MÒDUL 5 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Genòmica Humana
Año del apunte 2015
Páginas 29
Fecha de subida 19/04/2016
Descargas 23
Subido por

Vista previa del texto

MÒDUL 5. Anàlisi Genètica CROMOSOMES I HERÈNCIA: MITOSI I MEIOSI EL COMPLEMENT CROMOSÒMIC HUMÀ Tenim 23 parells de cromosomes: 2x = 46 Entre ells hi ha els 2 cromosomes sexuals: - Home: XY Dona: XX EL CARIOTIP HUMÀ Les característiques morfològiques dels cromosomes ens permeten identificar-los inequívocament.
Segons la mida i la posició del centròmer: - Grans, mitjans i petits Metacèntrics, submetacèntrics i acrocèntrics Per distingir els cromosomes més acuradament els tenyim en metafase amb la tinció de bandes G, que ens permet identificar el patró de bandes característic de cada cromosoma.
1 Podem ajudar-nos comparant el nostre cariotip amb un ideograma del cariotip humà, que és una representació ideal dels patrons de bandes dels cromosomes.
El patró de bandes a part d’ajudar-nos en la identificació dels cromosomes en el cariotip, també defineix regions gràcies a les quals podem posicionar els gens.
CROMOSOMES I DNA - Cromatina= ADN + histones + altres proteïnes estructurals El nostre genoma està format per 46 molècules de DNA, una per cada cromosoma (seran 92 molècules durant la mitosi, una per cada cromàtide) Les 46 molècules són lineals, comencen en un extrem i acaben en l’altre.
La llargada del cromosoma 1 humà és d’uns 10cm.
La molècula de DNA de cada cromosoma esta compactada de forma ordenada.
Cromosoma = cos que es tenyeix CICLE CEL·LULAR G2: 92 molècules de DNA; cada una formarà una cromàtide S: Replicació del DNA 46 molècules -> 92 MITOSI: 46 cromosomes amb 2 cromàtides -> 46 cromosomes amb una cromàtde G1: 46 molècules de DNA; provenen una de cada cromosoma al final de la mitosi MITOSI I MEIOSI Mitosi: manté la informació intacta; té lloc en les cèl·lules somàtiques Meiosi: Té com a finalitat la reducció de la dotació genètica i la creació de variabilitat genètica -> formació de cèl·lules gamètiques 2 ENTRECREUAMENT MEIÒTIC En la profase I els cromosomes homòlegs interaccionen íntimament i intercanvien informació.
- A l’inici de la profase I (quan el DNA encara no està compactat) els cromosomes homòlegs interaccionen i s’uneixen.
- Al final de la profase I la atracció es converteix en repulsió; els cromosomes homòlegs intenten separarse però queden units per diversos punts on han interaccionat anomenats quiasmes.
- Els cromosomes units pels quiasmes es col·loquen aparellats a l’equador de la cèl·lula en la metafase I, de manera aleatòria (no se sap cap a quin costat anirà cada cromosoma) - Finalment el fus mitòtic estira els cromosomes i es separen. El producte de l’entrecreuament pot diferir segons la manera com s’hagi produït la disjunció.
3 La recombinació no és un mecanisme cel·lular dissenyat per generar variabilitat, sinó que es tracta més aviat d’un dany col·lateral. La cèl·lula necessita garantir que cada parella de cromosomes homòlegs estan íntimament units per poder realitzar correctament la meiosi (ja que si algun cromosoma estigues suelto la cèl·lula no sabria cap a quin costat enviar-lo). Com a conseqüència d’aquesta forta interacció apareix la recombinació.
MÒDUL 5.1. Patrons d’herència en famílies humanes MENDELISME BÀSIC Mendel fou el primer en analitzar els resultats que obtingué en els seus experiments d’entrecreuament de manera matemàtica i obtingué unes regles sobre com es transmetia la informació genètica.
Les seues descobertes foren de gran importància perquè apareixia per primer cop el concepte de “paquets” d’herència, és a dir, unitats d’informació de les quals cada progenitor n’aporta una còpia. Fins llavors s’havia pensat que es produïa una mescla entre el pare i la mare: “herència líquida”.
Encreuament monohíbrid: Estudi de la pigmentació dels pèsols La partícula que condiciona el verd no desapareix, sinò que torna a aparèixer en la F3 Groc domina sobre verd Verd = patró recessiu 4 Encreuament dihíbrid: estudi de la transmissió de dos caràcters.
