Regulación del operón lac: Informe (2017)

Pràctica Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 2º curso
Asignatura Metodología y experimentación
Año del apunte 2017
Páginas 13
Fecha de subida 02/10/2017
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Realizado por: Angelina Bachevskaya Marta Caballero Cavallè Diego Antón Viana Tutora: Ximena Terra Facultad de Química URV 2017 1. Resumen ............................................................. 2 2. Objetivos ............................................................. 3 3. Materiales y Métodos ......................................... 3 3.1.Medida del crecimiento .................................... 3 3.2 Ensayo de la actividad galactosidasa ........... 3 3.3 Determinación de [glucosa] .............................. 4 4. Resultados .......................................................... 5 4.1. Curva de crecimiento ................................... 5-6 4.2. Actividad B-Galactosidasa ........................... 6-8 4.3. Determinación de [glucosa] ........................ 8-10 4.4. Cada medio a distintos factores ............... 10-12 5. Conclusión ........................................................ 12 6. Bibliografía ........................................................ 13 1 Resumen Introducción Un operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores. La degradación de lactosa en E. Coli está regulada por la expresión del operón lac, requiriéndose dos enzimas, la lactosa permeasa, que permite el transporte de la lactosa al interior de la célula y la β‐galactosidasa, que cataliza la ruptura del enlace β‐1, 4 entre la galactosa i la glucosa.
Objetivos El objetivo de esta práctica ha sido el estudio de diferentes características del operón lac en E. Coli en tres medios distintos: en glucosa, en lactosa y diáuxico (glucosa + lactosa).
Materiales y métodos Para la realización de este experimento se incubó una cepa de E. Coli (471), en tres medios: glucosa, lactosa y diáuxico durante 4 horas a 37ºC. De cada medio se extrajo una muestra para tres estudios: el crecimiento bacteriano, actividad β‐ galactosidasa y concentración de glucosa, para lo que se midió la absorbancia con un espectrofotómetro.
Resultados y discusión Se determinó que en presencia de glucosa el crecimiento es más rápido que con lactosa, igualándose posteriormente.
Se comprobó que en el medio de glucosa la actividad -galactosidasa fue nula, sin embargo en el medio de lactosa sí hubo actividad y por último el medio diáuxico fue una combinación de ambos.
Finalmente, la concentración de glucosa en el medio de lactosa fue nula pero tanto en el medio con glucosa como diáuxico fue aproximadamente la misma.
Conclusión Se pudo concluir que la E. Coli tiene la capacidad de elegir la fuente de carbonos, con la ayuda del operón. Además se determinó en primer lugar se consume glucosa ya que la activación del operón lac supone un gasto extra de energía.
2 Material y Métodos Se prepararon 3 botellas con diferentes medios: MgNS (9,86 g/L) Fe (0, 22 g/L) Glucosa 40 mM H2O Solución P (6,04 g/L) MgNS (9,86 g/L) Fe (0, 22 g/L) Glucosa 40 mM Lactosa 40 mM H2O Solución P (6,04 g/L) MgNS (9,86 g/L) Fe (0, 22 g/L) Lactosa 40 mM H2O Solución P (6,04 g/L) Se cogió una muestra para el blanco de cada tubo, añadiendo posteriormente la cepa con E. Coli (1,5 mL)  tiempo 0’.
Se prepararon 126 (14x9) tubos para la evaluación del crecimiento, la medida de actividad de la β-galactosidasa y la concentración de glucosa en función del tiempo (cada 20 min), volumen (5, 2, 1,75 mL) y tipo de medio (Glucosa, Lactosa, Diáuxico).
AE Crec.
[Glu] 5 mL medio 1, 75 mL 2 mL 0,25 mL H2O2 0,5 mL 3 Cada muestra que se cogió fue dividida para la evaluación del crecimiento, medida de actividad β-galactosidasa la cual se guardó en la nevera y el análisis de contenido de glucosa que se guardó en el congelador.
