Biologia Molecular. Tema 4 (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 22
Fecha de subida 29/08/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Regulació entre l’expressió gènica i la transducció del senyal Hi ha una regulació coordinada en els teixits d’ organismes eucariotes entre l’expressió gènica i les cascades de transducció del senyal.
Una cèl·lula del teixit pot presentar una proteïna que és un receptor que al rebre un missatger primari, pateix un canvi conformacional.
Llavors activa el missatger secundari que activa els factors de transcripció o transactivadors elevats. Aquest fet es coneix com a cascades de transducció del senyal.
Quan una hormona arriba a l’interior de la cèl·lula, en el transactivador inactiu hi ha un lloc d’unió (si és esteroide, és a dir, de naturalesa lipídica tindrà facilita per creuar membranes) provocant un canvi conformacional alliberant la part que inhibeix el domi de reconeixement de DNA, que quedarà accessible per anar a reconèixer la seqüència en qüestió. Les cascades de senyal es donen quan les hormones no poden travessar membranes.
TEMA 4. ÀCIDS NUCLEICS II: TIPUS DE RNA I FUNCIONS Hi ha molècules de RNA que també tenen funció en la regulació gènica. El RNA és un polinucleòtid, format per una única cadena de ribonucleòtids, que bàsicament té dues grans diferències respecte el DNA.
- Té ribosa en lloc de desoxiribosa. Això significa que al seu Carboni 2 hi ha un grup hidroxil, en comptes d’un hidrogen. El fet de tenir un grup hidroxil el fa una molècula més fàcil d’hidrolitzar, ja que quest OH pot produir un atac nucleofílic sobre el seu propi enllaç fosfodièster.
- La timina és substituïda per l’uracil.
Com hem dit, el RNA és monocatenari, ja que el grup hidroxil mencionat anteriorment, impedeix que dues molècules de RNA formin una estructura de tipus B (conflicte estèric: les riboses no encaixen dins d’una hèlix de tipus B, degut a que no hi ha suficient espai per l’àtom d’oxigen 2’, estarien a una distància inferior a la de Van der Waals).
Ara bé, si que poden adoptar estructures secundàries i formar cadenes dobles, a partir d’autoaparellaments. Els autoaparellaments no acostumen a ser perfectes i ens trobem estructures que estaran formant una doble hèlix, però on pot quedar un nucleòtid que no forma aparellament de bases i forma una protuberància. També es poden formar llaços interns quan hi ha una sèrie de parell de bases que no formen autoaparellament. També es poden trobar stem loop, que són regions d’autoaparellament que té un extrem que no pot formar aparellaments de bases. Els que poden formar aparellament sí que formen una doble hèlix, però mai pot ser de tipus B-DNA, sinó que són de tipus A-DNA.
Hi ha RNAs que tenen capacitat catalítiques, poden actuar com a ribozims (RNAs que formen part del ribosoma que participen en la catàlisi de l’enllaç peptídic, el de l’splicing). També es poden unir a proteïnes formant ribonucleoproteïnes (RNP), on en la majoria de casos són l’element actiu i les proteïnes fan senzillament una funció estructural, per tant sempre aniran associats a proteïnes, que els hi donen certes propietats. Un exemple és el ribosoma.
La presència de magnesi és molt important perquè el RNA pugui aconseguir l’estructura funcional, ja que aquesta apantalla la repulsió que hi ha entre grups fosfat, donant estabilitat a la molècula.
En el cas de l’RNA podem tenir aparellaments de bases que no són possibles en el DNA de Watson i Crick, com per exemple GU. Aquests també es poden plegar sobre si mateixos com els tRNA, que formen l’estructura de forma de trèvol.
Tipus de RNA Podem separar l’RNA en dos grups: els codificants (RNA missatger que codifica per a proteïnes) i una part molt important que es troba en parts del genoma que és DNA no codificant o basura (ncRNA). Aquests DNA no codificants tenen funcions estructurals, catalítiques o reguladores de l’expressió gènica.
El RNA no codificant que nosaltres veurem són el que participen en la síntesi de proteïnes. Per tant el ncRNA implicats en la síntesi de proteïnes són: - rRNA (RNA ribosòmic): forma el ribosoma. Són diferents de procariotes i eucariotes i és la quantitat de RNA més gran dins de la cèl·lula. Gestiona la síntesi de proteïnes i catalitza a formació de l’enllaç peptídic.
- tRNA (RNA de transferència): Els RNA de transferència tenen una mida similar i serveixen d’adaptadors entre la seqüència de RNAm i la seqüència de proteïnes, permetent la unió entre aminoàcids i codons. Permet el pas d’un codi de 3 lletres a un codi de 1. Presenten moltes bases nitrogenades en la seva estructura que estan modificades respecte les 4 bases que tenim presents en qualsevol seqüència de DNA.
- Sc RNA (ARN citoplasmàtic petit): són RNAs petits que també participen en la síntesi de proteïnes. Són de mida curta i es troben al citosol. S’uneixen a proteïnes i formen part del que es coneix com a partícula de reconeixement de senyal (SPC), les proteïnes que surten de la cèl·lula han de quedar etiquetades d’alguna manera, porten un pèptid senyal.
