Cultius Cel·lulars Tema 6 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 10

Vista previa del texto

1 2 3 4 5 6 TEMA 6. CARACTERITZACIÓ DE LÍNIES CEL·LULARS.
El 2001 es va publicar a la revista Lancet Oncology un article que deia que hi havia evidència que més d’un terç de línies tumorals utilitzades en recerca estaven afectades per contaminació creuada de cèl·lules de la mateixa espècie o d’altres espècies. Aquest fet és important que se solucioni, doncs és el factor determinant de la validesa o invalidesa dels experiments que es realitzin.
Per què és important caracteritzar línies cel·lulars? Bàsicament, per saber que realment estem treballant amb la línia que toca. També per saber si la línia s’ha inestabilitzat, si aquesta inestabilització modifica el comportament en cultiu de la cèl·lula. A l’hora de produïr, cal que es treballi amb línies estables. En alguns casos, sobretot en tipus cel·lulars humans, podem arribar a caracteritzar fins i tot el llinatge de la cèl·lula.
Què fan les cèl·lules en els teixits? Totes les nostres cèl·lules es van renovant a diferent ritme. Això implica que a cada teixit hi ha cèl·lules mare que es van dividint. Les filles entren en un procés de diferenciació, i es diferencien en cèl·lules especialitzades en fer una funció. En la línia hematopoiètica tenim una sèrie de marcadors que ens permeten saber en quin grau de diferenciació es troben les cèl·lules.
En un cultiu, però, traiem les cèl·lules del seu medi habitual i això fa difícil que s’arribin a diferenciar correctament. Aquestes cèl·lules normalment no proliferen i, si ho fan, vol dir que es desdiferencien. El mateix passa amb els tumors: quan són de cèl·lules indiferenciades són molt més agressius que els tumors de les cèl·lules més diferenciades, ja que així poden duplicar-se i per tant extendre’s molt més. Les cèl·lules en teixits reben senyals: de les cèl·lules que les envolten, de la matriu, endocrines, etc. Quan les traiem del seu context natural, no reben senyals. Això indueix la seva desdiferenciació.
És per això que habitualment es treballa amb línies cel·lulars i no pas amb cultius primaris. És molt important que tinguem la línia cel·lular ben caracteritzada. La caracterització la podem fer segons diferents paràmetres: 1 Morfologia: podem tenir cèl·lules adherents o bé en suspensió. Dins d’aquestes últimes, poden estar aïllades o formant grumolls. Per exemple, els fibroblasts d’humà i de hamster són molt iguals entre ells.
A mesura que passen els dies i el nombre de cèl·lules augmenta, les prolongacions citoplasmàtiques desapareixen. Això és perquè estan en contacte amb moltes altres cèl·lules (medi amb alta densitat cel·lular).
La seva morfologia pot canviar també en funció de factors que afegim al medi. Quan posem factor de maduració glial a cèl·lules glials això indueix la seva diferenciació i que canvïn la morfologia.
2 Immunocitoquímica/immunofluorescència: és la caracterització de cèl·lules en funció de les molècules que expressen. En la imatge, el què veiem de color vermell i verd indiquen dos tipus de cèl·lules diferents. S’han marcat amb dos anticossos diferents dos elements del citoesquelet: vimentina i queratina. Tenim cèl·lules epitelials i fibroblasts en co-cultiu. Les primeres expressen queratina, i les segons vimentina. Cadascuna d’elles quedarà marcada d’un color diferent.
Si a l’anticòs prèviament hi hem posat un fluorocrom, i després de la incubació posem el cultiu al microscopi els veurem de colors. Aquesta tècnica és anomenada immunocitofluorescència. En la immunocitoquímica, en canvi, els anticossos estan units a un enzim com pot ser, per exemple, la peroxidasa.
Aquest enzim dóna lloc a un compost de color marronós quan reacciona amb el peròxid. Si l’anticòs s’uneix a una proteïna específica, i en el cultiu hi posem peròxid, veurem les zones on hi hagi abundància de proteïna de color marró.
Com que en un cultiu les cèl·lules es comporten diferent respecte al teixit original, podem observar que, per exemple, les cèl·lules glials expressen una molècula en cultiu (ONEC) però no en teixit.
3 Caracterització per activitat enzimàtica. També pot donar-se el cas que cèl·lules expressin determinats factors de forma més o menys potent. Tenim cèl·lules de tumor diferenciat, tumor indiferenciat i cèl·lula normal. En aquest cas concret, determinar l’activitat del factor activador del plasminogen ens dirà davant de quin tipus cel·lular ens trobem.