MEDIDA DEL CRECIMIENTO Cada 20 minutos se cogió una muestra durante 210’ con una gota de formaldehído que paró la reacción. Se midió la densidad óptica a 420 nm.
ENSAYO DE LA ACTIVIDAD Β-GALACTOSIDASA La actividad β-galactosidasa se midió mediante o-nitrofenol-β-D-galactósido (oNPG) que aportó coloración a muestras con lactosa. Para ello se añadió tolueno al 2% v/v en etanol a las muestras que se recogieron durante el día anterior para la actividad de este enzima. Se dejó en un baño durante 10’ a una 27ºC y posteriormente, a 1 mL de esta solución se añadió 1,5 mL de tampón y 0,5 de ONPG.
Nota: A partir del minuto 120’ las muestras se diluyeron ¼ y se siguió el mismo procedimiento citado anteriormente. Se dejó reposar 20 minutos y se detuvo la reacción con Na2CO3. Finalmente se leyó la absorbancia a 420 nm.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES (EN NUESTRO CASO SÓLO GLUCOSA) Se siguió el protocolo Kit glucosa enzimática monoreactivo.
Se centrifugaron las muestras a 4500 rpm, 10 min y 4ºC para que las células quedaran precipitadas y obteniendo en el sobrenadante el medio con la incógnita a estudiar. Para ello se prepararon 41 tubos con 1 mL de reactivo A del kit, de los cuales 39 fueron para muestras, 1 tubo para el blanco y 1 tubo para el estándar.
A 39 tubos se añadió 0,02 mL de la muestra correspondiente, al blanco 0,02 mL de blanco y al estándar 0,01 mL de blanco y 0,01 mL estándar (reactivo 2 del guión). Se dejó 10 minutos a 37ºC y finalmente se midió la densidad óptica a 505 nm.
4 Resultados CURVA DE CRECIMIENTO Se determinó directamente la absorbancia de las muestras preparadas ya que la densidad óptica es proporcional al crecimiento.
Tabla 1: Absorbancias de distintos medios para la medida del crecimiento, a todos los valores se les ha restado el blanco.
Glucosa 0 0,024 0,03 0,058 0,076 0,117 0,12 0,147 0,161 0,162 0,209 0,2 0’ 20’ 40’ 60’ 80’ 100’ 120’ 140’ 160’ 180’ 200’ 210’ Lactosa 0,012 0,015 0,019 0,033 0,067 0,089 0,097 0,134 0,161 0,208 0,264 0,258 Diáuxico -0,004 0,009 0,017 0,052 0,072 0,097 0,117 0,164 0,166 0,189 0,273 0,302 0,35 0,3 Abs (420 nm) 0,25 0,2 Glucosa Lactosa 0,15 Diáuxico 0,1 0,05 0 0 2 4 6 8 Tiempo (min) 10 Figura 1: Medida del crecimiento de E. Coli en diferentes medios.
5 12 14 A partir de los datos obtenidos, se observó (Fig. 1) que:  En el medio con lactosa el crecimiento comienza más tarde que en los otros medios porque se tiene que activar el operón lac, lo que implica que haya una fase de adaptación.
 En el medio diáuxico se comienza consumiendo glucosa, una vez acabada esta se activa el operón y se consume lactosa  En el medio con glucosa no hay fase de adaptación, por tanto tiene un crecimiento exponencial. Sin embargo, una vez se consume, los valores bajan.
 Se observa que en el minuto 100-120 la lactosa y el diáuxico se solapan porque están consumiendo lo mismo (lactosa).
ACTIVIDAD G ALACTOSIDASA La actividad galactosidasa se midió utilizando un análogo de lactosa, el O-NPG, que se rompe por este enzima dando o-nitrofenol que absorbe a 420 nm (Tabla 2). Se midieron aparte las absorbancias de la dilución ¼ realizada a partir del minuto 120’ de la muestra inicial1.