Les proteïnes que han de sortir de la cèl·lula han de ser reconegudes per un senyal que es coneix com a pèptid senyal. Aquest pèptid senyal es localitza a l’extrem N-terminal, que indicia que la proteïna s’ha d’exportar a l’exterior, al reticle endoplasmàtic. Les partícules de reconeixement de senyal reconeixen el pèptid senyal, el porten al reticle endoplasmàtic, evitant que es plegui abans d’hora i queden embolcallades per vesícules i són secretades a l’exterior.
- tmRNA (transfer Messenger): exclusiu de procariotes. Té característiques de RNA de transferència i d’un RNA missatger. La seva funció es desencallar els ribosomes que han quedat aturats quan estan intentant traduir un RNAm que ha perdut el codó STOP. Per fer saltar el ribosoma, tenen un extrem que té una estructura que s’assembla al RNA de transferència i una altra part que és codificant i que pot variar en la llargada (depenent dels tRNA que sigui). A l’extrem de l’RNA de transferència queda carregat amb Alanines.
Aquesta part codificant codifica per un pèptid. Quan passa això, el tRNA se situa al lloc A del ribosoma, el RNAm salta i s’allibera del ribosoma, fent que la proteïna quedi situada a sobre del aminoàcid (alanina) del tmRNA i s’enganxa per l’enllaç peptídic. La proteïna salta al lloc P, on la seqüència que és codificant del tmRNA s’addiciona a la proteïna i l’etiqueta per a la degradació.
També trobem RNAs que participen en processos de maduració d’altres RNA i fins i tot altres RNA que també participen el procés de replicació.
- SnRNA (small nuclear RNA): són RNAs de mida petita que es troben dins el nucli.
S’associen a proteïnes i formen part d’un conjunt de partícules que reben el nom de partícules ribonucleiques nuclears petites que formen part de la maquinària que permetrà eliminar els introns del transcripts primaris (pre-RNAs) de l’RNA missatger.
- SnoRNA (small nucleolar RNA): són RNAs presents en el nucli, però concretament dins el nuclèol del nucli. Són de mida inferior a 200 bases, igual que els SnRNA, i en aquest cas participen en modificacions de bases nitrogenades o associats a enzims que modifiquen bases nitrogenades tant dels RNA de transferència (que porten bases modificades) com també dels RNA ribosòmics, que es generen dins el nucli, dins el nuclèol.
Altres RNA que participen en processos de maduració de RNAs o en processos de replicació són els que estan units a la telomerasa (RNA telomèric), que com hem dit està unit a l’enzim telomerasa i que participen en el procés de replicació dels cromosomes eucariotes.
Aquesta telomerasa porta associada el RNA telomèric i la seva funció és allargar els extrems d’aquests cromosomes. En un cromosoma circular no tenim cap problema, però en un cromosoma lineal quan eliminem la molècula de RNA, no tenim res més amunt perquè pugui fer d’encebador per omplir el buit que hem deixat. Per tant en eucariotes, que tenen el DNA lineal es donaria un escurçament dels cromosomes en cada replicació.
Per no perdre la part codificant dels cromosomes hi ha presents els telòmers, seqüències repetides que les introdueix la telomerasa i que les copia a partir del RNA telomèric que porta associat.
En maduració i replicació participen 2 RNAs més que són ribozims, és a dir, RNAs que actuen com a enzims que catalitzen diverses funcions. Són associacions de RNA amb proteïnes.
- RNasa-P: participa en el processament o maduració de l’extrem 5’ dels tRNA. També fan altres funcions i s’han trobat des de bacteris fins a eucariotes.
- RNasa MRP: el que fa és participar en la maduració dels pre-RNAs ribosòmics. El RNA ribosòmic es sintetitza com una sola cadena, aquest ribozim el fragmenta i dóna diversos RNA-ribosòmics madurs que passaran a formar part de les subunitats del ribosoma. Aquest ribozim també participa en el procés de replicació del DNA mitocondrial.
També trobem tot un conjunt de RNAs que cada dia van creixent més i que participen en el procés de regulació gènica. Dins dels RNAs que participen regulant l’expressió gènica trobem: - RNAs petits o sRNA (Small RNA): aquests tipus de RNA és propi exclusivament de procariotes, per tant, no el trobem en eucariotes. Són RNAs relativament petits i fan una funció reguladora. Participen en la regulació de l’expressió gènica en 2 nivells: reconeixen el RNA missatger o poden presentar complementarietat de bases amb RNA missatgers.
Quan aquet RNA missatger de procariotes ha sigut reconegut per un sRNA, es forma un aparellament de bases que és ajudat per unes proteïnes (xaperona), que en aquest cas ajuden a fixar els sRNA en les dianes del mRNA (ja que les unions són dèbils). Es pot produir una degradació del RNA missatger per la ribonucleasa E (enzim que té activitat ribonucleasa i degrada el RNA). A més a més de degradar el RNA, els sRNA també tenen efectes sobre la traducció, ja que la poden activar o inhibir.
El RNA missatger pot formar una estructura secundària on l’extrem 5’ està formant aparellament de bases amb el lloc d’unió del ribosoma (RBS) i per tant, el lloc d’unió del ribosoma queda amagat. Els sRNA poden trencar l’aparellament de bases anterior, i formar aparellament de bases amb la seqüència codificant de RNA missatger, deixant accessible el lloc d’unió del ribosoma. En aquest cas el sRNA tindrà un efecte activador sobre el procés de traducció d’aquest RNA missatger.
