T3.1, C. elegans (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 2º curso
Asignatura Biologia animal
Año del apunte 2014
Páginas 14
Fecha de subida 07/04/2015
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

T. 3 Animals model per a la investigació en Biologia Molecular QUESTIONS: D’un tipus de cèl·lula passem a tenir mes o menys 200 tipus de cèl·lules diferents Quan es pot començar a veure l’evidència morfològica de la "diferenciació" de la cèl·lula? (per exemple, de patró d'embrions) Per què La reproducció humana és un procés ineficient?: ~ 50% of concepti do not implant a further ~ 30% moren i avorten després de la implantació.
PREGUNTES D’INVESTIGACIÓ EN BIOLOGIA CEL·LULAR: Com interactuen els diferents components cel·lulars entre si durant la divisió cel·lular? Com es formen els microtúbuls (MTs), quines molècules componen els MTs? Com es posen els MTs i es mouen els cromosomes en el lloc adequat en el moment adequat? - - determinació de l'eix, com "trencar" la simetria del ou? la diferenciació cel·lular, la proliferació cel·lular, el creixement cel·lular, l'apoptosi la migració cel·lular, la polarització (divisió cel·lular simètrica vs asimètrica), la forma cel·lular (donant a les cèl·lules diferents morfologies, per exemple, les neurones, EMT), la mort cel·lular morfogènesi (com les cèl·lules s'uneixen per formar els teixits) organogènesi envelliment desenvolupament de cèl·lules germinals Les cèl·lules mare (Multipotència, capacitat d'auto-renovació) es tornen tan "de moda" perquè l'ovella Dolly, 1997, va mostrar que la clonació era possible; el desenvolupament de cèl·lules mare embrionàries humanes evo-devo (un camp de la biologia que compara els processos de desenvolupament de diferents animals en un intent de determinar la relació ancestral entre els organismes i com els processos de desenvolupament han evolucionat.) SISTEMES DE MODELS per la Biologia molecular experimental i anàlisi del desenvolupament Drosophila melanogaster Arbacia punculata Gallus domesticus Mus musculis Danio rerio Caenorhabditis elegans Xenopus laevis and X. tropicalis 3.1.
C. elegans Mühlrad, P. : “cucs són molt més similars del que vostè pot pensar“ Per què estudiar els cucs? Sydney Brenner: "Volem un organisme multicel·lular que té un cicle de vida curt, pot ser fàcilment cultivat, i és prou petit per ser manejat en gran nombre, com un micro-organisme. Ha de tenir relativament poques cèl·lules, de manera que es poden realitzar estudis exhaustius de llinatge i patrons, i han de ser susceptibles d'anàlisi genètic "-. Extractes de proposta al Consell d'Investigacions Mèdiques, 1963 El Premi Nobel de Fisiologia o Medicina 2002 "Pels seus descobriments sobre la regulació genètica del desenvolupament d'òrgans i la mort cel·lular programada " (Caeno, recent; rhabditis, rod; elegans, nice) Caenorhabditis elegans és un nematode petit , de vida lliure (cuc rodó), que viu en moltes parts del món i sobreviu alimentant-se de microorganismes, principalment bacteris. Es tracta d'un important sistema model per a la investigació biològica en molts camps, incloent la genòmica, la biologia cel·lular, la neurociència i l'envelliment Propietats de C. elegans:         Fàcil de cultivar: poden créixer milers en una placa de Petri, s'alimenten de bacteris no perillosos (E. coli com a font d’aliment), i barat de mantindre Temps de generació curt: 3 dies (i 3 setmanes de durada de vida) Petit: 1 mm (aproximadament de la mida d'un cap d'agulla) Poques cèl·lules: 959 hermafrodita (XX), cèl·lules masculines 1031 (XO) Produeix un gran nombre de progènie per adult (al voltant de 300).
Petit genoma: 100Mb, susceptibles d'anàlisi genètica.
