Bloc I A (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2017
Páginas 15
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 1. ELS MICROORGANISMES És la ciència que estudia els microorganismes (organismes de mida <0,1 mm). Van ser els primers organismes vius capaços de colonitzar la superfície terrestre fa 3M d’anys i tenen un metabolisme compatible amb les condicions terrestres. Són organismes unicel·lulars amb una gran diversitat acumulada als àcids nucleics i poden colonitzar qualsevol altre ésser viu o hàbitat de la Terra perquè són capaços de créixer en: - Temperatures inferiors a 0ºC (psicròfils) o superiors a 100ºC (termòfils) pH de 1 a 12 Concentracions de sal saturades Pressions superiors a 1300 bar Medis radioactius de fins 5 megaradis (10.000 vegades més que l’home) Són organismes petits, per tant, tenen una taxa metabòlica molt alta ja que a mesura que disminueix la mida cel·lular augmenta la relació superfície/volum, cosa que facilita un major intercanvi de nutrients, per tant, són organismes que creixen molt ràpidament.
A diferència dels animals o plantes, les cèl·lules de microorganismes poden créixer aïlladament (nodrir-se, obtenir energia i reproduir-se) perquè són molt versàtils: s’ajusten a condicions ambientals molt diferents. Per exemple, Escherichia coli, que viu al tracte intestinal, pot viure malgrat la diferent concentració de nutrients que hi tenim quan mengem i quan fa molta estona que no mengem, cosa que un animal no podria fer ja que altes concentracions de nutrients podrien ser tòxiques i en baixes concentracions es moriria.
Estableixen relacions simbiòtiques amb benefici mutu, neutres o que provoquin lesions a l’organisme colonitzat. Per exemple, alguns microorganismes aprofiten el N2 atmosfèric i el transformen en amoni que pot ser utilitzar per altres éssers vius mitjançant una reacció de fixació del nitrogen. Quan aquests creixen a les arrels de les plantes, l’amoni és captat pel vegetal i li permet sobreviure en sòls pobres en nutrients. També hi ha bacteris a l’estómac dels remugants que ajuden a digerir la palla.
Els microorganismes són els organismes vius més abundants a la Terra tant al medi terrestre (1x1023) com a l’aigua (1x1024). Aquests microorganismes tenen metabolismes molt diversos que ens permeten obtenir antibiòtics, proteïnes humanes com la insulina..., vi i cervesa per fermentació, làctics...
Els microorganismes es classifiquen en: - ESTRUCTURES ACEL·LULARS: no són veritables cèl·lules Virus: són paràsits intracel·lulars obligats que poden infectar qualsevol tipus de cèl·lula. Formats per un àcid nucleic (RNA o DNA) que pot ser de diverses formes i està envoltat per una capa proteica anomenada càpsida.
Generalment tenen una única còpia dels seus gens (haploides) excepte els retrovirus que són diploides. Són metabòlicament deficients, depenen d’una cèl·lula per replicar-se on els nous virus es formen a partir d’elements preformats que s’uneixen posteriorment seguint una simetria helicoïdal (allargada en espiral) o icosaèdrica més o menys complexa; els virus complexes són els que tenen els dos tipus de simetria.
Microbiologia I Silvia Expósito Els virus poden tenir diferents estructures proteiques però totes elles amb una funció. En el cas del bacteriòfag, té unes estructures que li serveixen per introduir el material genètic a l’interior de la cèl·lula a través d’un cilindre i ajudat per unes estructures de fixació. Tot això ho necessita perquè la paret del bacteri és més resistent que la d’una cèl·lula animal o vegetal.
Els virus poden tenir també un embolcall al voltant de la càpsida on s’han introduït una sèrie de proteïnes víriques (això només es dóna en el cas de virus animals) i a l’exterior de l’embolcall també s’hi poden trobar vàries projeccions (estructures proteiques) amb varies funcions però que normalment són llocs d’unió a la cèl·lula animal, al receptor.
Hi ha dues etapes en la replicació: - Extracel·lular: no hi ha replicació, el virus té capacitat infectiva i està constituït per tots els seus elements (és una partícula viral completa), en aquest estat s’anomena VIRIÓ i està format per l’àcid nucleic i la càpsida i poden tenir proteïnes de replicació o un embolcall extern amb proteïnes inserides anomenades peptòmers. El virus és inert i es manté fora de la cèl·lula sense activitat.
- Intracel·lular: hi ha replicació, el virus només està format per l’àcid nucleic que pot iniciar la replicació per formar més partícules virals o pot inserir-se als cromosomes i mantenir-s’hi en forma de PROVIRUS, s’anirà replicant a mesura que la cèl·lula hoste repliqui els seus cromosomes fins que un factor extern provoqui l’inici de la replicació.
Quan es formen les noves partícules víriques ho fan per un procés d’ensemblatge dels elements que es van formant. Per formar la càpsida helicoïdal, per exemple, es formen les subunitats que tenen com forma de dònuts i després es van acoblant; i en el cas de la simetria icosaèdrica primer es forma cada cara per separat.
Prions: constituïts exclusivament per proteïnes. Són partícules infeccioses en animals produint malalties degeneratives al SNC. Molt més resistents als tractaments enzimàtics per degradar les proteïnes que una proteïna normal, són formes modificades de l’estructura d’una proteïna que es troba a la membrana de les neurones i està implicada en la sinapsi (en la proteïna priònica hi predominen les làmines β i en la proteïna normal les α). Causants de la malaltia de les vaques boges.