Mendel trobava excepcions que no sabia explicar -> caràcters lligats al mateix cromosoma CONCEPTE DE LOCUS I AL·LEL Locus: qualsevol lloc en el genoma o posició, pot ser d’un gen, un nucleòtid, una sequencia... (plural=loci) Al·lel: Diferents formes d’un locus.
P. ex. per un nucleòtid n’hi ha sempre 5 possibles: A, T, G, C, o bé ∅ 5 ***heterozigot compost: els dos al·lels són mutants però diferents.
Sistema al·lèlic: hi ha un locus que té molts al·lels possibles, cada un dels quals determina un fenotip observable Sistema no al·lèlic: hi ha molts loci amb molts possibles al·lels cada un, que determinen conjuntament un fenotip observable.
TIPUS DE PATRONS D’HERÈNCIA Segons la localització dels gens: - Autosòmica Lligat al cromosoma X Mitocondrial Segons la relació entre els al·lels (1 vs. 2) - Dominant 1>2 Recessiva 1<2 Codominant 1=2 (manifestació observable dels 2 al·lels) Intermèdia (dominància incompleta) 1~2 (barreja de les minifestacions que correspondrien a cada al·lel.
6 RELACIONS AL·LÈLIQUES: La relació entre al·lels no és específica de cada al·lel, sinò que s’ha d’especificar el context i respecte a que es compara.
P. ex.: anèmia falciforme (mutació beta globina) - Al·lel S: malalt Al·lel A: normal La malaltia només es manifesta com a tal en heterozigots -> patró recessiu (S<A) Pero, l’al·lel S determina resistència a la infecció del paràsit de la malària. Respecte a la resistència al paràsit, l’al·lel S és dominant A més, si analitzem l’hemoglobina dels individus, trobarem que els heterozigots en produeixen dels dos tipus, mutada i normal. Respecte a la posició de bandes en el gel d’electroforesi trobem un patró codominant.
PATRONS D’HERÈNCIA EN FAMILIES HUMANES En general per determinar el patró d’herència d’un caràcter realitzem encreuaments i analitzem les freqüències fenotípiques en la descendència.
En humans, ens trobem amb algunes dificultats: - No podem dissenyar els encreuaments: haurem d’analitzar encreuaments que s’hagin produït lliurement, i saber triar aquells que ens poden donar informació sobre el patró d’herència a estudiar.
- El nombre de descendents que tenen les famílies humanes es molt reduït, amb la qual cosa rarament obtindrem resultats estadísticament significatius. Per això haurem d’estudiar més d’una família.
A vegades ens podem trobar amb que hi ha més d’un patró possible per explicar una determinada família; en aquests casos fem una estimació probabilística i donem per vàlida l’opció mes probable, fins que trobem nova informació.
7 NOMENCLATURA I PEDIGRÍS HOME HETEROZIGOTS (per malaltia autosòmica recessiva) DONA DONA PORTADORA (en malaltia lligada al cromosoma X) PARELLA MORT PARES I FILLS (en ordre de naixement) BESSONS DIZIGÒTICS ABORT INDIVIDU ESTUDIAT BESSONS MONOZIGÒTICS SEXE SENSE ESPECIFICAR MÈTODE D’IDENTIFICACIÓ DE INDIVIDUS EN UN PEDIGRÍ NOMBRE DE FILLS DEL SEXE INDICAT INDIVIDUS AFECTATS PARELLA AMB CONSANGUINITAT PATRÓ AUTOSÒMIC DOMINANT EN ELS ENCREUAMENTS, ASSUMIM SEMPRE QUE ELS INDIVIDUS EXTERNS A LA FAMÍLIA SON HOMOZIGOTS PER L’AL·LEL NORMAL, JA QUE ES LA OPCIÓ MÉS PROBABLE AMB DIFERÈNCIA (A NO SER QUE ES CONTRADIGUI AMB LES DADES QUE TENIM). CAL TENIR EN COMPTE PERÒ L’ANAMNESI: ASSOCIACIONS D’AFECTATS… Per saber que un caràcter té un patró d’herència autosòmic, intentem refutar la hipòtesi de patró lligat al sexe.
Per exemple, sempre que observem que un pare pot transmetre la malaltia a un fill sabrem que no es tracta d’un patró lligat a l’X, i que per tant és autosòmic.
8 En un caràcter amb patró d’herència dominant, veurem que afecta totes les generacions i sovint diverses branques de la família.
