Tema 15 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2014
Páginas 10
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 41
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Tema 15. CASOS NOTABLES D’ESPECIFICITAT ENZIMÀTICA METILACIÓ DE LES BASES NITROGENADES Aquest mecanisme està implicat en la defensa de bacteris. Sabem que hi ha una sèrie d’enzims que reconeixen les seqüències d’àcids nucleics i si aquestes no estan metilades en les adenines les endonucleases trenquen el DNA de manera que, els enzims actuen com a reconeixement del DNA.
Aquest mecanisme de defensa implica dues activitats diferents:  Activitat metilasa que introdueix de forma específica metilacions en les bases. Quan aquestes no ho estan el DNA serà degradat per una endonucleasa de restricció.
 Activitat endonucleasa, és a dir, és necessari el reconeixement i degradació del DNA no metilat.
La metilació sempre es pot donar en dos posicions diferents: en la posició 6 o 5.
Característiques dels sistemes R-M Si analitzem les endonucleases de restricció veiem que hi ha tres grans tipus (en realitat podríem dir que hi ha 2 tipus ja que dues són pràcticament iguals).
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Nucleases de restricció tipus I Les de tipus I tenen un únic complex on resideix les dues activitats (nucleasa i metilasa). En una part allunyada de l’estructura anterior trobem la seqüència de reconeixement, la zona que identifica la seqüència i reconeix si aquesta està metilada o no. Generalment en el sistema podem trobar tres situacions diferents:  Les dues cadenes del DNA estan metilades i en aquestes condicions no passa res, el sistema es dissocia.
 Cap de les dues cadenes de DNA està metilada i per tant, en aquestes condicions la subunitat S (nucleasa) reconeix la seqüència i la subunitat R (activitat de restricció) trenca i elimina el DNA.
 Una cadena del DNA està metilada però l’altre no (com en el cas de la replicació del DNA). En aquestes condicions sempre actua la seqüència de reconeixement i l’activitat metilasa és l’encarregada de metilar la segona cadena.
D’alguna manera, tant el tipus I i el III tenen les dues activitat en la mateixa zona. En el tipus 1 sobretot sabem que la seqüència de reconeixement està molt allunyada de la seqüència del DNA respecte el lloc de trencament, l’enzim reconeix la seqüència no metilada en una posició determinada però el trencament és produeix fins a 1000 pb més enllà.
Per acció d’aquests enzims del tipus I es requereix la presència d’ATP, que sembla que s’hidrolitza, el seu paper és contribuir a aproximar la seqüència de reconeixement en la posició de trencament.
Nucleases de restricció tipus II Les de tipus II tenen dos característiques que les diferencien de les anteriors; tenen activitat metilasa i nucleasa però aquestes estan separades, són proteïnes diferents. A més, el lloc de reconeixement de la seqüència i el lloc de trencament estan en la mateixa regió.
En la següent taula veiem marcades amb un asterisc les posicions metilades perquè l’enzim no actuï. En general observem que es tracten de seqüències palindròmiques i en la reacció de trencament hi ha sempre dos possibilitats:  El procés d’hidròlisi pot generar extrems cohesius, un dels fragments de DNA té una cua monocadena i l’altre tindrà la cadena complementària.
 El procés d’hidròlisi pot generar extrems rombs, el trencament en els dos fragments es dona en el mateix lloc de manera que, els dos extrems acaben en doble cadena en ambdós llocs.
El mecanisme d’especificitat dels enzims de restricció és imprescindible en la síntesi del substrat. Els enzims de restricció són dímers.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 EcoRV Dins dels enzims de restricció del tipus II, a nivell d’especificitat i estructura es coneix molt bé EcoRV que trenca en enzims rom i el substrat té una simetria en quant a la seqüència de bases.
Estructura de la seqüència de reconeixement d’EcoRV Veiem un esquema de la seqüència de trencament per l’endonucleasa EcoRV i observem que hi ha una simetria en relació a la disposició de les bases.
Estructura dimèrica/ d’EcoRV La major part dels enzims de restricció del tipus II són estructures dimèriques constituïdes per dues subunitats iguals (blava i groga). L’efecte de la hiperespecificitat és conseqüència que quan un DNA que conté la seqüència de reconeixement no està metilat i interacciona en el centre actiu hi ha una distorsió de la doble cadena; això està associat a interaccions específiques amb les posicions superiors i sobretot, és conseqüència de la interacció de les bases més allunyades de la seqüència de reconeixement amb els dos loops inferiors.