Viroides: constituïts per RNA de cadena simple i circular que pot adoptar unes formes característiques, causen infeccions exclusivament en vegetals.
Microbiologia I Silvia Expósito Virusoides: són virus defectius, els hi manca algun tros de l’àcid nucleic, per tant, els hi falta alguna propietat. Han d’unir-se a un altre virus per replicar-se a una cèl·lula hoste, per ells sols no poden a excepció de que la cèl·lula ja hagi estat infectada prèviament amb el mateix virus perquè en aquest cas s’estableix una complementació. Ex: virus de l’hepatitis B que s’associa amb el C.
- ESTRUCTURES CEL·LULARS: poden tenir una estructura de cèl·lula eucariota o procariota diferenciades per la presencia o no d’un nucli que contingui el material genètic.
Procariotes: organismes molt més senzills, no tenen membrana que envolti els orgànuls, tenen ribosomes i estructures membranoses, una capa citoplasmàtica i una paret cel·lular exclusiva dels procariotes que els serveix com a protecció davant del medi. Hi trobem els bacteria i els arquea. Els bacteris són els procariotes típics, els arquea tenen algunes característiques d’eucariotes com ara el tipus de lípid de la bicapa però a diferència dels eucariotes, que tenen una estructura d’àcids nucleics en forma de cadena de DNA amb els gens ordenats i sense introns, els arquea sí que tenen introns però l’estructura és molt semblant.
Eucariotes: tenen nucli i una membrana que l’envolta, nucleoide i orgànuls envoltats per una membrana cadascun (entre ells mitocondris i plasts), també tenen una membrana unitària i doble lipídica.. En formen part els protozous, les algues i els fongs.
Els bacteris tenen tres formes bàsiques estructurals: cocs (rodons), bacils (allargats) i en espiral però també poden formar estructures més complexes o agrupacions com filaments, quadrats...
i tenen propietats tant del regne animal com del vegetal.
Al 1896, Heckel va proposar un nou regne anomenat PROTISTES que incloïa elements molt senzills amb poca diferenciació morfològica unicel·lulars i també els pluricel·lulars que no formessin teixits (independents), els va separar en inferiors i superiors perquè es va adonar que dins del grup hi havia microorganismes molt més senzills que d’altres.
Al 1960 hi ha una nova classificació dels organismes vius descrita per Whittaker, va proposar 5 regnes: MONERA (exclusivament procariotes, equivalent als protistes inferiors de Heckel), PROTISTES (estructures eucariotes, equivalent als protistes superiors de Heckel), ANIMALS, PLANTES I FONGS. Aquesta classificació estava basada en l’estructura cel·lular gràcies a l’aparició del ME que permet observar l’estructura interna. Així, els microorganismes es trobaven inclosos en 2 regnes: monera i protists. Whittaker també va proposar anomenar aquets organismes amb un nom binomial com el de les plantes de Linné i així van començar a tenir noms més lògics.
Microbiologia I Silvia Expósito Més tard, Woese va establir una nova classificació de tots els organismes vius de tipus filogenètica, és a dir, basada en la relació dels organismes vius actuals amb els seus ancestres.
Dels microorganismes no es disposa de registre fòssil però aquesta classificació és possible gràcies a que contenen molècules que han patit molt pocs canvis ja que duen a terme funcions molt elementals, sobretot el gen que codifica per el RNAr 16S en procariotes i el 18S en eucariotes. Els canvis que pateixen les molècules són proporcionals a l’evolució de l’individu, aquests gens es diu que es comporten com un rellotge molecular i són els que permeten establir la classificació filogenètica.
Per establir aquesta relació, s’aïlla i s’analitza la seqüència genètica i s’estudien les similituds o diferències. Es va observar que dins dels procariotes hi ha dues divisions molt diferents: els bacteria i els arquea, que els eucariotes més petits tenen orígens molt diferents, que els animals i les plantes tenen el mateix origen i que el mitocondris i els plasts tenen origen bacterià (endosimbiòtic). Abans de la classificació filogenètica ja es sabia que el DNA mitocondrial era molt diferent del nuclear.
Aquestes diferències entre procariotes i eucariotes estan reflexades en altres característiques com membrana cel·lular, existència de membranes citoplasmàtiques, presència d’orgànuls o citoesquelet i microtúbuls (es creu que algun bacteri té microtúbuls), número de cromosomes, organització dels gens dins d’aquests cromosomes (introns que bacteris no tenen però si les arquees).
 Historia de la microbiologia: Les malalties infeccioses, símptomes i característiques es van conèixer molt abans de saber quin microorganisme les causava en animals i plantes. Hi ha representacions egípcies on es representa un individu amb símptomes clars d’haver patit la poliomielitis (1500 aC), una altra seria la verola (única malaltia infecciosa eradicada a nivell mundial) que produeix lesions a la pell i es van veure conservades a la mòmia d’un faraó egipci (1200 aC); malalties molt comuns sobretot a països orientals. Van arribar a Europa al començament de la era cristiana i aquestes malalties tenen una gran transcendència en la historia de diversos països o imperis.
Altres malalties importants: xarampió, pesta  va arribar a Europa cap al s. XIII-XIV amb les caravanes que importaven productes d’Àsia com pells que portaven el bacteri responsable de la malaltia que va acabar amb ¼ de la població europea.