Però també es pot donar el cas invers. En cas que l’extrem 5’ del RNA missatger estigui accessible, no s’estarà formant un aparellament de bases entre la seqüència de RNA missatger i el RBS, per tant el sRNA podrà formar aparellament de bases amb el RBS i com a conseqüència estarà deixant el lloc d’unió del ribosoma inaccessible. En aquest cas el sRNA estarà tinguent un efecte inhibidor sobre el procés de traducció.
També tenim els ribocommutadors o riboswitchers que són RNAs missatgers que poden regular la seva expressió. Estan formats per una regió codificant i per un extrem 5’ que no és codificant. En el cas del ribocommutadors aquest extrem 5’ està format per dues regions que s’anomenen aptàmer i plataforma d’expressió. Permet l’expressió dels gens codificants, però la regulació és en resposta a un determinat lligant. Els extrems que venen a continuació participen en les rutes de síntesi d’aquests lligands.
En cas d’absència de lligand, tenim una estructura determinada de l’aptàmer i de la plataforma d’expressió, que permet la codificació de la resta de gens. Si hi ha present el lligand, aquest interacciona amb l’extrem 5’ (amb l’aptàmer) i li canvia la conformació, això es transmet a la plataforma d’expressió i provoca que la resta (la part codificant) no es pugui transcriure (no s’expressi). Els ribocommutadors tant poden afectar a nivell de transcripció com de traducció.
De ribocommutadors se n’han trobat a procariotes però també se sap que n’hi ha a llevats i en plantes. Poden afectar als processos de transcripció i traducció.
Exemples (estructura secundària) i molècules efectores En les imatges següents trobem diferents exemples de ribocommutadors (com el commutadors SAM, el de guanina, lisina o adenina) amb els seus respectius lligands.
Com hem dit els lligands afectaran a l’extrem 5’ i tant poden afectar a la transcripció de la regió codificant, com a la traducció.
A l’extrem 5’ de la seqüència de RNA missatger tenim el ribocommutador amb 4 regions que poden formar aparellaments de bases. A la part extrema, tirant a l’extrem 5’ hi ha la seqüència 1. La presència d’un antiterminador (format per l’aparellament de la seqüència 2 i 3 que forma una estructura d’stem-loop) provoca que l’extrem no afecti a la part codificant. Quan s’hi uneix el lligand corresponent, es forma un canvi conformacional, es desplacen els lligaments a l’extrem i inhibeix la transcripció.
En l’extrem 5’ tenim el lloc d’unió de ribosomes, que pot ser que no estigui formant aparellament de bases amb cap altre regió d’aquest extrem. Si és aquest el cas, el ribosoma el podrà identificar fàcilment, i la seqüència es transcriurà. Quan el lligand s’uneix a l’aptàmer, es forma un canvi conformacional, els aparellaments bases que hi havia inicialment es trenquen i es forma l’aparellament entre les seqüències 1 i 2 i entre les seqüències 3 i 4, que és el que porta el lloc d’unió del ribosoma (RBS). Es forma una estructura (terminador) que provoca que la traducció s’aturi. Al ribosoma li costa identificar aquesta seqüència de RBS, i per tant estarà afectant de manera negativa el procés de traducció.
LncRNAs També trobem tot un conjunt de RNAs que han aparegut més recentment que no pas els altres, que són els lncRNA (RNA llargs no codificants). Aquests RNA, que tant es poden trobar en eucariotes com procariotes, però sobretot són presents en eucariotes, regulen l’expressió de diferents gens i participen en processos de la cèl·lula molt importants com la diferenciació cel·lular o el desenvolupament embrionari. Tenen més de 200 bases, ja que són llargs i la seva funció principal és la regulació gènica. S’han vist lncRNA que transcriuen en determinades senyals, amb la qual cosa fan de senyal de resposta a un estímul exterior i atrauen factors d’expressió que permeten l’expressió d’un determinat gen.
Però per altra banda, també poden segrestar aquests factors, de manera que reprimeixen l’expressió gènica. Hi ha lncRNAs que són complementaris de determinades regions del genoma, de manera que fan de guia per atraure elements reguladors de la cromatina a aquelles regions, i indueixen la remodelació de la cromatina activant o inhibint l’expressió gènica. Finalment la última manera que tenen d’actuar els lncRNA és fent de bastida, on s’hi ensamblen diferents elements reguladors de la cromatina, activant o inhibint l’expressió.
Micro RNAs A banda dels lncRNA, també trobem un altre tipus de RNA, que s’anomenen RNA guia. Aquests RNAs guies participen en un procés que rep el nom d’edició dels mRNAs. Es va observar que hi havia RNA missatgers que després d’haver madurat eren incapaços d’aparellar-se amb el gen que els havia codificat. La seqüència del missatger es veu tan alterada, que ni tan sols pot arribar a reconèixer la seqüència de bases del gen que l’ha transcrit.
Hi ha un altre grup de RNAs que reben el nom de RNA volta, vault RNA (vRNA). Aquests RNAs volta van associats a proteïnes (hi ha 3 proteïnes de RNAv, amb diferents subunitats) i participen en processos de resistència de les cèl·lules a diferents fàrmacs. Els RNAs associats a les proteïnes volta formen una estructura en forma de pilota de rugby escapçada pel mig i es creu que participen en processos de resistència. Els RNA volta poden segrestar els fàrmacs (impedint que arribi a les dianes), impedir que arribin al nucli (ja que hi ha fàrmacs que només actuen al nucli) i també s’han associat a increments de l’expressió de proteïnes que actuen com a bombes expulsores dels fàrmacs (P-Gp), glicoproteines-P-gp.