Transparent: Es pot examinar a nivell cel·lular en les preparacions de vida per microscòpia de contrast d'interferència diferencial (DIC) És no parasitari Animals mutants es poden obtenir per mutagènesi química, l'exposició a la radiació ionitzant, la transgènesi... Els ceps es poden mantenir com a existències congelades durant llargs períodes de temps.
Malgrat la seva simple anatomia, l'animal mostra un gran repertori de comportament, incloent locomoció; alimentació, defecació, formació larva Dauer, respostes sensorials de tacte, l'olfacte, el gust i la temperatura, i alguns comportaments complexos com l'aparellament dels mascles, el comportament social, i l'aprenentatge i memòria.
La descripció anatòmica de tot l'animal s'ha completat a nivell de microscòpia electrònica i el seu llinatge de cèl·lules completa, que és invariant entre els animals, s'ha establert.
Cicle de vida de C. elegans A 22ºC tarda 3 dies Al min 0 és la fertilització. Els números en blau al llarg de les fletxes indiquen la longitud de temps que l'animal passa a una certa etapa. En primer lloc l'escissió es produeix al voltant de 40 min. després de la fertilització. Els ous són posats fora al voltant de 150 minuts després de la fecundació i durant l'etapa de gàstrula. La longitud de l'animal en cada etapa està marcada al costat del nom de cada etapa en micròmetres (µm).
C. elegans també poden suportar condicions ambientals adverses canviant a una etapa diapausa facultativa anomenada la larva Dauer que pot sobreviure de quatre a vuit vegades el lapse de 3 setmanes de vida normal.
Larva Dauer Dauer (del alemany "durada") Al final de la primera etapa larval, l'animal pot entrar en un estat detingut anomenat larva Dauer si les condicions ambientals no són favorables per a un major creixement . Els factors ambientals , com ara la presència d'una feromona ( un indicador de la densitat de població ) , la falta d'aliments , i alta temperatura actuen com a senyals que poden desencadenar la formació d'una larva a la etapa L2 morfològicament diferent , designada L2d . El període crític per aquesta senyal Dauer comença després de la meitat de la primera fase larvària. La larva L2d conserva el potencial per formar ja sigui una larva Dauer o una larva L3 , depenent de la persistència de la Dauer induïda pels paràmetres ambientals .
Si el medi ambient continua sent desfavorable , la etapa L2d de la larva muda en una larva Dauer.
El Dauer és un estat que no envelleix perquè la seva durada no afecta la vida útil postdauer .
Durant l'estat de Dauer , l'alimentació és detinguda indefinidament i la locomoció es redueix notablement . L'estat Dauer acaba quan l'animal experimenta condicions favorables .
Desprès d'1 hora d'accedir als aliments , l'animal surt de l'etapa Dauer , després de 2-3 hores comença a alimentar-se , i després d'aproximadament 10 hores , es muda a l'etapa L4 .
Hi ha dos sexes C. elegans hermafrodita (XX), s’autofecunda masculina (XO).
La autofecundació de la hermafrodita permet cucs homozigots per generar descendència genèticament idèntica Els mascles es presenten amb poca freqüència (0,1%) per espontània no disjunció en la línia germinal de les hermafrodites i amb més freqüència (fins a 50%) a través d'aparellament.
    5 autosomes I-V i X (6 en total) Animals XX, es tornen hermafrodites Animals XO es converteixen en mascles Amb un cromosoma menys, els mascles desenvolupen 89 neurones i 41 cèl·lules musculars més que els hermafrodites, que s'utilitza per l'aparellament.
Hermafrodites adults tenen 959 cèl·lules somàtiques, mentre que els mascles tenen 1.031.
Anatomia de la C. elegans hermafrodita A. Contrast d'interferència diferencial (DIC) Imatge d'un adult hermafrodita.
B. Dibuix esquemàtic de les estructures anatòmiques. Línies i números de punts marca el nivell de cada secció.
Microscòpia electrònica de rastreig (SEM) imatges d'adults C. elegans hermafrodites a.
Hermafrodita adult b.
Tub digestiu s'obre a l'exterior a través de l'anus.
c.