Microbiologia I Silvia Expósito També es van produir els primers intents d’intentar controlar aquestes malalties infeccioses com el procés de veriolització  dut a terme als països orientals per combatre la verola, immunitzaven a la població introduint a una ferida a la pell de persones sanes restes de pústula de la verola, algunes morien però es van salvar moltes persones. Aquest procés també arriba a Europa més tard.
Jenner, un metge anglès, va ser el que va elaborar la primera vacuna contra la verola. Vivia en una zona rural i va veure que les persones que estaven amb vaques que també patien la malaltia contreien una forma de verola molt més lleu i mai morien. Se li va acudir que podia ser una verola més suau i va fer com en la veriolització però amb el virus de la vaca. Primer va posar a una persona en contacte amb el virus de la vaca, i en un segon cop la va posar en contacte amb el virus de la verola humana i va comprovar que aquesta vegada no patia la malaltia. Cal dir que va estar de sort en que aquestes dues veroles eren creuades i si se’n patia una no es podia patir l’altre, cosa que no passa sempre. Malgrat tot, va ser d’aquí d’on va sortir el nom de “vacuna”, de la vaca.
Les malalties infeccioses eren considerades un càstig diví i s’ignorava totalment l’origen biològic, el primer que va citar que les malalties es podien produir per elements invisibles va ser J.
Francastorius al 1546 i el descobriment d’aquests elements serà paral·lel al descobriment de lents que els permetin observar.
Van Leeuwenhoeck construïa lents, va crear un microscopi simple, principalment per observar teles però va començar a agafar mostres de la seva cavitat bucal i les observava al microscopi o aigua de basses i va observar una sèrie d’elements microscòpics que tenien vida pròpia i els va anomenar ANIMÀCULS, primera descripció d’elements microscòpics vius. Aquest descobriment va comportar un canvi en el pensament científic de l’època perquè l’existència d’aquests elements ja és una certesa.
El descobriment torna a despertar la teoria de la generació espontània. Redi serà el primer en observar que el cucs i larves que s’observen a la carn en descomposició no s’han originat espontàniament sinó que és degut a que les mosques han posat larves, amb l’experiment que fa demostra que si s’aïlla la carn de les mosques es manté sense larves, afirmant així que les larves no s’originen per generació espontània.
Spallonzani recull aquests experiments més tard per introduir un sistema d’esterilització. Escalfa una solució, un pot el deixa obert i l’altre l’aïlla de l’aire quedant estèril. Demostra que si s’eliminen els microorganismes que contenia escalfant el pot i es manté estèril no tornen a aparèixer. Aquest experiment es recupera més tard per elaborar un mètode de conservació d’aliments.
Microbiologia I Silvia Expósito Un altre fet important relacionat amb malalties infeccioses és conèixer la via de contagi entre la població per trobar un mètode que eviti l’extensió d’aquesta malaltia. Descoberta per John Snow la via de transmissió del colera, cap al 1800 hi ha una epidèmia de colera a Londres on no hi havia aigua potable a les cases. El doctor va realitzar un estudi en que situava a la zona on s’havia declarat l’epidèmia els pous i les cases de la zona. Va analitzar l’aigua del pou i va establir per tant la via de transmissió de la malaltia, a partir d’aquí es comencen a utilitzar sistemes de filtració per evitar la transmissió.
Semmelweis introdueix per primera vegada l’aplicació d’antisèptics per evitar infeccions, era metge i va observar que les dones que donaven a llum patien una infecció de l’endometri deguda a la manipulació que hi havia en el moment del part. Observa que les dones que donaven a llum a l’hospital patien amb menys freqüència aquesta infecció i va relacionar que els metges estaven en contacte amb altres malalts i no usaven cap tipus de protecció ni mesures higièniques, per tant, les malalties eren causades per metges. Va començar a aplicar una tècnica que consistia en que el metge cada cop que tractava a algú es rentés les mans amb antisèptic i així les infeccions es van reduir molt.
Aquestes mesures d’asèpsia les va introduir un altre metge (Lister) en aquest cas en operacions quirúrgiques, introdueix un sistema per vaporitzar fenol sobre la zona a operar i així va evitar un gran nombre d’infeccions.
Pasteur va ser el primer en refutar la teoria de la generació espontània, va idear un flascó amb coll de cigne on hi va col·locar una infusió i la va escalfar, degut a la forma els microorganismes de l’aire no podien entrar a la solució i quedava estèril, en canvi, si inclinava el flascó i el brou entrava en contacte amb els microorganismes és quan es contaminava. També va demostrar per primera vegada l’existència de microorganismes anaerobis (absència d’oxigen) i que podien realitzar transformacions  FERMENTACIONS sobretot làctiques i també alcohòlica. Va aportar solucions a problemes causats per microorganismes, va proposar tractar el menjar amb calor (pasteurització) per eliminar bacteris, per conservar el vi...
Kock va ser un dels microbiòlegs més importants de la història, era metge i els seus descobriments es centraven més en la microbiologia, va demostrar per primera vegada que una malaltia infecciosa era causada per un microorganisme. Descobreix l’agent causal de l’àntrax = Bacillus anthracis, que era bastant freqüent sobretot en animals i es va proposar descobrir l’agent causal. Agafa mostres de teixit infectat dels animals i les dilueix, observa al microscopi una varietat de cèl·lules diferents però hi ha unes que es repeteixen molt de forma arrodonida  endòspores (formes de resistència), a totes les mostres sempre l’aïlla.
