de interferencia), porque interfieren en la expresión de un conjunto de genes.
Tenemos dos grupos de RNAi:  smRNA (small non coding RNA): Tiene una longitud más bien corta, de unos 20-30 pb, pero puede llegar hasta 60-70. Generan un RNA de doble cadena que es cortado en pequeñas porciones de 20-30 nucleótidos que se colocan en una hebra de RNA y reprimen postraduccionalmente la expresión génica, que es lo más habitual. Se unen a una región complementaria 100% o parcialmente complementaria, con un complejo de proteínas, que es el complejo RISC (RNA induced silented complex), que contiene proteínas de la familia argonauta.
Con menos frecuencia se ha visto que se pueden unir a DNA, reprimiendo así a nivel trnacripcional, en el núcleo. Cuando se une al DNA, lo hace con el complejo proteico 33  RITS (RNA induced transcription silented), en este complejo proteico también participan proteínas de la familia argonauta.
Dentro de este tipo de ARN tenemos los subtipos: - miRNA - siRNA lncRNA (long non coding RNA): Tiene una secuencia más larga, de más de 200 pb.
También interaccionan con el DNA en el núcleo a nivel transcripcional. Recluta el complejo policomb, ubiquitina, metila histina… En ambos casos, es muy poca la regulación transcripcional, son casos muy puntuales, pero sería falso decir que sólo actúan a nivel postranscripcional.
 Mecanismo mediante el que el RNAi induce la compactación de la cromatina El RNAi se une a su diana, la cadena a la que es complementario y son capaces de reclutar a HP1 (todo esto se hace gracias a un complejo proteico, RITS).
HP1 es capaz de reclutar metilasas de DNA y de histonas, de modo que se compacta la cromatina en esa región.
Todos los moduladores efectores sufren modificación en el desarrollo embrionario.
34  Epigenética La epigenética también está conectada con factores ambientales durante toda la vida del individuo que afecta a la expresión de determinados genes e inducen cambios fenotípicos La epigenética es el patrón de genes silenciados durante el desarrollo, pero según el estilo de vida y el lugar donde vivamos vamos a tener una serie de modificaciones epigenéticas a nivel de cromatina.
En el cuadro vemos los factores ambientales que causan cambios a nivel de cromatina y en verde las consecuencias de esos cambios, entre ellos tenemos problemas mentales, longevidad…  Otras situaciones especiales donde la cromatina es regulada  Uno de los dos cromosomas XX es inactivado En nuestra especie, uno de los cromosomas X es inactivo y forma lo que se conoce como corpúsculo o cuerpo de Bahr. Esta es una manera de compensación de dosis para evitar sobredosis génica, en nuestro caso se da en las hembras. En otras especies lo que hacen es aumentar la dosis génica en el sexo que tiene solo una X.
El cromosoma inactivo está almamente compactado y no tiene lugar la transcripción. Si comparamos el cromosoma activo con el inactivo observamos que en este último hay más metilaciones, como las de Lys 9 y Lys 27, ubiquitinación de la histona H2A y macro H2A, es decir, tenemos un patrón típico de heterocromatina. Esto quiere decir que estas marcas predominan, pero no que estén presentes en todas las histonas, sino que lo hacen con una mayor frecuencia de lo que es habitual.
En el activo no predominan estas marcas, las hay pero son menos frecuentes, no todos los genes del cromosoma X activo se expresan a la vez.
En estos cromosomas encontramos un centro de inactivación (XIC), este contiene un gen que se llama gen XIST. Cuando el centro no está presente no hay inactivación del cromosoma, y cuando entramos en detalle, vemos que el gen clave es el XIST.
35 Lo que ocurre es que en el cromosoma inactivo el gen XIST está activo, y al contrario, en el cromosoma activo el XIST está inactivo. Es decir, para que el cromosoma se inactive tiene que estar activo el gen.
Se ha visto que cuando se inactiva por mutación el gen XIST en ratón, lo que ocurre es que el cromosoma donde está inactivo nunca se condensa, se inactiva siempre el cromosoma que está sin mutar. En caso de que no tengamos mutación esto se hace al azar.