Interaccions que participen en la hiperespecificitat edf Les interaccions que veiem entre el parell GC i el parell AT corresponen a les interaccions de les dues posicions que torbem a la imatge d’estructura de la seqüència de reconeixement; concretament, les que trobem a la part externa.
Per tant, aquestes interaccions són les que es localitzen en els loops de l’estructura. En aquestes interaccions s’estableixen ponts d’hidrogen entre les cadenes de forma simètrica.
Cal tenir present que la interacció amb l’asparagina 185 no es produeix quan el DNA està metilat. Així doncs, la mateixa interacció que defineix l’especificitat és la que participa en la pèrdua del DNA quan aquest està metilat.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Efecte del DNA afí i DNA inespecífic en la interacció amb EcoRV Amb estudis cristal·logràfics per EcoRV es va veure que les interaccions també es podien produir tot i que el DNA no tingués la seqüència de reconeixement. Per tant, sempre hi ha una certa interacció però només quan hi ha la seqüència de reconeixement és quan es produeix la distorsió de l’estructura del DNA. Així doncs, si no hi ha distorsió, l’enllaç fosfodiéster queda allunyat del centre actiu i no hi ha trencament.
Quan hi ha un complex no específic, observem unes certes interaccions però, en canvi, quan tenim la seqüència de reconeixement observem que el número d’interaccions que es donen és molt més gran. Cal saber que les interaccions addicionals són les que aporten l’energia per tal que el DNA estigui distorsionat.
Un altre aspecte important en la interacció amb aquest enzim de restricció és la necessitat de la presència d’ions magnesi.
Quan un treballa amb enzims de restricció, sempre hi ha unes condicions de treball que defineixen quin és el pH, el tampó que s’ha d’utilitzar... És molt important saber que els enzims de restricció tipus II necessiten de magnesi i per tant, hem de trobar-lo. Aquest ió se situa en el centre actiu de l’enzim i és clau perquè es produeixi la catàlisi.
Distorsió de l’estructura En aquesta imatge podem veure quina seria l’estructura que adopta el DNA en la zona en la qual fem el trencament i en el lloc del centre actiu de l’enzim és on observem la distorsió del DNA.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Mecanisme de catàlisi d’EcoRV. Hidròlisi de l’enllaç fosfodiéster El procés de catàlisi és un procés que hidrolitzar les dues cadenes però a la imatge només veiem representada una. Hi ha una reacció d’hidròlisi que escindeix l’enllaç fosfodiéster del DNA generant el trencament de la ribosa en posició 3’ amb el fosfat. El producte del trencament és per una banda, la molècula acabada en extrem 5’ i per una altra banda, la molècula acabada en l’extrem 3’.
Del centre actiu sabem que, el trencament es produeix específicament entre l’enllaç d’una adenina i una timina i aquesta és una seqüència que facilita la distorsió. A més, veiem que en el centre actiu tenim per una banda el magnesi, que està estabilitzat per dos aspàrtics del centre actiu i que contribueixen a la catàlisi per estabilització del magnesi; per una altra banda, el magnesi està interaccionant amb 3 molècules d’aigua i l’altre coordinació la fa amb l’oxigen del fosfat de l’enllaç fosfodiéster que serà hidrolitzat.
El magnesi, juntament amb la cadena lateral de l’aspàrtic, el que fa és afavorir la reacció del grup – OH sobre l’enllaç fosfodiéster. Cal tenir present que aquesta és una catàlisi molt semblant a la que elabora l’anhidrasa carbònica.
Efecte de la metilació del DNA Quan tenim un DNA amb l’adenina metilada, la presència del grup metil evita que es formin els ponts d’hidrogen entre l’adenina i l’aspàrtic 185, de manera que estan disminuint les interaccions entre enzim i substrat. Per tant, no es produeixen les suficients interaccions i és comporta com un DNA que no té la seqüència de reconeixement. Cal saber que la pèrdua d’aquesta interacció també limita altres reaccions.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 LES tRNA SINTETASES Estructura general de les tRNAs Les tRNA sintetases són els enzims que catalitzen la formació dels aminoacil tRNA que són compostos que col·laboren en la síntesi proteica i que actuen com a donadors d’aminoàcids. Tots els tRNA tenen un model de plegament tridimensional comú i el braç CCA és el lloc on s’uneix l’aminoàcid que serà transportat per la síntesi proteica.