Mai ho podem afirmar amb seguretat, però la probabilitat d’explicar aquest pedigrí amb un model recessiu és baixíssima.
P. ex. Hipercolesterolèmia familiar: La explicació més probable per aquest pedgrí és: - Patró autosòmic dominant Pare (individu assenyalat) heterozigot Per tant, la probabilitat de tenir qualsevol fill afectat d’aquest individu era 50% (ha tingut mala sort) Mutació de novo: En alguns casos, però, si que podem trobar-nos mutacions que han aparegut en la gametogènesi dels pares, de manera que els fills poden presentar mutacions que ells no tenien. Normalment serà de caràcter dominant, perquè una mutació de novo recessiva no la podríem detectar fenotípicament.
9 Mosaicisme en la línea germinal: Mosaicisme: Es dona quan en un individu coexisteixen poblacions de cèl·lules amb diferent genotip (per exemple quan existeix una porció de cèl·lules amb una mutació per una malaltia genètica i les altres sense la mutació.) El mosaicisme germinal és aquell que afecta les cèl·lules sexuals (òvuls i espermatozoides); per tant els individus que el pateixin tindran dues poblacions de gàmetes amb genotip diferent, p. ex., uns mutat i l’altre no. Així, pot ser que apareixin fills afectats d’una malaltia que no pugui ser detectada en cap dels progenitors.
Expressivitat i penetració del caràcter: Expressivitat: Grau d’expressió d’un determinat caràcter. Pot ser constant o variable.
P. ex. la manifestació fenotípica de la Neurofibromatosi tipus I pot anar des de petites taques en el cos a deformacions òssies Penetració: es un “concepte de tot o res”. Pot ser completa o incompleta.
*penetració completa: tots els individus mutants manifesten el caràcter.
*penetració incompleta: hi ha individus que tot i ser portadors d’una mutació dominant, per raons desconegudes no l’expressen. Podem graduar-la segons el percentatge d’individus que no manifestin el caràcter tot i tenir la mutació: 90% (el 10% no manifesten el caràcter), 80% ( el 20% no el manifesten)...
100% de penetració i expressivitat constant 100% de penetració i expressivitat variable 60% de penetració i expressivitat constant 60% de penetració i expressivitat variable 10 Anticipació: Algunes malalties presenten un major grau d’afectació a mesura que passen les generacions, com p. ex. la distròfia miotònica. El fenotip de l’àvia era mes lleu que el de la mare, que encara ho és més que el de la filla.
És un fenomen característic de les mutacions inestables -> increment del nombre de repeticions.
PATRÓ AUTOSÒMIC RECESSIU Casos d’una extensa família on de cop apareixen individus afectats (en una sola branca) -> els dos progenitors són heterozigots.
Consanguinitat: 11 Si observem el naixement d’un individu afectat d’una malaltia amb pares consanguinis, es reforça la hipòtesi recessiva -> la consanguinitat incrementa la probabilitat de que es trobin dos progenitors heterozigots.
Heterogeneïtat genètica: Pot ser que mutacions en diferents locus provoquin la manifestació de la mateixa malaltia, com p. ex. xeroderma pigmentosum. Una mutació en qualsevol dels gens que intervinguin en la reparació de les mutacions en el DNA produïdes per la radiació solar provocaria aquesta malaltia. Un altre exemple seria l’albinisme.
En aquest pedigrí veiem quatre families: - I-1 x I-2: pares heterozigots. Com que la malaltia es recessiva tenen alguns filla afectats (amb probabilitat 0.25) - I-3 x I-4: pares homozigots malalts -> tots els fills sortiran afectats - II-1 x II-2: igual que el primer cas, pares heterozigots.
- III-7 x III-9: com pot ser que dos pares afectats donin fills sans? -> heterogeneïtat genètica: La mare i el pare tenen els dos mutacions que provoquen la malaltia, però son diferents mutacions en diferents loci.
12 Mare: locus A Pare: locus B - A: normal - B: normal - a: mutat - b: mutat  Els fills surten heterozigots, -> cap surtirà afectat (100% sans) PATRÓ LLIGAT AL CROMOSOMA X - En homes hi ha una sola còpia, amb la qual cosa no té sentit parlar de patró dominant o recessiu. Són hemizigots -> qualsevol al·lel en el cromosoma X dels mascles es manifestarà.
