TEMA 1 - CULTIUS CEL·LULARS (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Ampliació Biologia Cel·lular
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 21/11/2014
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

Èlia Riubugent Camps TEMA 1 ABC CULTIU CEL·LULARS 1.Introducció Un dels èxits més valuosos han sigut els cultius de teixits i es fan servir en recerca. Perquè son tan importants? -Es poden obtenir en grans quantitats, es poden subcultivar.
-Gairebé tots els cultius tenen un sol tipus de cèl·lula, es pot estudiar un tipus de cell determinat i no un teixit que en conté una barreja de varis.
-Les cell es poden diferenciar en cultiu. Ex. preosteoblast osteoblast -Responen a tractaments amb fàrmacs, hormones, GF, i altres.
Els cultius ens permeten estudiar moltes activitats cel·lulars. (Activitat intracel·lular, fluxos intracel·lulars, el medi on es dóna la interacció, etc.) 2. Avantatges i limitacions Avantatges • Investigador⟶Control ambient cel·lular -Factors fisicoquímics: es poden modificar segons necessitat pH, osmolaritat, temperatura...
-Factors microambientals: Com interaccions cèl·lules/matriu.
-Factors fisiològics: com ara la nutrició de les cèl·lules.
• Preservació - N2 líquid • Estalvi econòmic -↑ barat. Permet la automatització i es necessiten ↓[reactius] • Consideracions ètiques: ↓Experimentació amb animals Limitacions • ↑Sensibilitat a la contaminació -Es necessita personal qualificat i instal·lacions adients.
• Cost i producció -Equipament car -Consumibles (↑↑car): hi ha elements que s'han d'anar comprant⟶Medi, sèrum i més material d'un sol ús.
• Inestabilitat genòmica i fenotípica -Variabilitat, desdiferenciació. Amb els mesos les cells es desdiferencien i comencen a variar d'un cultiu a un altre.
• Diferències respecte a les condicions in vivo -Pèrdua estructura 3D -Pèrdua interaccions cel·lulars i amb la matriu -Pèrdua dels sistemes de regulació de l'organisme [es perd la totalitat de l'organisme, per tant, hem de ser conscients de que encara que es facin proves in vitro els resultats poden no ser els mateixos en humans.] 3. Tipus cel·lulars 3.1. Cultiu d'òrgans.
-S'intenta mantenir l'estructura 3D⟶2 plaques a la més gran hi ha H2O destil·lada estèril i el medi de cultiu (vermell) hi posem una reixeta en contacte amb el límit vermell i l'aire per crear una interfase gaslíquid⟶ Manteniment de la estructura histològica. Difícil obtenció.
-Fragment d'òrgan (en cas de fetus es pot agafar tot l'òrgan sencer).
3.2. Cultiu primari • Cells procedents d'un òrgan o teixit o fetus.
• Obtenció⟶Biòpsia. Per explant o dissociació -Explant: esmicolem un d'òrgan amb el bisturí i obtenim fragments visibles. Es cobreix d'un líquid i s'espera que alguna de les cells sigui Èlia Riubugent Camps ABC capaç de migrar de l'explant i un cop a fora es començ a dividir.
-Dissociació: Fragments obtinguts de l'explant es barregen amb enzims proteolítics que trenquen les unions cell-cell i cell-matriu ⟶ dissociació de les cells. També se'ls hi aplica un tractament mecànic.
• Característiques -Selecció cel·lular. (tenim una barreja de cell i n'hem de fer una selecció) _Supervivents⟶Capacitat migratòria o supervivència davant enzims proteolítics. Tenen la capacitat d'adaptar-se al nou medi (cultiu).
-Diferents tipus de cèl·lules _No supervivència: no migren/resisteixen davant enzims⟶mort. Les apartem quan es canvia el medi.
_Supervivència sense proliferació. No generen descendència, són una minoria molt petita dins del cultiu i quan moren ja no en tindrem més.
_↑proliferació -Final cultiu primari _↑proliferació ⟶Augment confluència fins arribar a monocapa cell. Si no es fa res amb el cultiu entrarà en senescència(=envelliment) i mort. Solució⟶Subcultiu. Cultiu primari⟶línia cel·lular.
3.3. Cultiu secundari • Cultiu que deriva de cultiu primari o línia cell • Obtenció per subcultiu: Dividim el flascó inicial en x depenent de la velocitat de proliferació de la cell. (agafem les cells en suspensió).
1. Eliminació del medi de cultiu amb un rentat en una solució salina. No hi podem posar H2O⟶hipotònic, xoc osmòtic.
2. Adició enzim proteolític (tripsina) a Tº ambient perquè és un cultiu histològic.
-Trencament unions -cell-cell i cell-substrat 3. Neutralització enzims -Addició medi amb sèrum (porta inhibidors de proteases. ex. tripsina, que atura l'efecte d'aquesta i permet el creixement del cultiu. Si no s'inhibís la tripsina aquesta degradaria proteïnes)⟶cell en suspensió.
4.Dilució i repartiment cèll amb dilució 1:4, 1:10...
el que sigui • Fases del cultiu secundari -Lag, no hi ha ↑cell ja que no totes superen el tractament enzimàtic. Les que el superen comencen a duplicar-se i el creixement augmenta de manera exponencial.
-Log(=fase de creixement exponencial) -Plateau, és un estadi de confluència es pot donar per inhibició per contacte, s'impedeix que les cell es divideixin. S'ha de subcultivar abans d'entrar a aquesta etapa.
Cada cop que es realitza un subcultiu les cèl·lules comencen una nova fase, doncs cada cop han de superar l’efecte de l’enzim proteolític.
Èlia Riubugent Camps ABC 4. Línies cel·lulars Es parteix de la biòpsia, se'n moren unes quantes i llavors les supervivents comencen a proliferar fins que al final hem d'acabar subcultivant obtenint cultiu secundari. El cultiu en aquest és sempre Lag⟶Log⟶Plateau. Al final s'escurcen els telòmers i el cultiu entra en senescència i acaba morint⟶Cultiu finit. Generen de 50 a 100 subcultius.
-Línies cel·lulars contínues: provenen de cultius de teixits normals o tumorals que es poden subcultivar ∞⟶immortals. Perden la inhibició per contacte però pateixen una transformació.
Són heteroploides (=diferent número de cromosomes a cada cell). Tenen ↑taxa mutació espontània i no s'eliminen les cèl·lules amb mutacions, de manera que això ens dóna inestabilitat genètica.
Transformació _Espontània, ↓↓en humans, ↓en ratolins _Induïda per agents químics o virus (ex. SV40, HPV, EBV) Desdiferenciació cel·lular, és la pèrdua de les propietats i especificació de la cèl·lula ja sigui per falta d'inductors necessaris com els senyals de les hormones o la interacció de la matriu que l'estimulin.
...