Observación experimental: la dilución no se realizó correctamente por lo que finalmente estos valores no se tuvieron en cuenta para realizar la representación.
Tabla 2: Absorbancias obtenidas a partir del o-nitrofenol Sin blanco 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 210 Glucosa Lactosa Diáuxico 0,058 0,062 0,053 0,101 0,082 0,117 0,059 0,085 0,197 0,417 0,773 1,164 1,592 2,244 3,219 3,515 3,807 3,796 0,066 0,055 0,07 0,073 0,073 0,115 0,202 0,081 0,088 0,102 0,14 0,24 1,203 2,194 3,132 3,917 6 Lactosa 1/4 Diáuxico 1/4 0,943 1,394 1,963 2,339 2,443 2,433 0,123 0,718 1,353 2,221 2,443 Si tuviéramos en cuenta la dilución que se tuvo que haber realizado, el cálculo sería el siguiente: [ ] Posteriormente se calcularía la actividad enzimática como se hizo anteriormente.
La concentración esperada de glucosa sin diluir fue: [ ] A partir de las absorbancias obtenidas se realizó el cálculo de la concentración utilizando la Ley de Lambert-Beer: [ ] , para posteriormente calcular la actividad enzimática. Ejemplo con el medio de lactosa al tiempo de 20 minutos: [ ] Las actividades enzimáticas calculadas se recogieron en una tabla (Tabla 3).
Tabla 3: Actividades enzimáticas de b-galactosidasa U/mL 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 210 Glucosa 0 Lactosa 0 0,004214441 0,004883793 0,00689185 0,009581655 0,011542609 0,013155666 0,015894462 0,019950418 0,019364391 0,018875736 0,017924949 0 0,001669249 0,001016424 0,001160211 0,000573731 0,000545398 0,000561925 0,000694143 0,001133295 7 Diáuxico 0 0,002726991 0,001735358 0,001206487 0,000904865 0,001140378 0,001669249 0,007455841 0,012086906 0,015528974 0,018496318 0,025 0,02 DO 0,015 0,01 0,005 0 0 50 100 150 Tiempo (min) Glucosa Lactosa 200 250 Diáuxico Figura 2: Representación de la actividad b-galactosidasa de cada medio A partir de los datos obtenidos (Fig. 2) se observó que:  La glucosa no presenta actividad galactosidasa por lo que se mantiene en valores cercanos al 0.
 La lactosa presenta actividad galactosidasa y con el paso del tiempo se estabiliza. El no enlentecimiento de su actividad puede ser debido a errores en procedimiento.
 El diáuxico en un intervalo de 0-120’ consume la glucosa, una vez acabada esta pasa por la fase de adaptación durante la cual activa el operón lac, y posteriormente consume la lactosa.
[GLUCOSA] Se midió la concentración de glucosa en cada medio a 505 nm (Tabla 4).
Se pudo observar que el medio de lactosa no presenta ninguna concentración de glucosa.
8 Tabla 4: Valores de la concentración de glucosa 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 210 Lactosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Glucosa 0,034 0,024 0,02 0,014 0 -0,01 -0,014 -0,008 -0,011 -0,006 -0,005 Diáuxico 0,032 0,092 0,01 0,008 0,003 0 0 0 0 0 0 0 A partir de los valores obtenidos (Tabla 4) se calculó la concentración de glucosa final en cada medio y se deshizo la dilución: [ [ ] ] Ejemplo con glucosa 20’ (el estándar está diluido a la mitad): [ ] Tabla 5: Concentración de glucosa en distintos medios [mg/dL] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 210 Lactosa 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Glucosa 10,2 7,2 6 4,2 0 0 0 0 0 0 0 9 Diáuxico 9,6 10 3 2,4 0,9 0 0 0 0 0 0 0 12 10 DO 8 6 4 2 0 0 50 100 150 Tiempo (min) Lactosa Glucosa 200 250 Diáuxico Figura 3: Representación de la concentración de glucosa en diferentes medios Se pudo observar que:  El medio con lactosa la concentración de glucosa es nula  El medio con glucosa presenta una concentración de esta esperada, y a medida que se va consumiendo baja con el tiempo  En el medio con diáuxico se observa la concentración de glucosa esperada a la teórica, y tiene un comportamiento similar al medio con glucosa.
