Tema 11 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 Tema 11. Cultius d’òrgans ELECCIÓ DEL MODEL D’ESTUDI Sovint, quan cultivem les cèl·lules en monocapes canvien el seu comportament en relació al teixit originari. És per aquest motiu que molts investigadors treballen amb cultius tridimensionals, per tal de veure com es comporten realment les cèl·lules i per regenerar teixits que funcionen malament.
Es pot acceptar la distribució cel·lular d’un teixit, explanant-lo i mantenir-lo en cultiu, o bé és poden purificar i propagar determinats llinatges, estudiar les seves interaccions i recombinar-los per estudiar les interaccions mútues. Aquestes aproximacions han dut a tres tipus principals de tècniques:  Cultius d’òrgans. En aquest tipus de cultius agafem un fragment d’un teixit i el mantenim viu sota les condicions òptimes per tal de realitzar l’experimentació. És un cultiu amb un temps curt i la major part d’anàlisi que es poden fer són del tipus histològic.
 Cultius histiotípics. En aquest tipus de cultius partim de cèl·lules d’una línia cel·lular i les cultivem en una estructura tridimensional per tal que adoptin conformacions que no són capaces d’adoptar en monocapa.
 Cultius organotípics. El fonament d’aquest tipus de cultiu és el mateix que l’anterior però combinant diferents línies cel·lulars.
Hem de tenir present que aquesta nomenclatura en els cultius no està establerta, és a dir, no hi ha unanimitat en la comunitat científica. Nosaltres farem servir la explicada anteriorment.
Veiem un esquema que fa referència a cultius histiotípics i organotípics. Imaginem que agafem un tros de pèl i obtenim diferents tipus cel·lulars que els podem separar en poblacions diferenciades. Si cadascun d’aquests tipus els cultivem en una matriu tridimensional podem elaborar cultius histiotípics, amb una única línia cel·lular, o bé cultius organotípics si expandim més d’una línia.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 CULTIU D’ÒRGANS Factors a considerar en els cultius d’òrgans Disponibilitat dels nutrients i intercanvi de gas L’arquitectura del teixit i l’absència d’un sistema vascular limiten la mida. En monocapes, la difusió de gasos i nutrients és ràpida. En canvi quan es formen agregats de 250 μm (unes 5000 cèl·lules), la difusió és difícil. En agregats d’1 mm de 5 diàmetre (2.5 x 10 cèl·lules) apareix necrosi central. Per alleugerir el problema, els cultius d’òrgans es solen posar a la interfase entre les fases líquida i gasosa, per facilitar l’intercanvi de gasos retenint l’accés als nutrients.
Integritat estructural S’intenta mantenir l’associació de les cèl·lules en el teixit i la comunicació entre elles: unions gap, molècules d’adhesió, factors paràcrins. La senyalització és important durant la organogènesi, però també pel manteniment dels teixits madurs.
Creixement i diferenciació Hi ha relació entre creixement i diferenciació. En general les cèl·lules diferenciades no tenen capacitat proliferativa o aquesta és petita i sovint limitada a les capes més externes del cultiu d’òrgans.
Limitacions del cultiu d’òrgans L’anàlisi dels cultius d’òrgans són principalment histològics. La reproducibilitat és més difícil entre mostres de cultius d’òrgans que entre mostres de línies cel·lulars. La preparació del cultiu pot variar tant la geometria com els percentatges dels diferents tipus cel·lulars que el formen.
Procediment en un cultiu d’òrgans Per cultivar òrgans es fan servir unes plaques que tenen un anell exterior que omplim, normalment, de líquid tipus medi de cultiu o bé solució salina. En el centre hi ha un cercle que és on realment cultivarem el fragment de teixit. Per tal de fer això cal que hi hagi medi de cultiu i una membrana sobre la qual dipositem el teixit, d’aquesta manera aconseguim que estigui sucat en medi però que no suri.
Amb això s’afavoreix l’intercanvi gasós i mantenim el teixit en unes condicions que permeten que continuï viu. L’anell extern el posem perquè en aquestes circumstàncies, una petita disminució en el medi provocaria que el teixit ja no estigués en contacte amb ell i per tant que morís; així doncs el medi de l’anell extern ens permet restablir el límit del medi del cercle intern.
En cultius d’òrgans ens interessa mantenir viu el teixit per poder treballar sobre ell. En aquest cas no ens interessa expandir-lo.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 A la imatge següent veiem representat com s’agafa un fragment d’un teixit i es diposita sobre una membrana en la qual el teixit està en contacte amb el medi. Veiem que l’anomenen cultiu organotípic però per a nosaltres és un cultiu d’òrgans.
Això és degut que la nomenclatura utilitzada és diferent.
CULTIUS HISTIOTÍPICS En els cultius histiotípics, cèl·lules d’una línia cel·lular es fan créixer en una matriu tridimensional a densitats elevades.
Aquest tipus de cultius han permès regenerar arquitectures similars a les d’un teixit a partir de cèl·lules d’un cultiu en monocapa.