Necessitava aïllar aquestes estructures de totes les altres cèl·lules però en medi líquid era impossible, va provar un medi sòlid que pels fongs funcionava bé però no va obtenir res.
Microbiologia I Silvia Expósito Va provar amb un ingredient que s’afegia al brou que era l’agar agar, si s’afegeixen 15g/L es forma una malla quan es refreda que provoca que els microorganismes puguin difondre fins a la superfície i es prou tupida perquè no s’enfonsin i creixin a la superfície. Amb la col·laboració amb Petri va poder progressar en els seus descobriments gràcies a l’elaboració de plaques amb medi sòlid i amb tapa per fer créixer els microorganismes de manera aïllada. A mida que els organismes de la mostra capten nutrients es van dividint per bipartició creant dos individus idèntics al progenitor, creixement que es tradueix en la formació de grups d’individus macroscòpics = COLÒNIES originades a partir d’una sola cèl·lula inicial i si estan prou separades es poden aïllar els microorganismes que les van formar.
Ara havia d’identificar a quin microorganisme corresponia cada colònia a partir d’una tinció de Gram i l’observació al microscopi, una vegada identificada va intentar separar-la de la resta perquè creixés i va agafar una part de la colònia determinada i la va passar a una nova placa on totes les colònies que havien de créixer serien iguals si havia fe bé l’aïllament i quan visualitzés els microorganismes que les formaven en tots els casos havia de ser el mateix, fent això havia d’obtenir un CULTIU PUR o AXÈNIC. Ara només quedava demostrar que aquest microorganisme era el responsable de la malaltia, i ho va fer introduint-lo en un animal sa en el que reproduïa tots els símptomes característics de la malaltia.
Kock va idear un medi de cultiu sòlid, va aconseguir un aïllament d’un cultiu pur de microorganismes i va ser capaç de descobrir l’agent causal de la malaltia infecciosa demostrant que les malalties no eren a causa de càstigs divins. Va descobrir també els agents causants de la tuberculosi i del còlera. A partir dels seus descobriments va crear uns postulats de Kock que encara s’utilitzen actualment per descobrir els agents causants d’una nova malaltia infecciosa: 1. El microorganisme responsable d’una malaltia concreta ha de ser present en tots els casos de persones i animals afectats 2. Aquest microorganisme ha de poder ser aïllat en cultiu pur i identificat 3. Amb aquest microorganisme aïllat s’ha d’infectar un hoste sa i reproduir-li tots els símptomes de la malaltia 4. El microorganisme ha de ser novament aïllat d’aquest hoste que s’ha infectat experimentalment Limitacions: no tots els microorganismes es poden aïllar en cultiu pur i per raons ètiques no sempre es poden reproduir els símptomes de la malaltia en un hoste sa, sobretot quan la malaltia és exclusivament humana i greu per la que no hi ha tractament.
Pasteur no acaba identificant cap microorganisme infecciós però elabora una vacuna contra l’àntrax, una mica més tard també va elaborar una vacuna contra la ràbia que va tenir una gran popularitat quan la va aplicar en un nen. Actualment no es vacuna de la ràbia perquè té una evolució molt lenta i es pot immunitzar a la persona un cop ja ha estat infectada.
Behring i Kitasato van ser capaços d’immunitzar animals d’experimentació introduint un producte al que anomenen per primera vegada antitoxina. Van veure que els animals o persones infectats pel tètanus o diftèria desenvolupaven unes substàncies que inhibien l’efecte de les toxines que produïen aquests agents infecciosos i que causaven els símptomes característics d’aquestes dues malalties, la tetànica actua a nivell del SNC i la diftèrica a nivell de síntesi de proteïnes. El SI elabora Ab que neutralitzen aquestes toxines i aquests productes immunogènics són el que van anomenar antitoxina i el que van utilitzar pel tractament de les malalties. Behring va subministrar l’antitoxina de la diftèria en un nen i va aconseguir salvar-lo, va ser la primera vegada que es va utilitzar una vacuna per curar una malaltia infecciosa.
Microbiologia I Silvia Expósito Iwanouski va ser el primer en descobrir els virus. Va intentar aïllar l’agent causant d’una malaltia en les plantes de tabac que produïa una pigmentació desigual en les fulles, això ho causa el virus del mosaic del tabac. Va agafar fulles infectades, les filtra i observa que en el filtrat hi ha algun element que ell pensa que és una toxina i que és el responsable de la malaltia. Descarta els bacteris perquè sabia que no podien passar pel filtre. Els seus treballs van ser recollits per Beijerick que va aconseguir cristal·litzar i observar el filtrat i utilitza per primera vegada la paraula virus per descriure aquest agent infecciós.
1900: es descobreix la via de transmissió de la febre groga produïda per un virus. Es transmet per un mosquit, arriba a Amèrica a finals del s. XIX. Quan es va construir el canal de Panamà va haver-hi una epidèmia i Reed va deduir que la malaltia havia de ser transmesa per mosquits perquè els treballadors que dormien amb mosquiteres estaven sans. Va descobrir la via de transmissió de la febre groga.
Theiler va elaborar una vacuna contra el virus de la febre groga uns anys més tard i va ser la primera vegada que es va aconseguir creixement de virus en condicions de laboratori.
També es va descobrir l’agent causant de la sífilis, una malaltia infecciosa de transmissió sexual, i una mica més tard es va idear una reacció serològica per poder diagnosticar la malaltia. És una malaltia d’evolució lenta en la que es produeixen diferents etapes cadascuna amb uns símptomes determinats cosa que dificulta el diagnòstic.