H ha 2 grups de DNA que tenen funció reguladora de l’expressió gènica. Uns són els siRNA, que participen en el mecanisme d’interferència i els miRNA (típic d’eucariotes) que regulen l’expressió. Al principi van ser considerats RNA petits que afectaven parts del genoma que codificaven per proteïnes, es creia que eren RNA introduïts de l’exterior, però es va observar que si afegíem determinats gens a la cèl·lula, disminuïa la seva expressió. Els microRNA tenen un origen endogen (és a dir, estan codificants dins el genoma), mentre que els siRNA tenen un origen exogen (són introduïts des de l’exterior). Hi ha siRNA que també tenen origen endogen, i que per tant es troben codificats en el genoma.
Els microRNA estan codificats dins el genoma, i en qualsevol part del genoma (en llocs codificants, no codificants, introns, exons, etc.). Són transcrits a partir de RNA pol III o II segons on es trobi i dóna lloc a un precursor que s’anomena microRNA primari (molècula més llarga).
Aquest microRNA primari té dues cues (3’ de polia A i 5’), i internament adopta una estructura secundària per autoaparellament, que en alguns punts hi ha desparellament hi acaba amb una estructura de llaç (stem-loop).
Dins el nucli és reconegut per un complex proteic que s’anomena DROSHA. Aquest complex proteic és ajudat per una altra proteïna DGCR8 que posiciona correctament DROSHA. Un cop DROSHA està ben posicionat té activitat ribonucleasa III, que permet tallar el microRNA primari.
El punt de tall es produeix just a l’extrem contrari d’on tenim el lloc que no s’aparella i provoca un tall esbiaixat.
Aquest tall fa que s’obtingui el pre-microRNA, que encara està al nucli, però que s’ha de treure del nucli i portar-lo al citosol. El pre-microRNA és reconegut per unes proteïnes que són les exportines (exportina 5) que permeten que el pre-microRNA passi pels porus nuclears i arribi al citosol.
Conjunt de RNAs d’interferència, la seva principal funció es el silenciament de gens (fer que aquests gens no s’expressin).
La segona part és el reconeixement del pre-microRNA per una endonucleases que talla per dos punts de la cadena (no pels extrems) que RNA bicatenari. Un cop al citoplasma, un complex format per diferents proteïnes (una d’elles una endonucleasa = DICER) reconeix aquest pre-miRNA i el talla per dos punts per tal d’alliberar el segment no aparellat  Molècula d’RNA bicatenari, segment d’uns 22-23 nucleòtids/cadena. Aquest segment és el microRNA.
També es pot formar de manera exògena (ho poden fer virus, o altres cèl·lules que embolcallen els RNAs bicatenaris amb vesícules que viatgen pe corrent sanguini). Aquests que provenen de fora són els siRNA, que són captats per un complex que s’anomena RISC (Complex de Silenciament Induït per RNA) = complex de diferents proteïnes que silencia les proteïnes. Amb despesa d’ATP, desnaturalitza la doble cadena de DNA alliberant una de les dues cadenes de manera que es queda amb només una cadena (segons les proteïnes). Les distingim perquè sempre tenen un petit fragment monocatenari que pot interaccionar amb RISC i informar de quina cadena es quedarà.
RISC pot tenir diferents efectes: silenciar la transcripció (impedir la transcripció d’un gen), impedir la traducció d’un RNAm, pot catalitzar la informació d’un determinat RNA missatger, i algun cas s’han vist alguns que poden augmentar l’expressió d’un determinat gen.
Al citoplasma hi ha una RNA-polimerasa RNA dependent (rdRP) que catalitza la formació de la cadena complementaria de la cadena que s’ha alliberat (gràcies a RISC) creant un nou microRNA. És per això que els efectes dels micro/siRNA són molt dràstics  pel mateix complex de silenciament es formen noves molècules de micro/siRNA.
Diferents maneres que pot interactuar RISC: - En el cas de les plantes s’ha descrit que RISC utilitza el RNA missatger com a guia, el que fa és que RISC s’uneixi a una determinada seqüència perquè l’RNA missatger s’hi aparelli.
En plantes l’aprellament és complet (el microRNA s’ha d’aparellar de manera completa amb el RNA) i RISC talla les dues cadenes, de manera que perdem un RNA missatger. Com que estem perdent l’extrem 5’ del RNA evitem que aquest RNA hi puguin entrar ribosomes, de manera que estem aturant la traducció.
- En animals no hi ha aparellament complet dels 22 nucleòtids, per tal d’activar RISC. Pot ser que un microRNA actuï sobre diferents gens (diferents seqüències on es pot unir el microRNA).
No hi ha una degradació del RNA, sinó que només hi ha un silenciament de la traducció, sense fer-lo malbé.
Mecanisme: - Acumular p-bodies: estructures citoplasmàtiques de segment RNA, impedint que els ribosomes tinguin accés als RN. Queden emmagatzemats dintre. Acumulacions de RNAmissatger al citoplasma, que no està separada per una membrana (igual que les inclusions) que segresta els RNA missatger, de manera que evita que els ribosomes.