- Les dones, en canvi, tenen 2 còpies del cromosoma X de manera que sí que s’estableixen relacions al·lèliques. Cal tenir en compte, però, que es produeix el fenomen d’inactivació del cromosoma X: Té lloc en les primeres etapes del desenvolupament embrionari, i de manera aleatòria s’estableixen territoris que expressen el cromosoma X matern i altres que expressen el patern.
p. ex: hemofília (comportament recessiu) Se sap que la secreció de factor de coagulació 8 si la meitat de les cèl·lules expressen el cromosoma normal és suficient, però el 5% de les dones tenen hemofília sent 13 heterozigot. Perque? Han tingut la mala sort que la majoria de les cèl·lules que fabriquen aquest factor expressen el cromosoma mutat i han inactivat el normal.
Regió pseudoautosòmica: Les regions dels extrems telomèrics son homòlogues en els cromosomes X i Y.
Aquestes regions no són silenciades en la inactivació del cromosoma X, amb la qual cosa tan homes com dones en tenim dues còpies funcionals.
Els gens situats en les regions pseuduautosòmiques es comporten amb patrons autosòmics, tot i trobar-se en el cromosoma X o Y.
Herència dominant lligada a l’X: Ex: raquitisme hiperfosfatèmic -> totes les dones portadores manifesten la malaltia (és poc habitual).
Herència recessiva lligada a l’X: La malaltia rarament s’expressa en dones portadores, tot i que podem trobar una lleugera manifestació deguda al fenomen d’inactivació del cromosoma X.
14 Ex: distròfia muscular de Duchenne Ex: hemofília CARÀCTERS LIMITATS O INFLUITS PEL SEXE (≠lligats al cromosoma X) Caràcters limitats pel sexe: Hi ha caràcters que només es poden donar en determinat sexe, com p. ex. Una patologia referent al desenvolupament de les mames.
Aquests caràcters no tenen perquè estar en els cromosomes sexuals.
Caràcters influits pel sexe: L’expressió d’aquests caràcters pot variar segons alguns factors hormonals relacionats amb el sexe -> la seva expressió es diferent en homes que en dones.
HERÈNCIA MITOCONDRIAL El mitocondrial té un cromosoma circular i el comportament propi d’una cèl·lula bacteriana -> divisió per bipartició.
Els mitocondris es reparteixen a l’atzar entre les cèl·lules filles en la meiosi.
El patró d’herència mitocondrial té una particularitat important, i és que l’aportació dels mitocondris i per tant del DNA mitocondrial la fa l’òvul (l’espermatozoide al fecundar l’òvul deixa els mitocondris fora) -> transmissió mare-fills.
Si la mare té mitocondris mutats: - Pot ser que tots els tingui mutats -> tots els fills rebran la mutació 15 - Pot ser que nomes tingui mutat un cert percentatge; llavors com que es reparteixen a l’atzar trobarem una gran heterogeneïtat en les manifestacions.
Si el pare té els mitocondris mutats -> fills sans Herència d’afecte matern: La informació que llegeix el zigot al principi és del RNA de la seva mare ( el que hi havia al citoplasma de l’òvul), ja que el seu nucli no ha tingut temps d’expressar els seus propis gens -> la informació genètica de la mare controla les primeres divisions de zigot.
Si hi hagués alguna mutació podria afectar al desenvolupament del fill.
MÒDUL 5.3. Variabilitat genètica La diferència entre els individus d’una espècie no sol estar en que tinguin o no un gen, en principi tots tenim tota la col·lecció de gens.
La variabilitat prové de quin al·lel hi ha en cada locus.
MECANISMES DE VARIABILITAT GENÈTICA Distribució aleatòria del material hereditari: - Segregació meiòtica:  Distribució aleatòria dels cromosomes  Entrecreuament -> crea noves combinacions de gens en un cromosoma 16 Canvis en la seqüència del DNA: - Canvis en la seqüència de bases:  Errors de replicació: la majoria La DNA polimerasa comet error en 1 de cada 3.500.000.000 nts. Tot i aquesta baixa taxa d’error, com que el genoma té 3.500.000.000 es produeix aproximadament 1 error per cada replicació.
-  Tautomeria de bases -> altera l’aparellament de bases Insercions, delecions i repeticions: reordenació del DNA  Errors de recombinació  Aparellaments no homòlegs  Inserció de seqüències exògenes: transposons i retrovirus MUTACIÓ VS. POLIMORFISME Les variacions en el DNA o mutacions poden provocar: - Canvis sense efecte (normalment en DNA no codificant o repetitiu) -> es transmeten a les següents generacions i adquireixen una freqüència important.
