T.8- Aplicacions de la citogenètica a la pràctica clínica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 4º curso
Asignatura Bioquímica analítica i clínica
Año del apunte 2016
Páginas 11
Fecha de subida 05/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Bioquímica Analítica i Clínica TEMA 8. APLICACIONS DE LA CITOGENÈTICA A LA PRÀCTICA CLÍNICA Les anormalitats cromosòmiques estan presents en : - 1% dels nounats vius - 2% en embarassos de dones > 35 anys - Meitat dels abortaments espontanis del primer trimestre de l'embaràs Incidència d'aneuploïdies en humans, és el desordre més comú i clínicament més significant en humans: - Total d'embarassos: 5% - Dones embarassades de més de 40 anys: 33% - Naixements: 0.3-0.5% - Aborts espontanis: 35% - Naixements morts o nens que neixen i es moren (stillbirth): 4% Alteracions cromosòmiques Les constitucionals són aquelles que es produeixen abans del naixement i hi haurà cèl·lules que tinguin l'anomalia cromosòmica i d'altres no. Les adquirides s'adquereixen després d'haver nascut.
Indicacions clíniques de l'anàlisi cromosòmic 1. Estudis citogenètics constitucionals - Pre-natal, en líquid amniòtic o biopsia de còrion: edat materna avançada, fill anterior amb anomalia genètica, antecedents familiars, detecció de malformacions per ecografia, historial d'avortaments de repetició, triple screening alterat, progenitors portadors de variants/anomalies cromosòmiques, FISH en espermatozoides alterada, participació a cicles de DGP (fecundació in vitro).
- Post-natal, en sang perifèrica: infertilitat, retard mental, anomalies fenotípiques (malformacions múltiples, retràs del creixement), mort al naixement.
35 Bioquímica Analítica i Clínica En el diagnòstic prenatal es detecten anomalies congènites fetals majoritàriament degudes a cromosomopaties.
A partir del diagnòstic prenatal es pot calcular el càlcul de risc d'anomalies congènites fetals (11-12 setmanes) que depèn de l'edat materna, el cribatge ecogràfic i el cribatge bioquímic del 1er i 2on trimestre. El càlcul del risc ens dóna una probabilitat no una certesa, per això es recomana fer un diagnòstic que si que ens donarà una certesa. També es pot fer el diagnòstic d'anomalies congènites fetals: biopsia de corion, amniocentesi. A part també podem mesurar la translucència nucal.
Determinació del risc en el diagnòstic prenatal, recomanacions clau: 1- A totes les dones s'oferirà el programa de cribatge de primer trimestre: - Setmanes 8-13: extracció de sang per la determinació de fracció lliure BhCG i PAPP-A - Setmanes 11-13: realització de l'ecografia per datar l'edat gestacional i mesurar la translucidesa nucal.
2- Es realitzarà un càlcul de risc (a terme) de cromosopatia d'acord amb els marcadors anteriors: - Baix risc (<1/250): control normal de l'embaràs - Alt risc (>=1/250): s'oferirà i s'informarà de la possibilitat de realitzar una prova invasiva diagnòstica (biòpsia corial o amniocentesi).
3- A aquelles dones que accedeixin a la consulta més enllà de la setmana 14 s'oferirà la possibilitat de participar en el cribatge de segon trimestre.
- Extracció de sang per la determinació de fBhCG, AFP, uE3 i Inhibina A.
4- Es realitzarà un càlcul del risc de cromosomopatia d'acord amb els marcadors anteriors: - Baix risc (<1/250): control normal de l'embaràs i ecografia a la setmana 18-20 - Alt risc (>=1/250): s'oferirà i s'informarà de la possibilitat de realitzar una prova invasiva diagnòstica (amniocentesi).
5- A totes les dones, a la setmana 18-20, es realitzarà una ecografia morfològica que inclou el cribatge de defecte de tub neural.
Diagnòstic prenatal Edat materna: per edats mare > 35 anys o pare >45 anys es procedeix directament a realitzar el diagnòstic prenatal.
Cribatge ecogràfic: Detecta moltes alteracions amb base genètica.
Risc de detecció d'aneuploidia: - 80% translucència nucal - 80% en presència de hydrops fetalis abans de la setmana 17 - 75% en presència de hygroma quístic - 70% en presència d'un canal A-V - 60% en presència de holoprosencefalia - 40% en presència de onfalocele 36 Bioquímica Analítica i Clínica - 30% en presència de hydrops fetalis després de la setmana 24 - 30% en presència de defecte cardíac - 30% atrèsia duodenal - 25% hèrnia diafragmàtica - 25% obstrucció bufeta També detecta trastorns de creixement com l'acondroplàsia.