4 Fenotipatge isoenzimàtic: Podem analitzar si hi ha diferències d’isoenzims entre espècies diferents i entre mateixos exemplars d’una línia cel·lular, fent una electroforesi. Això ens permet diferenciar entre línies cel·lulars.
5 Anàlisi citogenètic. Es fa en cèl·lules en metafase, doncs és quan els cromosomes estan condensats i els podem visualitzar. Per veure’ls bé, posem un agent antimitòtic que fa que despolimeritzi els microtúbuls.
Sense microtúbuls, els cromosomes arriben a la metafase però no es poden posar a la placa equatorial.
Després es fa un tractament hipotònic i per últim fixació. Ara ja tenim els cromosomes dispersos i els podem observar. A la dreta tenim una foto que mostra anomalies cromosòmiques: cromosomes sense centròmer o bé amb centròmers de més (això ens indica que alguns cromosomes s’han trencat i després s’han reparat), la qual cosa és un indicador d’inestabilitat genètica. Nota: les cèl·lules tumorals en tenen normalment.
Poden donar-se també processos de reparació per recombinació, però només en cèl·lules de la línia germinal ja que és en la meiosi on es produeixen els quiasmes.
Cada cromosoma té un patró de bandes característic. Fer el cariotip d’una línia cel·lular ens permet saber si aquella línia té anomalies, i caracteritzar-la. Les anomalies poden ser de tipus numèric o bé estructural. És un mètode molt fiable per detectar contaminacions creuades, perquè cada espècie té un patró de bandes i un número de cromosomes definit.
La hibridació in situ consisteix en un seguit de sondes de DNA que hibriden amb fragments homòlegs de seqüències conegudes. Els cromosomes que veiem de color blau i vermell són dos cromosomes quan s’han trencat i s’han intentat reparar: en fer-ho han intercanviat material genètic. És el que s’anomena reparació per translocació.
La mFISH és una tècnica més sofisticada que la d’hibridació in situ a seques. Ens permet diferenciar cada parella de cromosomes, cadascuna amb un color diferent. És més car i complicat però més fiable, necessitem una sonda per a cada cromosoma.
6 DNA fingerprint. Té a veure amb els polimorfismes. Tots els DNA tenen un nombre de seqüències (STR) que es repeteixen un nombre determinat de vegades. El què es fa és separar el DNA de doble cadena, incubar-lo amb una sonda que complementi per a un polimorfisme determinat i fer-los córrer per carrils d’electroforesi.
Aquells DNA que tinguin més repeticions d’aquella seqüència hibridaran més, augmentaran el seu MW i correran més a poc a poc pel gel. Els STR ens permeten la identificació de loci polimòrfics del DNA, ens permet fer un anàlisi molt ràpid. És el que utilitzen les grans companyies per detectar contaminacions creuades a les seves línies. Els STR són petites regions que es van repetint vàries vegades en varis loci diferents. En individus homozigots, dos al·lels tindran el mateix nombre de repeticions; en individus heterozigots el nombre de repeticions en un al·lel i el l’altre és diferent.
Exemple: Fem un anàlisi de dues línies cel·lulars, cadascuna procedent de dues dones diferents. Analitzem 8 loci diferents i a més el loci per a l’amielogenina, que ens permet distingir si una línia cel·lular determinada procedeix d’un home o d’una dona.
Veiem que per al loci 1, una línia és heterozigota i l’altra és homozigota. Fem l’anàlisi per a la resta de loci i obtenim els patrons corresponents.
De l’anàlisi obtenim dos patrons diferenciats, un per a cada línia. Si fem cultius amb aquestes línies i volem saber si hi ha contaminació creuada en algun d’aquests cultius, el que hem de fer és fer l’anàlisi dels STR i obtenir el patró per a cada loci. Si surt una barreja dels dos resultats que hem obtingut abans, vol dir que tenim un cultiu amb contaminació creuada.
També podem obtenir el nombre de STR per als mateixos loci de dues línies cel·lulars procedents d’un mateix individu però pertanyents a diferents llocs del cos. En aquest cas tenim els STR d’una cèl·lula d’artèria femural i d’una cèl·lula procedent de l’aorta. Veiem que els patrons són exactament iguals, doncs en totes les cèl·lules d’un individu hi ha contingut en el nucli el mateix material genètic (menys les cèl·lules de la línia germinal, que en tenen la meitat). A vegades per caracteritzar una línia cel·lular cal utilitzar dos mètodes diferents com a mínim.
...