La superfície exterior de la cutícula al costat lateral té crestes circumferencials (Annuli) i solcs. Alae es forma sobre les cèl·lules de la costura.
d.
Un ou (fletxa) es expulsat per la vulva.
e.
Porus excretor (punta de fletxa) situat en la línia mitjana ventral del cap Els hermafrodites ho fan per si sols: Els C. elegans gònades: un sistema reproductiu extremadament eficient C. elegans mascle Les larves C. elegans mascles inicialment mostrar el mateix pla de cos cilíndric simple com les hermafrodites, però a partir de la fase de L2 en endavant, la forma de la seva meitat posterior canvia, com els seus òrgans sexuals que comencen a desenvolupar-se.
Les diferències més profundes es veuen en els teixits de la part posterior, que porta l'aparell copulador masculí. El sistema muscular del mascle conté 41 músculs específics del sexe addicionals. El sistema de reproducció està compost d'un braç simple de les gònades que s'obre a l'exterior a través d'una càmera epitelial rectal modificat anomenat el proctodeo. El proctodeo inclou dos espícules sensorials escleròtiques utilitzades pel mascle durant l'aparellament per localitzar l'esquerda vulvar hermafrodita, i ocupar la vulva oberta durant la transferència d'esperma. El sistema nerviós té 89 neurones addicionals.
Derivació de cèl·lules fundadores per la divisió cel·lular asimètrica i les induccions Cèl·lules Fundadores: AB, MS, E, C, D i P4.
Propietats distintives de cèl·lules fundadores definit per: - taxa de divisió - naturalesa general que hi ha en la descendència En C. elegans les observacions directes són possibles Divisions cel·lulars.
Fotografies seqüencials d'una hermafrodita L1, vista lateral; òptica Nomarski VCN, les neurones de la medul·la ventral.
0 min, interfase; 16 i 21 min, la profase P10; 24 min, metafase P10; 26 min anafase P10; 27 mm, telofase P10; 29 min, la profase P9; 33 i 34 min, metafase P9.
Aquest llinatge és el secret del desenvolupament embrionari Un cuc C. elegans hermafrodita consisteix exactament de 959 cèl·lules permetent seguir el llinatge cel·lular.
Com s'estableixen els llinatges invariables? De quina manera les cèl·lules saben qui són i el que estan fent?     Control de l'apoptosi Partició dels determinants citoplasmàtics Calendari d'esdeveniments de desenvolupament Interaccions cèl·lula - cèl·lula La mort cel·lular pot ser un destí cel·lular programat genèticament.
- Les cèl·lules específiques amb diversos orígens evolutius experimenten mort cel·lular programada en moments específics durant el desenvolupament.
La mort cel·lular programada es caracteritza per una sèrie de canvis morfològics específics.
Hi ha d'haver gens que controlen tant la decisió de manifestar que el destí i l'execució.
D'on procedeixen els teixits específics? Llinatges no produeixen estrictament tipus de teixits individuals.
Mentre que la línia germinal provenen de cèl·lules fundadores individuals, les cèl·lules dels músculs, del sistema nerviós i de la pell sorgeixen de múltiples llinatges. Això significa, per exemple, que els músculs no tenen una cèl·lula "fundadora" en el desenvolupament.
C. elegans es va utilitzar per identificar la maquinària que regula la mort cel·lular programada en els vertebrats C. elegans línia de temps.
Desenvolupat per Sydney Brenner (1963) Mutants publicat per Brenner (1974) 1976 llinatges cel·lulars postembrionatics determinats (Sulson i Horwitz) 1983 determinat complet els llinatges de cèl·lules embrionàries (Deppe et al., Sulson et al.) 1982 "mort cel·lular programada" (Horwitz et al.) Premi Nobel Brenner, Sulson, Horwitz 2002 1986 Completa connectivitat de sistema nerviós establerta (White et al.) "La ment d'un cuc" 1991-1998 RNAi i miARN descobert en cucs. Premi Nobel: Foc, Mello 2006 1998 Primer genoma seqüenciat en animals (97Mb, ara 100.3Mb).