CADA MEDIO SOMETIDO A DISTINTOS FACTORES Glucosa: se pudo visualizar que la glucosa presenta un crecimiento exponencial, disminuyendo cuando el tiempo se aproxima a 4 horas. Además, no se detecta galactosidasa en presencia de glucosa, sin embargo se determinó que la concentración de glucosa es 10,2 mg/dL inicialmente, con el paso de tiempo va disminuyendo hasta llegar a 0.
12 10 8 6 4 2 0 DO 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 Curva de crecimiento 100 150 Tiempo (min) Actividad b-galactosidasa Figura 4: Comportamiento a distintos factores del medio con glucosa 10 200 250 [] glucosa U/mL 0,25 mg/dL Glucosa Lactosa: Se detectó actividad galactosidasa en presencia de lactosa, presentando un crecimiento similar a la curva de crecimiento. Lógicamente, no se detectó concentración de glucosa en el medio con lactosa.
Lactosa U/mL 0,3 0,25 0,015 0,2 0,01 0,15 DO mg/dL 0,02 0,1 0,005 0,05 0 0 0 50 100 150 Tiempo (min) Actividad b-galactosidasa [] glucosa 200 250 Curva de crecimiento Figura 5: Comportamiento a distintos factores del medio con lactosa Diáuxico (Glucosa/Lactosa): En este medio se observó la presencia de concentración de glucosa, que con el paso de tiempo disminuía a medida que se consumía. Además la actividad galactosidasa se visualizaba a partir del tiempo 120’ aproximadamente, ya que es cuando se dejaba de consumir glucosa y se pasaba a lactosa. La curva de crecimiento de este medio comienza con un crecimiento exponencial, pero posteriormente presenta un rango de adaptación para pasar a consumir lactosa.
U/mL 15 0,4 0,3 10 0,2 5 0,1 0 0 0 50 [] glucosa 100 150 Tiempo (min) Curva de crecimiento 200 Actividad b-galactosidasa Figura 6: Comportamiento a distintos factores del medio con glucosa/lactosa 11 250 DO mg/dL Diáuxico Conclusión En este experimento se consiguieron los resultados esperados, pudiéndose afirmar que el operón lac solamente es activado en presencia de lactosa. En primer lugar se lleva a cabo una etapa de adaptación en la cual el operón lac es activado, a continuación la β‐galactosidasa ejerce su rol en la degradación de la lactosa y finalmente se produce la etapa de estabilización.
Además se ha determinado que si la glucosa está presente, la E. Coli la preferirá por mucho ya que requiere pocos pasos y menos energía para descomponerse que la lactosa. Sin embargo, si la lactosa es el único azúcar disponible, E. Coli no dudará y la utilizará como fuente de energía.
Para utilizar la lactosa, las bacterias deben expresar los genes del operón lac, que codifica enzimas claves para el consumo y el metabolismo de la lactosa. Para ser tan eficiente como sea posible, E. Coli debe expresar el operón lac solamente cuando la lactosa esté disponible y la glucosa no esté disponible.
Bibliografía 1. Khan Academy. 2017. Acceso: [26 de febrero de 2017]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/science/biology/gene-regulation/generegulation-in-bacteria/a/the-lac-operon 2. Química Clínica Aplicada S.A.; Método God-Pod. Amposta; Octubre 2010.
3. Hamilton I, Fewson C, Holmes W. Catabolite Repression, Catabolite Inhibition and the Regulation of 13-Galactosidase Synthesis in Escherichia coli. 1987:154.
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