Una mica més tard Erlich va sintetitzar el primer producte antimicrobià per poder combatre una malaltia infecciosa. Era un químic alemany que buscava un producte per eliminar aquesta malaltia, un dels productes que va utilitzar va ser una sal d’arsènic a la que va anomenar SALVARSAN, i va ser el primer producte que es va aplicar amb èxit per controlar una malaltia bacteriana. Els productes que s’utilitzin contra aquestes malalties han de tenir una toxicitat selectiva per matar el microorganisme però que no causin lesions en la persona, diu que han de ser com bales màgiques.
Fleming va descobrir casualment un antibiòtic anomenat penicil·lina que deriva d’un fong (Penicillium), va ser el primer antibiòtic que es va utilitzar amb èxit en el tractament de malalties infeccioses.
Al 1928 Griffith va descobrir el mecanisme d’intercanvi genètic dels bacteris anomenat transformació bacteriana, va descriure per primera vegada que en els bacteris hi ha intercanvi de material genètic entre els individus d’una població. En aquest mecanisme alguns bacteris són capaços de captar del medi trossos de DNA que provenen d’altres bacteris que han patit una lisi, els introdueixen al seu interior i si és relativament semblant es pot incorporar al seu DNA.
Microbiologia I Silvia Expósito Va ser quan estava treballant amb un bacteri grampositiu, Streptococcus pneumoniae, intentant conèixer com es desenvolupava la malaltia de la pneumònia, que va veure que al fer créixer aquest bacteri en plaques apareixien dos tipus de colònies diferents: unes de llises i mucoses i unes de rugoses que mai eren mucoses. En principi es va pensar que se li hauria contaminat la placa i que eren dos microorganismes diferents, per això va agafar els de la colònia llisa i els va ressembrar, el que passa és que li van tornar a aparèixer colònies rugoses, cosa que el va fer desistir de la idea de que eren dos bacteris diferents.
Aleshores va anar més enllà i va infectar ratolins amb les colònies llises i va veure que morien tots. Al infectar-los amb les colònies rugoses, però, no els passava res. Quan ho feia amb la colònia llisa mucosa inactivada a altes temperatures i la rugosa juntes els ratolins també morien.
Llavors va deduir que la colònia llisa havia de provocar una transferència a la rugosa de manera que fes que les rugoses soles no matessin però amb aquesta transferència sí. D’aquí va aparèixer el nom de transformació bacteriana.
Avery va mesurar l’any 1944 l’element que provocava la transformació bacteriana i va veure que era el DNA de les cèl·lules llises que modificava el DNA de les rugoses. En aquell moment però no se’l van creure perquè deien que el DNA només tenia 4 bases i les responsables d’aquell fenomen havien de ser proteïnes.
Lederverg i Tatum van ser els descobridors d’un altre fenomen d’intercanvi genètic dels bacteris: la conjugació bacteriana. La van descobrir quan estaven comprovant la transformació bacteriana d’Escherichia coli, i van veure que tenia un mecanisme d’intercanvi genètic però no era la transferència ja que en aquesta la cèl·lula bacteriana capta trossos de DNA de l’exterior que provenen d’altres cèl·lules; en canvi en l’E. Coli el que passava era que dues cèl·lules es posaven en contacte per una estructura proteica, el pont de conjugació, per on passava el DNA d’un plasmidi d’una cèl·lula a l’altra (només plasmidis).
Lederverg i Zinder van descobrir el 1952 el tercer procés d’intercanvi genètic: la transducció bacteriana. Aquesta es deu a un bacteriòfag, que quan infecta una cèl·lula es replica en ella i s’obtenen còpies del bacteriòfag. Aquestes còpies poden ser idèntiques al bacteriòfag infestant o no; i quan no ho són i incorporen algun tros de DNA de la cèl·lula infectada, els bacteriòfags modificats s’anomenen bacteriòfags transductors. Són aquests els responsables de la transducció quan ataquen una nova cèl·lula i aporten un tros de DNA de la primera que havia estat infectada.
Microbiologia I Silvia Expósito Als anys 30 es construeix el primer microscopi electrònic, es poden veure els microorganismes amb tot detall (també l’interior), es descobreix l’estreptomicina als anys 40 i s’aplica per primera vegada al tractament d’una malaltia infecciosa molt greu que produïa moltes morts com la tuberculosi i va provocar una baixada en la mortalitat important, després d’un temps deixa de ser útil perquè es van desenvolupar resistències.
Al 1953 Watson i Crick van descobrir l’estructura de de la doble hèlix del DNA, van dir que era una estructura complexa. Una mica més tard es determina que la seqüència de bases del DNA està ordenada de tal manera que cada tres bases codifica per un aminoàcid concret = codi genètic. I més tard es va postular que alguns gens que es troben a la seqüència del DNA no es troben de qualsevol manera sinó formant els anomenats operons.
Als anys 60 es sintetitza la primera quinolona  primer antibiòtic que s’obté per síntesi química.
