Tema 1: Operaciones básicas en DNA recombinante 3/3 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 7
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 1 OPERACIONES BÁSICAS EN DNA RECOMBINANTE TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología De toda la molécula entera tenemos una banda continua, pero si solo analizamos una zona obtendríamos 4 bandas o las que sea que haya.
Limitamos a una zona muy pequeña de análisis con enzima de restricción para que el número de fragmentos que dé sea analizable, así habrá pocas bandas en el gel.
Lo que haremos es purificar el DNA, lo cortamos con enzimas (EcoRI) y hacemos una electroforesis de acrilamida normal.
Para detectar solo los de la zona de interés lo transferimos a una membrana y lo hibridamos con una sonda de DNA.
A continuación ordenaremos y ajustaremos las bandas sobre un esquema lineal que ajustaremos a la longitud de 7Kb. Es decir, lo que haremos será asignar las dianas de restricción sobre un fragmento de DNA.
En el northem no se hace un mapa de restricción, analizamos los RNAs y entonces separamos los RNAs por medida utilizando un gel desnaturalizante de agarosa. Detectamos un RNA concreto de este microorganismo o línea eucariota.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología En el Southern cortamos con enzimas de restricción para detectar la zona de interés y para la detección de los híbridos hacemos un mapa de restricción. Sin embargo, para el Northern en vez de utilizar enzimas de restricción se resuelve directamente por longitud (medida) y, por tanto, no hacemos mapa de restricción en la detección de los híbridos. La electroforesis desnaturalizante (con gel de agarosa) separa por medida y se ven 2 bandas intensas que corresponden al rRNA (la mayoría) y un fondo que es mRNA.
Sobre la sonda usada: Se puede explotar los resultados del gen que nos interesa con una sonda que corresponda total o parcialmente a la zona de interés, hará falta que clonemos previamente toda o parcialmente la secuencia de interés.
No hace falta que sea de la misma especie, se puede hacer la sonda con el equivalente de ratón, lo único que hace falta es que tenga una identidad con el DNA superior al 70%.
- Identidad: proporción de pares de bases que se conservan en el genoma de cierto gen.
Si hay poca identidad hace falta trabajar con alta concentración de Nacl.
Homología: término categórico, relacionado con evolución. Significa si tienen acestro común, entonces o son homólogos o no lo son, pero puede haber identidad en un cierto porcentaje Sobre el blot/membrana: Por tanto, si estudiamos la hidrofolato reductasa humana se puede hacer una sonda con la zona correspondiente a la de un ratón. Si tenemos sonda, puede haber cambios en el patrón de restricción segundo organismos de la misma especie.
Una vez hecha la electroforesis se pone en solución diluida de NaOH, penetra en el gel y sube el pH. Entonces, se desnaaturalizan los pares de bases de los fragmentos de la electroforesis, pero no cambia su posición en el gel.
Las dos cadenas se separan, harían falta horas y días para que se difundieran las bandas en el gel al ser 3D, entonces la sonda no podría actuar sobre el gel. Hará fala transferir el contenido del gel de agarosa sobre una membrana de nitrocelulosa (para DNA), nylon (para DNA) o de poliviniliden (PDVF, para proteínas) y un poco de peso para mantener el gel sobre el soporte poroso.
Los ácidos nucleicos pasan a la membrana por capilaridad con el agua. Como en las membranas de papel hay poca agua los absorben, arrastra el contenido del gel y se queda en la membrana.
Para ello, hay una solución de tampón buffer, el cual convierte el gel en una lámina muy fina y así se absorbe mejor. La posición relativa de las bandas se mantiene igualmente que la del gel.
Se hace un negativo del DNA que había en el gel puesto sobre el nylon, así tenemos DNA inmovilizado sobre una superficie en la cual puede actuar ya la sonda.
Se pone la membrana en una bolsa de plástico donde tiramos la sonda marcada radioactivamente en exceso. Así, la mayoría de complejos que se forman serán híbridos sonda marcada y DNA de interés (sino el DNA de interés se reasociaría). Como la sonda tiene 70% de identidad sobre la zona de interés puede complementar y tendremos un híbrido.