- Unió a l’estructura del cap, del casquet: estructura que hi ha a l’extrem 5’ del missatger i que és necessària per a la. Impedirem que s’hi pugui unir al ribosoma, de manera que estarem aturant la traducció sense fer-lo malbé.
- Inhibir la formació del ribosoma madur. Quan s’ha d’unir la subunitat gran amb la petita, el miRNA s’uneix a la subunitat petita de manera que la gran no s’hi pot unir i no pot tenir lloc la traducció.
- Un cop RISC té unit el RNA guia, en comptes d’unir-se al RNA torna al nucli i s’aparella amb el DNA (aparellament de RISC dins una zona complemantaria del DNA) i introueix canvis a les cues de les histones, en la cromatina fent que el fragment de DNA s’empaqueti més (silenciament), tot i que també pot promoure el desempaquetament (expressió del gen) L’mRNA representa un 3%. Un mRNA madur no sol sobrepassar els 2000 nucleòtids. Dins d’aquest no totes les zones són codificants ja que tenen regions UTR als extrems que no es tradueixen. Diferències entre mRNA eucariòtic i procariòtic: - En una cèl·lula procariota es pot aïllar el mRNA nu, en eucariotes és impossible: En el mateix moment en què s’està transcrivint hi ha moltes proteïnes que s’uneixen per fer diferents funcions.
- En procariotes són policistrònics (en un mRNA hi ha codificats diferents gens) i en eucariotes monocistrònics (Cada gen té el seu promotor i es regula de manera diferent). Pels mRNA policistrònics hi ha varis llocs d’unió dels ribosomes, varis AUG (codó d’inici).
- En eucariotes el mRNA ha de madurar. Els procariotes no presenten modificacions post transcripcionals, en canvi, en eucariotes pateixen varies modificacions: o CAP en 5’.
o Cua de poli A en 3’ (no codificada en el DNA).
o Eliminació d’introns.
o Metilacions (modificació de bases) o Procés d’Editing: procés de modificació de les bases.
La RNA polimerasa II té un domini C terminal d’unió de proteïnes que va madurant el RNA.
Les regions codificades en 5’ i 3 són més curtes en procariotes. En l’extrem 5’ hi ha el cap que és necessari per començar el procés de la traducció. En la regió 3’ hi ha la cua poliA.
- Ambdós són làbils i són traduïts normalment a velocitat elevada.
Estructura i modificacions dels mRNA ADDICIÓ DEL CAP A L’EXTREM 5’ Els mRNA eucariotes s’originen a partir de pre-mRNA. Hi ha d’haver un processament que comença al mateix moment que la síntesis del propi RNA. L’extrem 5’, per tant, és el primer que podrà ser modificat ja que també és el primer que es sintetitza. Aquesta modificació (cap) té diverses funcions: - Participació en les reaccions d’eliminació d’introns.
- Contribuir a l’estabilitat dels m-RNAs protegint-los de l’acció de nucleases que actuïn sobre l’extrem 5’.
- Facilitar la traducció dels m-RNAs per part dels ribosomes.
- Ancoratge a la maquinaria ribosomal per 5’.
- Contribuir a la exportació al citoplasma (exportines).
Si no hi ha el cap no es pot començar la traducció. Només el 3% dels RNAs són missatgers: el ribosoma només tradueix aquests. S’ha de poder distingir mRNA dels altres, això és possible gràcies al CAP.
Els mRNA eucariotes no tenen en 5’ la seqüència d’unió al ribosoma  perquè pugui ser transcrit el CAP ha de trobar-se ancorat a una part de la subunitat petita del ribosoma. La cua poliA també quedarà ancorada en una regió de la subunitat petita.
La formació d’aquest CAP té lloc en el moment en què es transcriu el mRNA.
1. Una fosfohidrolasa elimina un dels 3 grups fosfat de l’extrem 5’ deixant lloc a un grup bifosfat.
2. La guanilil-transferasa agafa un GTP (amb tres grups fosfat) i enganxa 1 fosfat als 2 fosfats que quedaven , alliberant un pirofosfat  formació de la unió entre l’mRNA i la guanosina (enllaç 5’-5’ trifosfat).
3. Metilacions varies que donen com a resultat diferents cap, que diferencien entre els diferents mRNAs.
SPLICING Els gens eucariotes presenten regions codificants (exons) separades per regions no codificants (introns). A partir del DNA genòmic obtenim el pre-mrNA o transcrit primari (vida mitja molt curta, de seguida són processats) que presenta la mateixa estructura que el gen. El procés d’splicing o tall i unió eliminarà els introns (del Grup III) i unirà els diferents exons donant lloc al spliced mRNA.
Els introns del grup III s’eliminen gràcies a un complex format per RNA i proteïnes, l’spliceosoma. Els extrems dels introns, tant en 5’ com 3’, cal que siguin reconeguts de manera molt precisa  A mesura que s’han anat seqüenciant aquestes regions d’introns de gens diferents, s’ha vist que existeixen seqüències consens.
- En 5’ (connexió donadora o lloc de tall i unió en 5’) trobem una seqüència que inclou 2 nucleòtids que es troben encara dins l’exó, molt ben conservada.
- En 3’ (connexió acceptora o lloc de tall i unió en 3’) trobem una seqüència que inclou 1 nuclèotid que es troba inclòs en el següent exó.