Això és sobre 1/30 la mida del genoma humà (3 Gb). C. elegans tenen al voltant de 17.500 gens, aproximadament la meitat dels éssers humans (30.000-40.000 gens). Va ser el primer animal en ser seqüenciat. Conèixer la seqüència permet que els gens d'interès es puguin clonar fàcilment. També es va obrir oportunitat per a l'aproximació genètica inversa.
La conservació de let-7 en tota la filogènia dels animals va mostrar que els microARN no són exclusius de C. elegans.
let-7 controla la transició-L4 a adult en C. elegans.
let-7 mutants no poden executar la transició-L4 a adult (les cèl·lules de costura no diferencien terminalment i continuen dividint), i morent per ruptura a través de la vulva.
Alineacions de les seqüències d'aminoàcids de citocrom c dels humans, D. melanogaster (dues isoformes) i de C. elegans.
Una característica útil de C. elegans és que és relativament senzill per a interrompre la funció de gens específics per ARN d'interferència (RNAi).
Silenciament de la funció d'un gen d'aquesta manera a vegades pot permetre que un investigador per inferir el que pot ser la funció d'aquest gen.
L'organisme també s'ha identificat com un model per a la dependència de la nicotina ja que s'ha trobat que exhibeixen respostes de comportament a la nicotina que són paral·lels als observats en els mamífers, incloent resposta aguda, tolerància, retirada, i sensibilització.
Anàlisi comparativa de Drosophila melanogaster i Caenorhabditis elegans experiments d'expressió de gens en els vols Europea Soyuz a l'Estació Espacial Internacional (és el títol d’una noticia) Funcions microARN en els animals i la malaltia: ARNi (ARN d'interferència) El RNAi és un procés evolutivament conservat de post-transcripcional silenciament de gens (PTGS) pel qual l'ARN bicatenari (dsRNA), quan s'introdueix en una cèl·lula, causa la degradació específica de seqüència de les seqüències d'ARNm homòlogues.
- - 1991 Fire et al. va mostrar que l'ARN antisentit pot inhibir l'expressió gènica quan s'injecta en cucs.
Però no sempre funcionava! 1991-1997 diversos treballs van mostrar que tant el RNA antisentit o sentit podrien interferir 1998 Fire et al. i el laboratori de Mello va mostrar que la combinació de sentit i antisentit treballant tot el temps en certs gens.
1998 L'efecte és post-transcripcional, la degradació potenciada de l’objectiu de la transcripció 1999 Primeres gens identificats per RNAi Essencial per al silenciament del transposó.
2000 Dicer enzim trenca precursors dsRNA de 21-23bp dúplex oligonuc.
Llinatge de cèl·lules postembrionaries es va completar primer En presència dels aliments, les divisions cel·lulars i reprendre el programa de desenvolupament postembrionari comença 3 hores després de l'eclosió. Una primera etapa de larva té aproximadament 671 cèl·lules, 113 se sotmeten a la mort programada en el curs del desenvolupament. Al voltant del 10% de les 558 cèl·lules restants en una larva recent eclosionades (51 en hermafrodites, 55 en mascles), són cèl·lules blàstiques que es divideixen encara més.
- Divisions - Migracions - Diferenciació - Mort Mutants que van interrompre la formació de la vulva: No vulva: cucs eclosionen dins Massa vulves Morfològicament, larves dauer són molt fines (amb una relació longitud-amplada d'aproximadament 30:1) i tenen un gruix de la cutícula alterada. La cavitat bucal està segellat per un bloc cuticular, les cèl·lules intestinals tenen un aspecte fosc i la faringe i lúmens intestinals són encongit, amb microvellositats petita i indistinta a l'intestí. La glàndula excretora no té grànuls de secreció, tot i que el porus excretor obert. La gònada del Dauer està detingut en l'etapa L2.
A dalt: el sistema nerviós de Caenorhabditis elegans, el cap a l'esquerra, marcat amb la proteïna verda fluorescent.
A baix: el cervell de C. elegans, amb diferents grups de neurones marcades amb proteïnes fluorescents de diferents colors.
...