Entonces lo lavamos un poco y lo dejamos secar.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Habrá dos zonas del filtro donde había los híbridos marcados radioactivamente, entonces, sabremos qué bandas son las de interés.
Por último, hacemos una autorradiografía (rayos X) para detectar la hibridación. Se formarán híbridos de hasta 200 bases estables.
Para RNA se hace más fácil. Al ser más pequeño, se hace lo mismo pero resolvemos por medida y no se corta con enzimas de restricción. Si el DNA de interés no tiene dianas de restricción de EcoRI, sino los lados y otro gen tmb, veremos dos bandas. Si se hace para diferentes tejidos se mira si el gen es expresado o no.
PREPARACIÓN DE SONDAS MARCADAS.
Hay 4 formas: 1. Nick translation: obsoleto ya que daba sonda con baja actividad específica.
Tratamiento del DNA con una pequeña cantidad de DNAsa, que produce un nick. La DNA polimerasa se coloca sobre los nicks y se translada a lo largo de la cadena, pero por delante va colocando nuevos nucleótidos marcados. Así el DNA estará marcado radioactivamente. Es un método ineficiente.
2. Random Primed: a punto de estar obsoleto. Cogemos un fragmento, lo desnaturalizamos e hibridamos con una secuencia al azar de oligonucleótidos de hasta 6 o 8 nucleótidos. Se pone un oligonucleótido cada 300 o 400 bases. Por último, se hace la síntesis de la secuencia de DNA que hay entre dos oligonucleótidos adyacentes.
Desnaturalizamos el DNA correspondiente a la sonda y hibridamos con hexanucleótidos al azar. Tendremos cuatro secuencias diferentes. Se ajusta la concentración de hexanucleótidos de tal manera que se forma un híbrido cada 200-300 pb. Como los hexanucleótidos generan un extremo 3’, añadimos polimerasa Klenow, que extenderá hasta encontrarse con el siguiente oligonucleótido que hemos puesto, es decir, se lo comerá y la polimerasa Klenow se parará. Es un método más eficiente y rápido que el anterior.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 3. PCR: cogemos el fragmento (de interés) de DNA + 2 oligonucleótidos complementarios y los mezclamos en un tubo. Uno de los dos ha de estar marcado para obtener el producto de la PCR marcado, se trata de una replicación masiva. Es el método común.
No todas las DNA polimerasas son útiles, pero para marcar no radioactivamente, las que no tienen actividad correctora de pruebas (taq) van muy bien.
4. RNA polimerasas de los fatos T3, T7, SP6...: generamos una ribosonda para la trancripión in vitro, utilizaremos vectores especializados. Si transcribimos la cadena complementaria al mRNA genial, pero si transcribimos la cadena que es igual al mRNA no saldrá el Northern.
RIBOSONDAS > PCR > RANDOM PRIMED • Cadena – y cadena + La cadena + no tiene por qué ser la superior sino la que se transcribe. Según dónde esté el fosfato físicamente: en la cadena de arriba o en la de abajo, aquella será la cadena +.
La sonda siempre ha de ser la cadena - : la RNA polimerasa hace una cadena igual que la cadena + (se lee, copia la cadena -) y pone los nucleótidos complementarios. Si en la cadena – hay un TAC, se pondría AUG en la +. La sonda es cadena – para poder hibridar con el RNA.
Es decir, la cadena + tiene la misma secuencia que el transcrito nuevo, idéntica a la del RNA cambiando T por U (la cadena sentido).
CONDICIONES DE HIBRIDACIÓN Y DE RESTRICTIVIDAD.
Se ha de terne en cuenta la fisicoquímica del blot. En la reacción de hibridación cuando ponemos el filtro de nylon/nitrocelulosa/poliviniliden hemos de tener una estimación de lo idénticos que serán la sonda y el DNA diana.