Per exemple, l’any 1978 Green i Thomas van mostrar que els keratinòcits humans formen estructures similars als dermatoglifs si es mantenen varies setmanes sense subcultivar. L’any 1980 Folkman i Haudesnchild varen demostrar la formació de túbuls capil·lars en cultius de cèl·lules endotelials vasculars en presència del factor de creixement endotelial i en medi condicionat per cèl·lules tumorals.
Observem una imatge de cèl·lules endotelials a les quals si els hi afegim un factor de creixement comencen a agregar i formar estructures buides pel centre, semblants als capil·lars. Això ens demostra que si una línia cel·lular està sota els estímuls adients és capaç de formar estructures diferents a les que trobem en els organismes.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 Cultius en gel i esponges Esponges de cel·lulosa, recobertes de col·lagen o Gelfoam, permeten la penetració i colonització per part de cèl·lules.
Permeten la morfogènesi d’estructures epitelials primitives. Per exemple, les cèl·lules d’epiteli mamari formen estructures rudimentàries, tant tubulars com glandulars.
La línia cel·lular MDCK que prové de ronyó de gos, quan la introduïm en una estructura que conté col·lagen, comencen a agrupar-se i formar una mena de tub amb una matriu extracel·lular (làmina basal). Formen una estructura molt similar a la de les glàndules.
Esferoides Quan cèl·lules dissociades es cultiven en un agitador giratori, poden reassociar-se en grumolls que s’han utilitzat com a models de resposta in vitro a tractaments de quimioteràpia i d’invasió. Els esferoides es formen amb més facilitat utilitzant línies cel·lulars transformades que cèl·lules de tumors primaris.
Per tal d’induir a les cèl·lules a formar esteroides les podem cultivar mitjançant el mètode de la gota penjant.
A la imatge veiem que les cèl·lules que estan a l’exterior i a l’interior adquireixen rols diferents i formen estructures diferenciades.
Perles d’alginat Polímers d’alginat permeten la formació d’estructures esfèriques en que les cèl·lules queden atrapades però formant estructures 3D. Els polímers es fan primer barrejant l’alginat sòdic amb les cèl·lules d'interès, i després posant gotes de la barreja en una solució de gelificació (CaCl2). Les cèl·lules creixen i formen estructures 3D. El que tenen de bo aquestes perles és que les cèl·lules queden dins i per tant estan protegides, a més, com que l’embolcall es tracta d’un sucre, té permeabilitat a nutrients i a l’intercanvi gasós.
Entre les possibles aplicacions d’aquesta tècnica, està la producció i secreció a l’organisme de proteïnes d’interès per alleugerir malalties. L'encapsulaven en l’alginat podria protegir les cèl·lules de l’acció del sistema immunitari.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 Cultius en pouets amb filtre (Filter well inserts) Aquest es un del tipus de cultius que més s'han utilitzat. Consisteixen en uns pouets per cultivar que enmig tenen una membrana que permet separar dos medis (superior i inferior). Hi ha de moltes mides i es poden utilitzar per moltes coses.
Filter wells Aquest mètode s’ha utilitzar per identificar estructures i identificar determinats tipus cel·lulars que tenen característiques metastàtiques. A la imatge veiem una membrana on a la part inferior s’han cultivat cèl·lules. A la part superior s’afegeixen substàncies que atrauen a la cèl·lula a créixer en aquest medi. Aquest fet ens permetrà veure si les cèl·lules tenen tendència a envair altres teixits i per tant que siguin metastàtiques.
També ens permet veure si els cèl·lules són capaces de captar una determinada molècula in transportar-la. En aquest sentit hi ha sistemes patentats i que s’utilitzen, bàsicament, quan es desenvolupa una droga per tal de veure si quan es pren de manera oral serà absorbida. Se sap que els cultius que es fan en monocapa de cèl·lules epitelials són molt similars als que es formen a l’epiteli intestinal i per tant s’estudia si aquestes cèl·lules són capaces d’absorbir la droga.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T11 CULTIUS ORGANOTÍPICS Els tipus de cultius descrits en l'apartat anterior han permès un ràpid desenvolupament del que anomenem cultius organotípics, on diferents tipus cel·lulars es barregen a diferents proporcions i adopten estructures similars als teixits.
A la imatge podem veure que hi ha diferents maneres d’elaborar cultius organotípics i utilitzarem uns o altres en funció del que ens interessi. Per exemple, podem tenir les dues línies cel·lulars en contacte, o bé que entre elles hi hagi matriu extracel·lular, etc.
Per exemple, s’han generat estructures similars a la pell; inicialment es feien cultius de queratinòcits (cultius histiotípics) però hi havia més possibilitats de rebuig. Amb el temps es va veure que s’aconseguia una estructura similar a la pell mitjançant un cocultiu de dermis i epidermis amb la intervenció d’una capa de col·lagen o de fibroblasts de la dermis incorporats al col·lagen. En aquest cas el creixement no era més ràpid però la regeneració de la pell sí.
6 ...