Als anys 70 es descobreixen els enzims de restricció que reconeixen seqüències específiques de DNA de 4, 6 o 8 parells de bases i la tallen de manera també específica, hi ha dos tipus de tall: extrems roms o seqüències palindròmiques generant els extrems cohesius. Aquest descobriment es fa sobre els bacteris i s’utilitzen per totes les tècniques de manipulació de DNA al laboratori. També es descobreix l’existència de la transcriptasa inversa o retrotranscriptasa  enzim víric dels retrovirus que funciona al revés de la resta d’enzims que actuen sobre el DNA o RNAm. El flux normal del material genètic es produeix del DNA a RNAm i a proteïna, però la transcriptasa inversa sintetitza un DNA a partir del RNAm, i és útil perquè els retrovirus com a material genètic tenen una cadena de RNA senzilla i així poden obtenir la cadena de DNA doble, obtenint així la seva seqüència.
Es descobreix que hi ha determinats virus animals que també tenen la mateixa propietat que alguns bacteriòfags i seria la d’integrar-se als cromosomes de l’organisme que infecten. El virus s’uneix a la membrana i al citoplasma s’allibera el seu material genètic que començarà un procés de replicació donant lloc a nous virus. I ara en els virus animals en comptes de replicar-se, l’àcid nucleic s’integra en alguns dels cromosomes de la cèl·lula i es queden en estat de latència, procés que es coneix com lisogènia. I això comporta un procés de transformació en el que s’altera el creixement cel·lular a nivell dels cromosomes, cosa que nosaltres coneixem com a càncer.
Es descobreixen també els tres regnes (eucariota, bacteria i arquea) i els prions, es coneixien les malalties que causaven però no els elements proteics en sí fins al 1977. Es produeix per primera vegada un producte animal  insulina per recombinació en un bacteri i s’obté un producte de la mateixa puresa i propietats que la insulina humana però a més amb un cost molt baix i a partir d’aquest moment s’obtenen la hormona del creixement i altres productes d’interès.
Als anys 80 es descobreix el virus que causa la SIDA i s’aprova la primera vacuna obtinguda per enginyeria genètica contra la hepatitis B, s’obtenen vacunes recombinants més endavant per immunitzar la població cosa que disminueix el risc d’error. I també s’introdueix la tècnica de la PCR gràcies al descobriment de l’enzim que s’utilitza que també prové d’un bacteri termòfil i que per tant no es desnaturalitza quan s’assoleixen les altes temperatures per separar les cadenes de DNA.
Sanger va idear un sistema de seqüenciació de proteïnes que permetia determinar la seqüència d’aminoàcids i més tard es va aplicar als àcids nucleics. I als anys 90 s’han seqüenciat genomes sencers; el primer bacteri seqüenciat va ser Haemophilus influenzae.
Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 2. TÈCNIQUES MICROBIOLÒGIQUES BÀSIQUES Els microorganismes són aquells éssers vius que tenen una mida inferior a 0,1 mm. Pel que fa a la longitud de les cèl·lules bacterianes oscil·la entre 0.3 i 400-500 µm, la majoria estan entre 1 i 6 µm. El diàmetre oscil·la entre 0.2 i 1.5 µm.
Necessitarem unes lents i microscopi determinats per observar aquests microorganismes. Per observar-les directament sol ser difícil perquè la gran part de la cèl·lula està formada per aigua i no ofereix gaire contrast per això cal observar-les mitjançant una tinció prèvia. Tipus: - Simples: utilitzen un únic colorant com el blau de metilè. Tampoc afavoreix gaire la seva visualització, s’utilitzen sobretot per tenyir fongs i llevats.
- Compostes: per bacteris, utilitzen més d’un colorant. La més usada és la tinció de Gram que va ser ideada per Christian Gram, utilitza dos colorants diferents i permet determinar la forma, la mida i una altra propietat segons si donen grampositiu o gramnegatiu. Els colorants són cristall violeta (blau) que s’afegeix al porta després de fixar els bacteris amb la flama, el lugol que actua facilitant la unió del colorant, decolorem amb una barreja d’alcohol i cetona: o o Grampositius: queden tenyits de color blau en aquesta etapa Gramnegatius: no queden tenyits perquè no poden retenir el colorant En aquest punt s’afegeix un colorant de contrast que és la safranina per tenyir els gramnegatius de vermell-rosat. S’utilitza molt en el laboratori perquè ens permet separar dos grans grups de microorganismes depenent del tipus de paret cel·lular que presenten els bacteris.
També s’utilitza la tinció de Zhiel-Neelsen pels bacteris que no es poden tenyir amb Gram, és un grup de microorganismes àcid-alcohol resistents.
- Diferencials o específiques: quan ens interessa tenyir una estructura determinada del bacteri només com la càpsula, espores, flagels... Quan es tracta de tenyir una estructura interna de la cèl·lula les tincions són més complicades i per facilitar-les a part del colorant afegim calor per assegurar que entri a les estructures.
Microbiologia I Silvia Expósito A part de les tincions clàssiques, hi ha determinats grups de bacteris que no es tenyeixen bé o quan volem tenyir un patogen intracel·lular s’utilitzen tincions especials com les que s’utilitzen pels anticossos fluorescents. També es pot fer servir el microscopi electrònic i també s’usen diferents tipus de tincions depenent del que es vulgui observar. Tipus: - De transmissió: volem observar talls a l’interior de la cèl·lula. Fem servir colorants que augmenten la densitat dels electrons de la mostra. Ex: acetat d’uranil, fosfotunestat...
De rastreig: observem el volum de les cèl·lules, l’estructura externa completa. Es recobreix la mostra amb una capa d’or, platí o altres metalls per poder visualitzar l’estructura.
Quan es treballa amb els microorganismes al laboratori també es vol conèixer el tipus de metabolisme que presenta, les propietats.. les característiques en general a part de la mida i la forma.