Anomenem polimorfisme les variacions en la seqüència amb freqüència superior a 1%.
- Canvis amb efecte (normalment en introns o exons) -> causen patologies i es caracteritzen per tenir una freqüència baixa en la població.
VARIACIONS POLIMÒRFIQUES DEL DNA - - Variacions d’un sol nucleòtid (SNP): aprox. cada 300-500 nt del nostre genoma.
Poden tenir 5 al·lels: A, T, G, C o ∅; a la pràctica la majoria dels SNP són bial·lèlics -> 3 genotips possibles: o Homozigot per l’al·lel 1 o Homozigot per l’al·lel 2 o Heterozigot 12 Insercions o delecions de pocs nucleòtids (desenes)-> hi ha 2 al·lels possibles: inserció o deleció. Per tant, 3 genotips possibles: o Homozigot per inserció o Homozigot per deleció 17 - o Heterozigot Polimorfismes de repetició: seqüències de DNA repetides, on varia el nombre de copies. Hi sol haver múltiples al·lels.
 VNTR i minisatèl·lits (tàndems de repetició localitzada; VNTR= variable number of tandem repeats): Blocs de repetició grans, de milers de nucleòtids.
Provenen de la inserció de seqüències virals i es troben fonamentalent en regions telomèriques o centromèriques.
 - Microsatèl·lits (tàndems de repetició dispersa): pocs nucleòtids-> di, tri, tetra, penta nucleòtids.
Són més freqüents en telòmers i centròmers però també es poden trobar en la resta del genoma.
Tenen una densitat molt baixa: cada centenars de milers de nt.
Són sistemes polial·lèlics -> tenen molts al·lels segons el nombre de repeticions-> la capacitat discriminativa entre la població és major.
Poden ser utilitzats per la identificació genètica dels individus: proves d’ADN (la probabilitat de que dues persones tinguin les mateixes repeticions es baixa) Variacions en nombre de còpies (CNV= copy numbre variants): inserció/deleció de seqüències gegantines, que poden incloure gens complets. El nombre de copies pot variar: o 0 còpies: falten gens o 3 còpies: sobren gens Es van identificar fa 7-8 anys i tenen correlació amb malalties complexes: alteracions mentals...
MÈTODES DE DETECCIÓ DE VARIABILITAT EN EL DNA - Efectes mesurables:  Canvis de l’estructura primària -> llargada de la seqüència...
 Canvis en les propietats fisicoquímiques -> capacitat per hibridar de la seqüència: si no son del tot complementàries no hibridaran tan bé.
- Mètodes i procediments:  Enzims de restricció Tallen seqüències Concretes 18  La separació electroforètica o Agarosa o Poliacrilamida  Detecció per hibridació P. ex. Southern Blot: <- Es fa hibridar els fragments de DNA amb una sonda fluorescent: aquells que siguin complementaris seran detectats.
 Amplificació enzimàtica del DNA -> PCR Exemple: polimorfismes de mida dels fragments de restricció (RFLP = restriction fragment lenght polimorfism)-> primer polimorfisme descobert del tipus SNP.
El canvi polimòrfic altera la diana per un enzim de restricció.
1- Amplifiquem la seqüència on hi ha la mutació (PCR) 2- Afegim l’enzim de restricció i deixem que talli el DNA.
3- Electroforesi en gel d’agarosa: SITUACIÓ A: o Individu 1-> homozigot - : talla el fragment normal 19 o Individu 2 -> heterozigot : un te el polimorfisme i talla un fragment mes curt, i l’altre de mida normal o Individu 3 -> homozigot + : es tallen els dos amb mida mes curta Aquesta tècnica també es pot fer sevir per detectar delecions: SITUACIÓ B: o Individu 1-> homozigot - : fragment de mida normal o Individu 2 -> heterozigot : un es talla normalment i l’altre al tenir la deleció dona un fragment mes curt o Individu 3 -> homozigot + : es talla en els dos casos un fragment mes curt Exemple: extensió de primers -> s’utilitza per la caracterització massiva de llocs polimòrfics 1- Amplifiquem la regió on hi ha el polimorfisme 2- Dissenyem un primer de la següent manera (A = polimorfisme) …ACTGTATCCTA… Primer Sequencia TGACA 3- Afegim nucleòtids modificats -> marcats amb flourocroms diferents • ddGTP: groc • ddTTP: verd • ddATP: blau • ddCTP: vermell 4- Creem les condicions per tal que la DNA polimerasa fabriqui mes cadena a partir del primer. Només podrà unir un nucleòtid ja que els dd nucleòtids no permeten seguir amb la síntesi.