De este gen XIST se transcribe el RNA pero no se produce una proteína, es un RNA regulador porque no da porteínas. Se sabe que de este RNA se hacen varias copias, se hibrida a banda y banda y recubre varias dianas del cromosoma que va a ser inactivado. A esto se le une la policomb que recluta proteínas para hacer la ubiquitinación de H2A, se activa la maquinaria para pasar a heterocromatina y se compacta el cromosoma. Es parecido al lncRNA, interacciona con el DNA y lo compacta.
Se ha visto que es esencial que haya transcripción en el cromosoma activo, no del gen, sino de una secuencia de la hebra complementaria que incluye la secuencia complementaria de nuestro gen XIST. Esto se da a partir de otro promotor más alejado. Como se da en sentido inverso es un transcrito parcialmente complementario al gen XIST. Esta secuecnia complementaria se llama gen TSXI.
36  La impronta genética También se la llama imprinting genómico.
o o o o Una de las 2 copias de un gen concreto es expresada de forma diferencial según el origen parental del cromosoma (según si viene del padre o de la madre).
Puede estar mediada por un patrón de metilación del DNA, o interacción DNA-proteína, diferencial según si el cromosoma es de origen paterno o materno.
Se establece durante la gametogénesis.
En mamífero aprox. 80 genes identificados sometidos a impronta de los 29.000, es un porcentaje bastante bajo.
Desde hace ya tiempo se ha venido observando que algunas enfermedades se padecen o no según se hereden del padre o de la madre, pero ¿por qué pasa esto? Esto ocurre porque hay genes que son expresados diferencialmente según si son de origen paterno o materno.
Se sabe que en los gametos, en gametogénesis, se hace un borrado del patrón de metilación (no es la única manera, hay más, pero nos centraremos en esta) y se vuelve a metilar. La mayor parte de las veces las metilaciones coinciden con las originales, pero hay veces que se hace de manera diferencial en función de si es un gameto masculino o femenino.
Ejemplo: Tenemos el gen H19 que nos da un ARN funcional y el Igf2 (insulin growing factor). La copia del Igf2 se expresa la paterna no la materna y del gen H19 expresamos la copia materna y no la parterna.
Esto es debido a una metilación diferencial, en el gen H19 se metila el paterno pero no el materno, que al no ser metilado es funcional, justo al revés pasa con el Igf2.
Igf2 no se expresa de la copia materna, pero sí de la paterna. Cuando tenemos un patrón de metilación, el imprinting no tiene que estar en un gen concreto, puede ser que se de en una secuencia reguladora y que de rebote afecte al gen, como Igf2. No siempre tiene que ser directo.
La región de H19 está metilada en el cromosoma paterno. En esta zona tenemos un centro ICR, que es un aislador, en la copia materna este aislador está metilado porque está en una región que se metila, de modo que la proteína aisladora no se puede unir y por lo tanto no está activo el silenciador La proteína aisladora, sí se puede unir en el cromosoma materno, porque esa zona no es metilada y por tanto ICR es accesible, de modo que en el cromosoma materno se silencia Igf2 pero no H19.
37  Inmunoprecipitación de cromatina en el mapeo de modificaciones epigenéticas Es uno de los métodos usados para estudiar las modificaciones.
Esta técnica consiste en obtener anticuerpos, aislar la cromatina (para lo cual tenemos que romper el núcleo celular con una serie de tratamientos) e incubar la cromatina con el anticuerpo.
En el primer caso vemos que es un anticuerpo para detectar una variante de histona, como podría ser la H3.3, pero también podemos detectar las metilaciones del DNA o incluso modificaciones de histona, como la metilación.
El anticuerpo suele estar unido a otra molécula que me permita sedimentarlo al hacer la centrifugación o alguna molécula magnética para poder arrastrarla en un campo magnético.
Cuando hacemos la inmunoprecipitación, después de haber fragmentado la cromatina, se analiza qué hemos arrastrado con el anticuerpo.
Esto se puede hacer para un gen concreto, por ejemplo para comparar las histonas H3.3 que hay en un gen mutado respecto a uno normal.
Pero también podemos hacer una secuenciación masiva, así veo todo el DNA arrastrado que tiene la variante H3.3.
Chip in chip (chromatine inmunoprecipation), es inmunoprecipitación que luego es hibridado en un microray.
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