 Manipular microorganismes al laboratori: Cal tenir en compte que són éssers que es troben a tot arreu. Per això, cal que tots els estris, flascons, medis de cultiu... no tinguin microorganismes contaminats, és a dir, cal esterilitzar.
L’esterilització és un procés mitjançant el qual eliminem qualsevol organisme viu del què estiguem esterilitzant i depèn del que vulguem esterilitzar. Per exemple, per esterilitzar la nansa de sembres s’ha de posar a la flama fins a estar incandescent; per esterilitzar un medi de cultiu es fa servir l’autoclau, ...
El problema és que no es pot treballar amb individus aïllats perquè no hi ha cap mètode de mesura prou fi per mesurar el contingut proteic o qualsevol altre en una cèl·lula bacteriana (perquè són quantitats massa petites), per tant, sempre s’haurà de treballar amb poblacions d’individus o cultius i amb els resultats que obtinguem interpolar-los a una cèl·lula per veure el comportament que té.
La població ha de ser constituïda per individus idèntics perquè sinó obtindrem una barreja de resultats no vàlids. S’han d’aïllar els microorganismes d’interès, obtenir cultius purs i mantenirlo sense que es barregin amb altres cosa que no és fàcil perquè estan per tot arreu, s’han de mantenir en condicions estèrils.
 Tècniques d’aïllament: Volem aïllar un microorganisme concret, usem un mètode d’aïllament basat en la capacitat que tenen els microorganismes de créixer en medis sòlids formant colònies.
Esgotament en placa: consisteix en agafar de la barreja de microorganismes que tenim, una mostra amb la nansa de Kolle i traslladar-la a una placa de Petri amb tapa i amb el medi de cultiu adequat (generalment TSA), tot ha de ser estèril i s’ha de manipular d’una manera en la que es treballi sempre amb la mínima contaminació possible.
S’esterilitza la nansa amb el bunsen, s’introdueix al matràs i s’estén per la placa perquè es formin colònies aïllades, haurem de fer servir un mecanisme que els reparteixi de manera que poc a poc vagi disminuint la quantitat que tenim a la nansa  mitjançant estries: sense fer mal bé l’agar, es van fent unes estries amb la nansa per aconseguir repartir tots els microorganismes al llarg de la placa, així probablement a les últimes si que haurem deixat microorganismes aïllats.
Tècnica qualitativa.
Microbiologia I Silvia Expósito Ens serveix si al matràs no hi ha gaire quantitat, si hi ha molts es fan un altre tipus d’estries  escocès (fent quadres a la placa), fem una sembra a un racó de la placa, retirem la nansa i es torna a esterilitzar, després estenem la nansa un altre cop fent aquestes estries, de manera que a la part final hi haurà menys microorganismes, tornem a esterilitzar i canviem les estries de sentit començant per on teníem menys, tornem a esterilitzar i canviem de sentit, anem repetint fins a cobrir tota la placa.
Banc de dilucions: té l’avantatge de que a més de que ens permet obtenir colònies aïllades podem saber quants MO teníem inicialment a la mostra, hem d’anar disminuint el nombre de MO mitjançant volums coneguts per després poder-los comptar. Es fa mitjançant el banc de dilucions que són una sèrie de tubs que contenen un medi RINGER ¼, una solució salina que impedeix el creixement dels MO però manté les cèl·lules viables de manera que les cèl·lules no es multipliquin però estiguin vives.
El nombre de tubs variarà en funció de la concentració de cèl·lules que tenim inicialment, a més concentració de MO a la mostra més dilucions s’hauran de fer (s’estima la concentració segons la terbolesa del cultiu). Els volums que triem dependran de la dilució que es vulgui fer, si hi ha poca concentració les fem de 10 en 10 i si hi ha molta les podem fer de 100 en 100.
Si fem una dilució inicial 1:100 (afegir 0.1 mL tenint un volum total de 10mL) tindrem 100 vegades menys MO dels que teníem a la mostra inicial, repetim la dilució un altre cop per reduir més els MO, ara ho faríem de 10 en 10 afegint 1mL a un tub amb 9mL i tindríem 100.000 vegades menys MO i podem fer una altra dilució més.
Microbiologia I Silvia Expósito Es fan en medi líquid i ho passem a un medi sòlid per aïllar els MO, agafem un cert volum de l’últim tub i el col·loquem a una placa amb el medi de cultiu adient perquè es solidifiqui, és igual el volum que posem però l’hem de saber (si posem massa el líquid no s’absorbirà i no aïllarem res)  sembrem entre 0.1 i 0.5 mL al centre de la placa i ho estenem mitjançant una NANSA DE DIGRALSKI prèviament esterilitzada amb alcohol i flamejada. Es va movent la nansa mentre alhora es gira la placa, així els MO es reparteixen de manera homogènia per tota la placa, la posem a l’estufa per afavorir el creixement i després d’un temps obtenim colònies que es poden comptar i com sabem que cada colònia correspon a un MO inicial sabem quants hauran anat a parar a la placa i si es multiplica pel factor de dilució sabrem quants MO teníem a la mostra inicial.
El factor de dilució a la placa serà la dilució dels tubs + la part de volum que agafem de l’últim tub (en un exemple serien 1x10-6 en tubs x 1x10-1 = 1x10-7, per tant, 14x107 MO). Per cada tub de dilució a la pràctica s’han de preparar dues plaques per evitar petits errors en pipetejar que podria comportar una diferència important en el nombre de MO. A l’hora de fer el recompte haurem d’agafar aquella placa en la que hi hagin entre 30 i 300 colònies.