Cuando provienen de la misma especie esperamos que ambas sean idénticas y utilizaremos condiciones de hibridación y condiciones de lavado “stringent” (restrictivos o bien restringentes, se llaman de las tres formas, nunca se llaman “estringentes”).
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Astringente = algo que promueve la cicatrización sobre una herida, por ejemplo, el alcohol, estringente no existe.
Las condiciones restrictivas favorecen a aquellas moléculas que tienen un elevado grado de identidad para que puedan hibridar después del procedimiento del Southern Blot.
Que las condiciones sean restrictivas o no depende de: 1. Temperatura.
2. Concentración de cloruro sódico (NaCl).
Cuando se hace una hibridación con temperatura elevada favorecemos que solo aquellas moléculas con un elevado grado de identidad puedan hibridar.
Cuando se hace una hibridación con temperatura baja favorecemos que moléculas con menor grado de identidad pueda hibridar.
Con el cloruro sódico es al contrario, con alto cloruro sódico no favorecemos a que haya condiciones restrictivas.
Cuanta más temperatura más se desnaturaliza el DNA, el cloruro sódico bloquea las cargas negativas del DNA y disminuye la repulsión electrostática de las dos moléculas del DNA favoreciendo que formen una doble hélice.
Formamida: agente desnaturalizante que se pone habitualmente durante el tiempo en el que el DNA está en contacto con la sonda cuando la restrictividad es baja, es decir, hay poca identidad.
Enlentece el proceso de hibridación, de alguna manera nos garantiza que este pueda ser lo máximo de específico posible.
Por ejemplo, trabajamos con una sonda que tiene una identidad del 80%. Esto quiere decir que debemos intentar que las condiciones de hibridación y rentado sean poco restrictivas porque sino no hibridará con el DNA diana. Entonces, durante las condiciones de hibridación cogeremos y pondremos una temperatura entre 60-70 grados y una concentración de cloruro sódico que la debemos de calcular para que permite que la sonda queda emparejad.
Para calcularla debemos introducir el tanto por ciento de emparejamiento, sería del 20%, y esto nos daría a qué temperatura hemos de hibridar el DNA inmovilizado por encima de la membrana para que pueda hibridar.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología La concentración de formamida suele ser constante, entre el 45-80%.
Una vez se ha acabado el procedimiento de hibridación viene el lavado, se extrae el filtro de la bufeta y lógicamente se ha de eliminar toda la sonda que no se ha quitado del DNA.
Se acostumbra a hacer un lavado de muy baja restrictividad, a una concentración de cloruro sódico relativamente elevada y temperatura relativamente baja.
Posteriormente hacemos un segundo lavado en el que hemos de ajustar la concentración de cloruro sódico a aquella que nos permita mantener una sonda, la cual tiene un 70% de identidad con el DNA diana. Habitualmente acostumbra a ser un lavado de cloruro sódico 0.1 M, a una temperatura de 60 Cº más o menos.
SOUTHERN Y NORTHERN BLOTS. EJEMPLOS.
El Southern básicamente es hacer un mapa de restricción y el Northem es detectar los RNAS a lo largo del filtro.
Cuando se hace un Southern nosotros tenemos un control relativamente bueno de la cantidad de DNA que ponemos en cada punto y no es necesario estandarizarlas. El problema viene a la hora de, por ejemplo, hacer un Northern Blot en el que cuantificar el RNA, cuantificarlo no es tan fácil, es muy habitual utilizar un estándar interno que nos permite ver si la carga en el gel de electroforesis ha sido igual para las distintas muestras.
Entonces, es frecuente encontrar un gen housekeeping, es decir, un gen el cual sabemos que se expresa en todos los tejidos y de forma constitutiva. Si por un x problema en un carril tenemos cargado un poco menos de RNA arriba, veremos un poco más de RNA y por tanto el gen se expresaría menos. Si se utiliza el control interno del gen housekeeping tenemos la evidencia de que todo se ha cargado lo suficientemente bien, normalmente se hace con GAPDH. Esto es la tinción de bromuro de etidio.
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