Aquesta tècnica permet identificar molts polimorfismes diferents, afegint un primer per a cada un.
Exemple: Variacions VNTR multilocus -> permet la identificació genètica dels individus mitjançant la identificació d’una col·lecció de repeticions microsatèl·lit.
20 - Mitjançant una sonda multilocus podem detectar diversos polimorfismes en el genoma d’un individu, obtenint l’anomenada “DNA fingerprint” característica de cada persona.
Abans es feia analitzant els polimorfismes d’un en un, però tenia poca capacitat resolutiva ja que la probabilitat de que hi haguessin coincidències depenia de la freqüència del polimorfisme en la població.
APLICACIONS.
PROVES DE PATERNITAT: 21 CRIMINALISTICA: MÒDUL 5.4. Cartografia del genoma humà.
El genoma és un món d’1 dimensió -> cada molècula de DNA és lineal ***La distància entre elements situats en diferents cromosomes = infinit MAPATGE FISIC Existeixen diferents tècniques que s’han utilitzat per intentar localitzar els gens als cromosomes: 1) Digerim la seqüència a mapar amb diferents enzims de restricció i mirem les seqüències obtingudes -> intentem localitzar les dianes al genoma 2) Cariotip -> el patró de bandes ens ajuda a posicionar elements ja que delimita regions en el cromosoma.
3) Obtenció d’híbrids somàtics -> fusió de 2 cèl·lules o Una cèl·lula prové d’un ratolí amb una mutació que li provoca una deficiència enzimàtica: no pot produït timidina; per tant només podrà sobreviure en un medi de cultiu ric en timidina o L’altra cèl·lula es humana (fibroblast o bé limfòcit) o Permeabilitzem la seva membrana amb DMSO i fusionem les dues cèl·lules per obtenir híbrids binucleats.
22 o Els fem créixer en un medi de cultiu sense timidina de manera que només sobrevisquin les cèl·lules híbrides - Els limfòcits moriran perquè tenen vida curta - Les cèl·lules de ratolí moriran perquè no tenen timidina.
o Les cèl·lules híbrides es reprodueixen i van perdent aleatòriament els cromosomes humans -> arriba un moment que s’estabilitza i ja no es perden més cromosomes o Col·loquem una cèl·lula híbrida en cada pouet i deixem que es divideixin - Algunes moren - Les que sobreviuen formen grups de clons -> cada grup ha perdut diferents cromosomes o Tots els grups tindràn un cromosoma en comú: el gen de fabricar la timidina (si no haurien mort) -> podem concluir que el gen de la tirosina quinasa estarà en el cromosoma que tots tinguin en comú.
Amb aquesta tècnica podem localitzar gens d’altres enzims de la mateixa manera:  Caracteritzem la dotació cromosòmica de cada clon  Comparem amb l’activitat enzimàtica de l’enzim a estudiar 23 4) Chromosome sorting: Fem passar una suspensió de cromosomes per un detector de mida -> obtenim una col·lecció de tubs on hi ha cada cromosoma segons la mida.
Podem saber si un gen està al cromosoma mirant si està en el tub 5) Tècnica d’hibridació “in situ” (FISH): es duu a terme mitjançant sondes fluorescents, que ens permeten localitzar una seqüència determinada en un cromosoma.
La sonda hibrida i s’uneix al punt del cromosoma on hi ha la seqüència -> el podem veure al microscopi.
6) Seqüenciació: és el mètode més actual de tots. Permet obtenir la seqüència de bases exacta d’una determinada regió de DNA.
CARTOGRAFIA GENÈTICA.
Basada en la recombinació genètica. Conceptes: - 2 gens estan lligats quan es transmeten conjuntament 2 loci son sintènics quan es troben en la mateixa molècula de DNA -> poden estar o no lligats, dependrà de la distància que els separi 2 gens no sintènics mai estaran lligats, són independents Sintènics Sintènics Lligats Independents 24 La distància genètica consisteix en la mesura de la distància entre dos loci en base a la freqüència en que té lloc recombinació entre ells.