- Seqüència consens a l’interior de l’intró = Punt de ramificació. En llevats presenta una seqüència molt ben conservada i en mamífers una mica més variable. El que és totalment invariable és un nucleòtid d’adenina (A), crític per les etapes que es donen per eliminar aquests introns.
 Eliminació d’introns del grup III: Dues reaccions de transesterificació successives. Es trenquen dos enllaços fosfodièster i se’n formen dos de nous.
1. El grup hidroxil de la posició 2’ de l’anell de ribosa del nucleòtid d’A del lloc de ramificació ataca nucleofílicament l’enllaç fosfodièster de la seqüència donadora (enllaç que es troba en el límit intró-exó en l’extrem 5’).
El resultat és l’alliberament de l’exó 1. L’exó 2 quedarà unit amb l’intró formant una estructura de llaç mitjançant un enllaç fosfodièster 2’-5’.
2. Es produeix un atac nucleofílic del grup hidroxil de 3’ de l’exó alliberat sobre l’enllaç fosfodièster que hi ha en el punt de tall i unió de 3’.
El resultat és l’alliberament de l’intró que conserva l’estructura de llaç i la formació d’un nou enllaç fosfodièster que unirà els dos exons => Hi haurà dos enllaços fosfodièster: el que uneix els dos exons i el de l’estructura de llaç alliberada.
Aquest procés no requereix energia, encara que per ensemblar tota la maquinària que realitza aquestes dues transesterificacions sí necessitem energia.
Tipus d’introns - Introns Grup I: pre-RNA (nuclears, mitocondrial, cloroplasts). En bacteris i bacteriòfags.
Introns Grup II: pre-mRNA (mitocondrials, cloroplasts). En bacteris i arqueus.
Introns Grup III: SPLICESOME Introns Grup IV: pre-tRNAs de transferència Els introns del Grup I i II actuen com a ribozims (capaços de catalitzar l’eliminació dels seus introns.
ESPLICEOSOMA – maquinària de tall i unió.
Complex format per RNA i proteïnes, força gran, que conté 5 RNAsn petits i com a mínim unes 150 proteïnes. Dins d’aquestes proteïnes trobem les proteïnes generals (són idèntiques per totes les partícules U), les específiques (son diferents per cada partícula U) i les no ribonucleiques (no-snRNP).
snRNA: - Realitzen moltes de les funcions de l’spliceosoma.
Presenten CAP trimetilat.
Són exportats al citosol, s’associen amb components proteics i són re-importants al nucli (SNURP).
Dins de les diferents partícules (partícules ribonucleiques nuclears petites) hi ha: U1  Partícula que conté el snRNA U1. Uneix/reconeix la seqüència de l’extrem 5’ de l’intró i, per tant, l’RNA forma aparellament de bases amb aquest extrem. Acosta els extrems dels exons que s’han d’unir.
U2  Partícula que conté el snRNA U2. El seu RNA reconeix la seqüència del punt de ramificació (on comencen les dues etapes de trans-esferificació)).
U5  Partícula que conté el snRNA U5. Substitueix el paper de U1, presenta complementarietat de bases amb l’intró.
U4/U6  Partícula que conté el snRNA U4 i U6. L’activitat catalítica d’U6 queda emmascarada, fins que U4 i U6 no es separen no poden dur a terme les seves funcions. U6 catalitza l’splicing.
Esquema formació partícula tall i unió Comença amb l’entrada del RNA nuclear U1 que pot aparellar-se amb l’extrem 5’ de l’intró.
Tot seguit entra la partícula U2 pot formar aparellament amb la seqüència consens del punt de ramificació (A). Necessitem la participació d’altres proteïnes que estan dins la maquinaria però que no són del complex de partícules (np-snRNP) = factor auxiliar 2, factor splicing 1 i 3.
Aquestes proteïnes són necessàries perquè la interacció que es forma entre l’RNA nuclear petit i la zona corresponent de l’intró és realment una interacció feble.
Un cop ha entrat U1 i U2, el complex es completa amb l’entrada de la partícula U5 i U4/U6. L’U5 interacciona amb els extrems 5’ i 3’ de l’intró amb la qual cosa substitueix la partícula U1, la partícula U1 abandona el complex.
D’altra banda entra la partícula U4/U6 però com que estan formant aparells de bases U6 no te activitat. Aquest aparellament es trenca, U4 abandona la partícula i es forma un nou aparellament de bases entre U6 i U2. Una vegada format aquest complex, U6 serà realment ACTIU.
A partir d’aquí tindran lloc les etapes de transfosforilació i fosforilació i, finalment, els dos exons es trobaran junts + l’espliceosoma s’allibera (unit a l’intró, que segurament serà degradat) TIPUS DE SPLICING Ara bé, l’spliceosoma té diferents maneres d’actuar. El que hem vist fins ara era l’splicing constitutiu. Ara bé, el procés pot ser ben diferent. En l’splicing alternatiu l’RNA madur està format per una combinació d’alguns dels exons, però no tots. Això permet que a partir d’un sol gen s’obtinguin diferents proteïnes en funció de com es combinin els exons.
- Splicing constitutiu: es dóna a partir del transcrit primari d’un gen quan s’eliminen els introns per unió dels exons consecutius = connexions acceptores i donadores consecutives.