Una altra cosa clau és que quan ja s’ha produït l’aminoacil tRNA, el que reconeix quin és l’aminoàcid que serà transferit per la síntesi proteica és el loop on trobem l’anticodó del triplet.
Així doncs, les tRNAs han detenir una alta especificitat perquè quan s’ha format el complex no hi ha altre mecanisme de reconeixement al que es produeix en el moment de la síntesi proteica del loop on hi ha l’anticodó. És per aquest motiu que necessitem un mecanisme fidel i sense errors. Hi ha diferents estudis que observen que les tRNAs tenen un grau de manteniment de la especificitat més gran que altres sintetases.
Reacció de les aminoacil tRNA sintetases El producte final de la reacció de les aminoacil tRNA sintetases és el tRNA unit a l’aminoàcid a partir del braç CCA. En la imatge veiem un esquema de la reacció: hi ha dues vies de síntesi i el procés es produeix en dues etapes on la segona és la més específica.
En la primera etapa únicament es produeix l’activació de l’aminoàcid mitjançant la interacció amb l’ATP i com a intermediari del procés es genera l’aminoacil adenilat on l’aminoàcid està unit al nucleòtid d’adenina monofosfat.
Aquesta reacció és irreversible en condicions cel·lulars ja que un dels productes de la reacció és el pirofosfat que és molt inestable i s’hidrolitza molt ràpidament a dos fosfats inorgànics i això limita molt la reversibilitat del procés.
La segona etapa té dos possibles mecanismes i és l’etapa on l’aminoacil AMP forma l’enllaç covalent amb el tRNA i és on hi ha especificitat.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Exemple: estructura de la treonil – tRNA sintetasa Les aminoacil tRNA sintetases que produeixen específicament els aminoacils de treonina són les treonil – tRNA sintetases.
Si nosaltres mirem l’estructura sabem que els que estan interaccionant són la tRNAs específica i l’aminoàcid; en relació als aminoàcids podem trobar alguns que són molt diferents entre sí, com els aromàtics, i altres que són semblants com ara la serina i la valina que són els més similars en relació a la treonina. Així doncs, en el cas de la treonina, la serina i la valina podrien ser reconeguts de forma incorrecta per la treonil – tRNA sintetasa.
En la imatge veiem que la treonina té un metil més que la serina i per tant, la cadena lateral de la serina té un volum més petit. Per una altra banda, la valina en lloc de tenir un grup –OH té un metil i és una mica més gran que la treonina, això fa que sigui més hidrofòbic.
Processos per evitar errors i lloc de revisió o correcció de la treonil – tRNA sintetasa Dins del procés que intenta evitar errors, la primera fase de reconeixement que intenta fer-ho resideix en el fet de les posicions amb les quals interacciona la treonina en el centre actiu on hi ha una interacció clau entre el grup alcohol de la treonina amb la cadena lateral d’un aspàrtic:  En el cas de la valina, trobem un metil en lloc d’un alcohol i per tant, aquesta interacció no es podrà produir. La pèrdua d’un caràcter molt més polar el que fa és evitar que la valina sigui reconeguda com a substrat.
 En el cas de la serina, el caràcter polar de la treonina es mante. Per tant, en la primera fase de reconeixement només poden discriminar entre valina i treonina.
La revisió de l’error que pot haver-hi entre la incorporació d’una serina o una treonina té lloc molt a prop del centre actiu on trobem un lloc que es coneix amb el nom de lloc de revisió o lloc de correcció; quan s’ha sintetitzat el producte, es coneix que no es dissocia directament del tRNA sinó que és transferit al lloc de revisió on si erròniament el tRNA de treonina ha agafat una serina, aquest lloc d’edició es comporta com un centre actiu i trenca l’aminoacil tRNA. Per una altra banda, si l’aminoàcid és correcte es pot dissociar i obtenim el tRNA aminoacil format.
Només es trenquen els aminoàcids de serina perquè el lloc de reconeixement és petit i únicament entra l’aminoàcid serina; quan es transporta treonina no pot entrar i passa de llarg.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Complexes aminoacil – tRNA sintetasa i tRNA Per una altra banda, hi ha una especificitat pel tRNA. En la imatge de l’esquerre veiem un esquema de per una banda, l’especificitat per l’aminoàcid i per una altra banda, l’especificitat pel tRNA que és coneix que ve donada per l’anticodó.
L’enzim necessita reconèixer l’aminoàcid i el tRNA. Per reconèixer l’aminoàcid ho fa com hem vist anteriorment i per reconèixer el tRNA ho fa a partir de diferents interaccions, principalment, per la seqüència de l’anticodó. Per tant, el mateix lloc que defineix l’especificitat de la síntesi proteica, també defineix l’especificitat perquè al formar-se l’aminoacil tRNA tot sigui correcte.