Per a que la recombinació sigui observable ha de tenir lloc en individus doble heterozigots -> heterozigots per als 2 loci que volem estudiar, p. ex AaBb Si el doble heterozigot s’aparella amb un doble recessiu podrem observar la recombinació en la descendència (encreuament prova: AaBb x aabb) -> els fills permetràn veure les recombinacions i calcular-ne la freqüència o Gens independents:  50% combinacions dels progenitors: AaBb o aabb  50% combinacions noves: aaBb o Aabb o Gens lligats:  100% combinacions dels progenitors: AaBb o aabb o Entre mig -> gens lligats pero suficientment separats per a que de tant en tant pateixin recombinació  combinacions dels progenitors: 50-100% -> 1-θ  combinacions noves: 0-50 % -> θ Així, segons la freqüència de recombinació podem determinar el grau de lligament de dos gens, i per tant la distància genètica que els separa.
θ = “theta” = Freqüència de recombinació (de 0 a 50 -> no existeix freqüència de recombinació major de 50) 1 unitat de mapa = distància entre dos marcadors que presenten un 1% de recombinació Unitat de distància genètica -> “centi Morgan” Cm 1 cM= 1% de recomb. -> aprox. 1.000.000bp 1cM (distància genètica) = 1 Mb (distància física) -> la relació entre distància genètica i distància física no es lineal: la igualtat només es compleix a freqüències de recomb.
baixes.
Perque? A mesura que augmenta la distància física poden tenir lloc més d’una recombinació -> nombre parell de recombinacions no són visibles perquè es compensen -> perdem la linealitat (serà lineal mentre només hi hagi un esdeveniment de recombinació).
Podem calcular la distància genètica entre dos marcadors que estiguin molt lluny sumant la distància entre petits intervals que si siguin lineals.
25 En qualsevol encreuament, els individus recombinants seran els menys freqüents.
Fases dels al·lels: - Quan dos al·lels normals o mutats estan junts, els individus es troben en fase d’acoblament. En aquest cas, els individus recombinants seran els que no s’assemblin als progenitors.
- En cas contrari, si els al·lels mutats es troben en cromosomes diferents, estaran en fase de repulsió. Els individus recombinants seran aquells que tinguin la mateixa dotació genètica que els pares.
Si tots els fenotips són igual de freqüents -> gens no lligats Si només apareixen 2 fenotips -> gens totalment lligats Si apareixen uns fenotips menys freqüents -> lligament amb recombinació ANÀLISI DEL LLIGAMENT EN FAMILIES HUMANES Per realitzar càlculs de distància genètica en famílies humanes disposem d’algunes limitacions:   Baix nombre de descendents No es possible el disseny d’aparellaments 26 Per això fem servir el mètode Lod Score, basat en una relació de probabilitats, que ens ajuda a determinar si una família té mes probabilitats de ser explicada si els loci estan lligats o si son independents.
Es calcula de la següent manera: Com que el Lod Score és un valor logarítmic, podem sumar el de diverses famílies per obtenir un resultat estadísticament significatiu -> per tal que dos gens es considerin lligats ha de ser major de 3.
- Quan Lod score =3 -> log (RP) = 3 -> RP =103 =1000 -> la probabilitat de la familia explicada asumint lligament és 1000 vegades més gran.
Exemple: 27 Exemple: Al·lels del polimorfisme: 1, 2 Al·lels de la malaltia: N, D - Probabilitat de la família assumint que els locus son independents: Pare: N│D 1│2 Pare: Mare: N 1 Mare: N│N 1│1 N1 1/4 N2 1/4 D1 1/4 D2 1/4 La probabilitat de tots els fills que tinguin: ¼ Probabilitat total: (1/4)5 - Probabilitat de la família assumint lligament: Dibuixem l’haplotip: conjunt d’al·lels que es transmeten junts Mare: N N 1 1 Pare: N D o bé N D 1 2 2 1 FASE 2 FASE 1 ? -> No ho podem saber 28 <- El gràfic ens dona Z= 0.12 per a θ= 0.2. És a dir, assumint un 20% de recombinació obtenim un Lod score de 0.12. Es tracta d’un valor molt baix, per això necessitaríem informació sobre els avis paterns per tal de poder descartar una de les dues fases i obtenir una major probabilitat. Els valors de Lod score amb només una fase serien: Els resultats seguirien sense ser concloents, amb la qual cosa necessitaríem analitzar més famílies amb la malaltia.
29 ...