- Splicing alternatiu: es duu a terme quan el transcrit primari es processa per unió d’entre connexions donadores i acceptores no consecutives. A partir d’un únic gen obtinc un únic mRNA però segons el tipus d’splicing obtindré un mRNA madur o un altre = més d’una proteïna a partir d’un únic gen  Proteïnes isomorfes: provenen del mateix gen però d’un mRNA diferent. Com més exons participin en l’splicing alternatiu més mRNA madurs i més proteïnes isomorfes.
Una de les raons que com més amunt de l’escala evolutiva tinguis moltes més funcions vindria donada per aquesta característica. En un 90% dels gens humans experimenten splicing alternatiu.
Tipus d’splicing alternatius 1- Splicing alternatiu per exons combinatoris: cada exó es pot considerar com una part codificant (bloc d’informació) que pot ser incorporada o no al RNAm madur. Quan més exons participin, més variabilitat podré tenir de mRNA madur (2n).
2- Exons mútuament excloents: 2 exons que es troben de costat. El processament implica que si s’incorpora el primer exó forçosament el segon ha de quedar exclòs. Si s’incorporés el segon forçosament s’exclouria el primer. L’intró que es troba entre dos exons excloents s’anomena un fals intró ja que mai podem eliminar aquest intró.
3- Retenció d’introns: Podem unir els exons per retenció dels introns. Una part que consideràvem no codificant l’hem fet codificant. SI al procés volem obtenir una proteïna amb funcionalitat l’intró integrat haurà de mantenir la pauta de lectura del missatger que es forma = mantindrà la pauta de lectura.
4- Existència de connexions donadores o acceptores dins els exons: Directament no es tenen en compte a l’hora de connexió donadora o acceptora. Estem perdent una part de l’exó en el que serà el mRNA madur.
5- Existència de més d’un promotor o més d’una regió de finalització de la transcripció: Depenent del promotor/llocs d’inici o de la regió de finalització, vincularà per on comença la transcripció i quins exons i introns quedarien inclosos. Depenent del promotor que s’utilitzi condicionarà el tipus de splicing que tindrem del mRNA (processament del transcrit primari).
S’ha vist que l’splicing és un fenomen co-transcripcional, no post-traduccional.
Podem obtenir un gran nombre de proteïnes isomorfes, que tindran petites diferències.
CLASSIFICACIÓ DELS EFECTES FUNCIONALS DEL TALL I UNIÓ ALTERNATIUS 1. Localització cel·lular de les formes proteiques isomorfes.
2. Supressió de l’activitat proteica.
3. Modificació de l’activitat proteica (isoenzims) o capacitat unir lligands  on trobem més casos de proteïnes isomorfes.
4. Creació de noves activitats proteiques.
5. Afecta l’estabilitat del m-RNA i l’eficiència amb què aquests són traduïts.
Exemple Splicing Alternatiu 1: Troponina T Subunitat de la Troponina (proteïna que participa en la contracció muscular). Aquesta esta formada per dos subunitats: Troponina C  Principalment uneix Calci Troponina I  principalment activa Troponina T  principalment uneix tropomiosina Els exons estan processats per un mecanisme d’exons constitutius, per tant 1,2,3,9,15 els trobarem de forma madura al transcrit. Els exons que van del 4 al 8 son processats per un mecanisme d’splicing alternatiu que és el de Splicing Alternatiu per exons Combinatoris. Com que hi han 5 EXONS puc arribar a tenir 2^5, per tant 32 missatgers madurs si s’expressen tots tindria la possibilitat d’obtenir 32 proteïnes isomòrfiques.
Dins dels exons d’aquest transcrit primari, el 16 i el 17 son processats per un mecanisme d’exons mútuament excloents. Si s’introdueix l’exó numero 16 s’obté la proteïna ∝ de la TnT (múscul esquelètic adult). Si ‘¡introdueix l’exó numero 17 s’obté la proteïna 𝛽 de la TnT (múscul embrionari). Com que hi ha dos exons mútuament excloents hi ha 64 formes isomòrfiques totals.
La raó per la qual es dona aquesta variabilitat de proteïnes isomòrfiques és perquè el domini que esta codificat dels exons del 9-15 no presenta variabilitat, aquest indica que és crític per la funció que ha de tenir aquesta proteïna T ja que es igual a totes les proteïnes isomorfes.
D’altre banda hi ha un domini amb elevada variabilitat que s’ha vist que aquest porta a una regulació molt fina del que es la contracció muscular.
Hi ha un tercer domini que té una variabilitat lleugera que es el que correspon a les propietats reguladores necessari en diferents estadis del desenvolupament cel·lular.
Exemple Splicing Alternatiu 2: Calcitonina El gen que codifica per la calcitonina esta format per 6 exons separats per els corresponents introns. Aquest gen es pot expressar en diferents productes.
Aquest mecanisme consisteix en 2 lloc de finalització de la transcripció i segons quin lloc triï es produiran uns o altres productes.
Hormona: Un cop traduït el missatger madur, hi ha el precursor de la calcitonina (precursor hormonal) hi ha proteïnes que son traduïdes i encara no dona la proteïna activa, perquè esdevingui activa li cal un processament post-transcripcional li caldrà unes proteases que tallin l’extrem N-terminal i el C-terminal deixant la part central que codificarà per la Calcitonina Activa = procés de captació de calci.