Cal saber que com a mínim hi ha una tRNA sintetasa per cada aminoàcid.
ACONITASA Amb l’aconitasa veurem com el mecanisme d’especificitat està relacionat amb la hipòtesi de fixació de 3 punts. Recordem que aquesta hipòtesi deia que encara que tinguéssim 2 substituents iguals, l’estructura del centre actiu pot identificar aquestes dues posicions amb el mateix substituent com a posicions diferents. Per tant, una molècula que des del punt de vista químic té un carboni simètric però des del punt de vista cinètic no actua com a tal.
L’aconitasa és un enzim del cicle de Krebs que transforma el citrat a isocitrat, és a dir, canvia la posició d’un grup alcohol de manera específica sobre l’àtom de carboni adjacent però que no és l’àtom de carboni que prové de l’acetat. Això ho van poder determinar mitjançant marcatge radioactiu.
El citrat és una molècula simètrica i en l’esquema veiem que estan marcats radioactivament els àtoms de carboni que provenen de l’acetat. L’isocitrat, quan hi ha canvi en la posició del grup alcohol, mai no va a l’àtom de carboni que provenia de l’acetat i per tant, de les dues possibles reaccions només es produeix la primera. Això condueix que quan es produeixen les descarboxilacions en el cicle de Krebs, mai no fan referència als dos àtoms de carboni que han entrat al cicle Aquest és un exemple que d’una molècula simètrica que es comporta com a molècula asimètrica.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 Aconitasa: Interaccions especifiques L’especificitat de l’aconitasa es pot explicar a partir de la hipòtesi dels 3 punts.
Mecanisme de reacció de l’aconitasa El mecanisme de la reacció de l’aconitasa ens permet entendre la seva especificitat. El centre actiu de l’aconitasa és complex ja que per una banda, hi ha els aminoàcids freqüents com la serina però a més, es caracteritzar per tenir una part no proteica que corresponen a centres ferro – sofre. Recordem que el centres ferro – sofre els trobem en els components de la cadena de transport electrònic i són complexes associats a la proteïna que donen estructures amb ferro i sofre; la diferència fonamental és que en els que trobem a la cadena de transport el ferro actua en un procés redox canviant així el seu nombre d’oxidació però en aquest cas no.
Per una altra banda, veiem la distribució del substrat i la presència de diferents aminoàcids claus. Dins dels aminoàcids per iniciar el procés parlarem del residu de serina clau per començar la reacció. En l’entorn que es troba el trobarem en la forma desprotonada de manera que, pot actuar com a base captant protons. Un altre aminoàcid clau és el residu d’arginina que participa en la fixació del substrat ja que estableix una interacció electrostàtica entre la càrrega positiva de la cadena del substrat i el grup carboxílic. També, un residu d’histidina que està carregat intervindrà en una catàlisi àcida.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biocatàlisi. T15 La serina ionitzada actua en la primera reacció com a base captant un protó del substrat la qual cosa provoca una reordenació electrònica del sistema i s’afavoreix que el grup alcohol que es va transferir es trenqui i es formi una molècula d’aigua. Per tant, això ens porta a un intermediari de la reacció que es coneix com 6 – aconitat que té un doble enllaç entre el carboni 2 i 3. Aquest intermediari s’estabilitza en el centre actiu gràcies a l’arginina que trobem.
L’intermediari 6 – aconitat gira 180° en relació al pla que ocupa en les condicions inicials. Això el que fa és canviar la orientació respecte els centres ferro – sofre fent que el grup carboxílic que està a prop dels centres no sigui el carboni 3 sinó que sigui el carboni 2. Això és facilita perquè d’alguna manera, la arginina està ancorant l’intermediari en el centre actiu.
Posteriorment es produeix la transferència del – OH de l’aigua a l’intermediari i tot torna a les condicions inicials. La serina torna a cedir l’hidrogen com a protó i la histidina es torna a protonar.
Així doncs, el centre actiu el que provoca és que quan s’està produint la reacció on entra la molècula d’aigua, el grup –OH entri de forma específica i es posicioni en el carboni 2. És per aquest motiu que l’especificitat de l’aconitasa s’associa a la forma del centre actiu, als centres ferro – sofre i a la capacitat per mantenir els intermediaris en el centre actiu.
10 ...