Amb una nansa de sembres agafem una petita porció d’una de les colònies per fer el cultiu pur i la passem a un tub inclinat que té el medi de cultiu adient fent estries en zig-zag, mantenim el tub aïllat del medi ambient per mantenir el cultiu pur. Els sistemes de conservació de cultius purs han de complir una sèrie de característiques: o o o Evitar canvis en la població del cultiu pur del MO, s’han de mantenir les mateixes característiques que en el moment de sembra Mantenir la puresa del cultiu Mantenir al màxim la viabilitat perquè mori el mínim nombre de cèl·lules possible a) Subcultius: anar posant de manera periòdica els MO del cultiu pur en un altre tub amb el medi fresc perquè es puguin recuperar i anem repetint la operació. Els cultius van creixent i van esgotant els nutrients del medi, per això cal renovar-lo perquè sinó la cèl·lula moriria. Es fa servir quan es treballa amb un MO amb el que treballes sovint.
b) Dessecació: sobretot en cultius de fongs i llevats. Posem els cultius en un suport adient i es desseca.
c) Liofilització: s’agafa un cultiu líquid del MO amb la nansa de sembres i es posa en un aparell especial que elimina l’aigua per sublimació de manera que obtenim com una pols. Aquest sistema és molt útil per la conservació de qualsevol tipus de cultiu (el millor) i no requereix cap conservació especial, es mantenen durant molt temps però no és pràctic si es treballa habitualment amb un MO.
d) Congelació: a -20ºC, -40ºC i -80ºC, també és un bon sistema de conservació, cal afegir a un medi de cultiu líquid algun crioprotector (glicerol per -20ºC i -40ºC, dimetilsulfòxid o nitrogen líquid per -80ºC).
Quan necessitem un cultiu d’un microorganisme determinat no cal que el busquem al medi extern, podem acudir a les col·leccions de cultius tipus, col·leccions que els diferents països tenen de les espècies de microorganismes i cadascuna rep un nom: l’americana és la ATCC, l’espanyola la CECT, la belga la LMG... i al fer una investigació es poden demanar els microorganismes en aquestes col·leccions que donen un nom a cada microorganisme, per exemple Bacillus subtilis a la col·lecció espanyola s’anomena Bacillus subtilis CECT 227. Per Microbiologia I Silvia Expósito anomenar-los es posa el numero del bacteri, les sigles corresponents a la col·lecció nacional i un número.
Per fer-los créixer al laboratori i poder determinar les seves característiques, hem d’utilitzar diferents medis de cultiu que han d’imitar al màxim les condicions en les que viu el MO a estudiar i també dependrà del seu metabolisme ja que és molt divers. Hi ha medis de cultiu que permeten el creixement d’una gran varietat de MO. Principals grups de medi de cultiu: - Segons la composició els dividim entre: o Complexes: els diferents nutrients que conté estan en una forma química no definida. Ex: TSA conté peptones (producte de degradació de les proteïnes) com a font de C i N però sense tenir una forma química definida.
o Definits: components del medi en una forma química definida, en un medi de C la font seria glucosa i de N seria de nitrats, amoni...
- Segons les seves característiques: o Rics: conté tots els nutrients necessaris per una gran quantitat de MO i amb una forma química fàcilment assimilable per ells, la majoria hi creixen bastant bé (TSA).
o Mínims: mínims nutrients necessaris pel creixement del MO i pot ser que algun dels nutrients essencials estigui en una forma química que algun dels MO no la pugui assimilar. Ex: nitrats, hi ha molts MO que no els poden assimilar perquè dins de les cèl·lules el N està en forma de sal d’amoni i el bacteri haurà de tenir els enzims necessaris per transformar els nitrats en aquesta sal (reductases).
- Medis que faciliten l’aïllament: o Selectius: medi que conté una determinada substància que inhibeix el creixement de la majoria de MO excepte d’aquell que ens interessa estudiar.
Han de portar alguna substància inhibidora que dependrà del medi de cultiu. Ex: McConkey porta sals biliars com a inhibidor, pensat per facilitar l’aïllament del MO que es troben al tracte digestiu, d’aquesta manera només creixeran els que estiguin en contacte amb les sals biliars (digestius); medi de Manitol Hipersalí conté sal com a inhibidor per aïllar els bacteris que es troben a la pell, no és totalment exclusiu però facilita molt l’aïllament.
o D’enriquiment: medis que contenen una determinada substància que facilita l’aïllament i el creixement d’un MO que ens interessa malgrat que es trobi en una proporció molt baixa respecte a la resta. Ex: medi de Tetrationat o altres, faciliten l’aïllament de la Salmonella, s’utilitzen sovint en el control d’aliments , els mètodes tradicionals d’aïllament no ens serveixen perquè no detecten les baixes proporcions.
o Diferencials: permeten posar de manifest alguna característica del MO. Ex: McConkey a més de ser selectiu es pot veure si el MO que hi creix pot utilitzar la lactosa o no (lactosa + o -) i ho veurem segons el color de la colònia perquè hi haurà un canvi de pH; Manitol Hipersalí a més de selectiu determina si utilitza el mannitol o no i també es veu segons el color de la colònia; medi agar sang determina si el bacteri té els enzims necessaris per hidrolitzar la sang i de quin tipus és la reacció.
...

Tags:
Comprar Previsualizar