Cervell: Incorporació de tots els exons excepte el número 4. El transcrit, es traduït i la regió del precursora d’una proteïna relacionada amb el gen de la calcitonina. Aquest precursor necessita processament post-transcripcional que és idèntic al de l’hormona. Aquest pèptid no té funció d’hormona sinò que té activitat neuro-reguladora i esta relacionada amb el sentit del gust. A partir d’un gen obtenim dos missatgers madurs i, per tant, dues proteïnes amb funcions totalment diferents.
REGULACIÓ DEL TALL I UNIÓ ALTERNATIU Quan té lloc l’splicing alternatiu totes les seqüències dels llocs de tall i unió son idèntiques. La maquinària que duu a terme l’splicing és sempre la mateixa. Com aquesta maquinària pot processar el transcrit primari d’una manera o una altra? Com es regula? 1. Degut a canvis en les concentracions o activitats dels factors generals o específics que participen en el procés.
Ex 1: Factors generals. Els RNA nuclears petits presenten heterogeneïtat de seqüència.
La interacció dels RNAs nuclears petits amb els punt d’unió serà depenent de l’afinitat d’aquesta molècula amb la regió. La que tingui més regió serà a la que s’enganxarà.
Ex 2: Factors específics. Si la concentració dels factors és elevada, s’eliminarà l’intró.
En canvi si hi ha concentracions baixes no s’eliminarà.
2. Presència de proteïnes reguladores específiques Tenim diferents elements en CIS i en TRANS. Podem tenir dins els introns o els exons seqüències que són silenciadores o intensificadores (CIS), perquè puguin fer la seva funció han de ser reconegudes per elements en TRANS (proteïnes reguladores) Ex 1 Element en CIS silenciador de l’Splicing. Si la seqüència no interacciona amb cap element en trans la maquinaria no s’hi pot unir i es durà a terme un tipus de processament. Les proteïnes de la família SR (elements en TRANS) reconeixen el lloc de silenciament i s’hi uneix impedint que es dugui a terme el procés d’splicing (impedeix l’entrada de la maquinària).
També es pot donar el cas contrari, és a dir, que es necessiti d’un activador que ajudi al reconeixement entre spliceosoma i RNA per tal que s’inicii el procés.
ADDICIÓ DE LA CUA DE POLIA A L’EXTREM 3’ Es porta a terme per un complex enzimàtic que conté diferents tipus de proteïnes que és atret quan encara té lloc el procés de transcripció (processos co-transcripcionals). La mateixa RNApolimerasa (domini C terminal?) atrau tot aquest complex que modifica l’extrem 3.
Tall del transcrit primari que es produeix entre 10 i 30 bases més avall d’una sequencia rica en nucleòtids d’adenina. Una vegada alliberat l’extrem 3’, la poliadenilat-polimerasa, a partir d’ATP, va incorporant al ‘extrem 3’ una cua d’adenines.
La cua de poli A és més llarga o cruta segons el missatger, va de 80-200 bases.
La poliadenilació dels mRNAs té diferents funcions: - Protecció en front de la degradació per nucleases que actuïn sobre l’extrem 3’.
Pot actuar com a senyal per exportar els mRNA cap al citosol.
Ancoratge de l’extrem 3’ a la maquinaria ribosomal pel procés de traducció. És a dir, contribueix a la eficàcia del procés de traducció.
EDICIÓ DEL MRNA Les edicions del mRNA són modificacions de la seva seqüència una vegada aquest ja ha estat transcrit. N’hi ha de dos tipus: - Desaminacions: hi intervenen dos enzims. La citidina desaminasa canvia C per U, que aleshores s’aparella com una T. L’adenosina desaminasa (ADAR) canvia A per I, que aleshores actua com una G. Ara bé, aquests enzims només reconeixen certes estructures terciàries de RNA.
Per exemple greixos i colesterols viatgen per la sang a l’interior d’estructures lipoproteiques formades per fosfolípids, ja que si viatgessin soles formarien agregats que taponarien els vasos sanguinis. A més hi ha una proteïna que determina la direcció de tot el complex.
Apoliproteina B està implicada en tot aquest procés de transport de greixos. Ara bé, apoliproteina B de VLDL i de quilomicrons no és la mateixa proteïna encara que provingui del mateix gen i pateixi el mateix splicing. Això és degut a que el procés d’edició que pateix és diferent.
Es canvia el codó CAA per un UAA, que és un codó d’STOP. Aleshores s’atura la traducció i la proteïna resultant és més curta.
- Mitjançant RNA guia: s’insereixen uridines. No es canvia només una base per una altra sinó que tot el marc de lectura es veu alterat. El que determina on es farà la inserció és l’RNA guia. Aquest té una cua de poliU complementaria a la de poliA a l’extrem 3’ i una seqüència d’ancoratge complementaria al fragment de mRNA a l’extrem 5’. Al centre hi ha una part central no complementaria, que indica on es farà l’edició.
El procés consisteix en un aparellament entre l’RNA guia i l’mRNA. Ara bé, aquest aparellament no és perfecte ja que la seqüència del mig del gRNA no és complementaria i, per tant, aquesta zona queda desaparellada. Aleshores el complex talla l’mRNA per allà on no està aparellat i s’afegeixen uridines fins a tornar a unir el buit.
La informació genètica continguda en un RNA corregit deriva de dos “gens”: el que codifica el mRNA i el que codifica el gRNA.
Possibles FUNCIONS del procés d’Editing: 1- Produir més d’una proteïna a partir d’un únic gen o mRNA inicial.
2- Afectar l’expressió del gen.
...

Comprar Previsualizar