Cribatge bioquímic A l'screening bioquímic s'analitzen dues proteïnes en sang, la gonodotrofina coriònica i la pregnancy associated plasma protein A (PAPP-A). Aquestes dues proteïnes juntament amb l'edat materna i la translucència nucal es posen a una fòrmula que ens dóna un risc. Si aquest risc és més gran que 1/250 de tenir una anomalia cromosòmica, es recomana fer una biopsia de corion per tenir un diagnòstic cert de si hi és o no. Si el risc és més baix, se l'informa a la pacient de que té una probabilitat petita tot i que existeix. Això es fa durant el primer trimestre.
37 Bioquímica Analítica i Clínica Si no s'han pogut fer les mesures al primer trimestre, en el segon trimestre es fan una sèrie de mesures en sang.
Es mesura la PAPP-A, la gonodotrofina coriònica que es combinen amb el resultat de la ecografia i l'edat materna i ens dóna un risc. El punt de tall és més baix que en el primer trimestre. Si hi ha un risc de 1/190 es recomana fer una prova de diagnòstic invasiu com l'amniocentesi i si és més petit no. Amb aquest punt de tall es té una sensibilitat del 80% (probabilitat de detectar una anomalia).
Diagnòstic invasiu Amniocentesi: Es realitza entre les setmanes 14 i 16 de gestació. El procés consisteix en l'obtenció de 20 ml de líquid amniòtic a partir d'una punció amb una agulla a través de l'abdomen fins a l'interior de l'úter sota control ecogràfic. El tipus d'estudi cel·lular que es duu a terme és FISH i un cultiu de 15 dies que permet fer les bandes.
Els avantatges de l'amniocentesi és l'alta qualitat de les metafases (permet fer un diagnòstic amb alta seguretat), la baixa taxa de contaminació materna (ja que són cèl·lules únicament del fetus) i la detecció de mosaics. Les limitacions d'aquesta prova és el risc de pèrdua fetal (0.5%-1% sobre el risc basal que té qualsevol embaràs en aquesta etapa de la gestació), que no detecta deleccions per sota de la resolució del cariotip (no detecta Sd. Microdelecció).
Biòpsia de Corion: Es realitza entre les setmanes 10 i 12 setmanes de gestació. El procés consisteix en obtenir vellositats coriòniques per extracció abdominal o transvaginal i sota control ecogràfic. El tipus d'estudi cel·lular que es pot fer és un cultiu de 3 dies que ens permet veure bandes.
Els avantatges de la biòpsia de còrion és que es realitza en el primer trimestre de gestació, enfront a l'amniocentesi que es realitza en el segon trimestre de gestació. Possibilita informació genètica més precoçment que l'amniocentesi. Contribueix a la reducció de trastorns psicologics de la mare, i en el cas d'interrupció de l'embaràs, suposa avantatges obstètriques.
Les limitacions són la quantitat i qualitat de les metafases obtingudes, la contaminació materna, pèrdua fetal degut al risc de la tècnica d'extracció (1%-2% sobre el risc base existent en el primer trimestre de gestació), no detecta delecions per sota de la resolució del cariotip (no detecta síndrome microdeleció), mosaicismes confinats a placenta.
En la biopsia de corion es fa un cultiu de 24 hores i un cultiu de 15 dies com si fos una amniocentesi. Si els dos cultius coincideixen en el resultat donem el resultat per bo. Si no coincideixen els resultats a la setmana 16 es realitza l'amniocentesi.
Quan ja tenim els resultats tant de l'amniocentesi com de la biòpsia de corion es poder fer estudis citogenètics o estudis moleculars.
En tots els casos on s'observa un mosaic o una aneuploidia cromosòmica rara es aconsellable realitzar un estudi de líquid amniòtic per confirmar el cariotip fetal.
A partir del diagnòstic prenatal invasiu es poden fer estudis citogenètics com el cariotip o FISH a través d'un cultiu de cèl·lules fetals o es poden fer estudis moleculars com la QF-PCR o arrayCGH o seqüenciació a través de l'extracció de DNA de cèl·lules fetals.
38 Bioquímica Analítica i Clínica Mètodes d'anàlisi citogenètica Anàlisi de bandes G - Cultiu del teixit obtingut → cèl·lules en divisió: metafases - Extracció del cultiu - Tinció amb colorants específics → patró de bandes Un avantatge és que té una alta fiabilitat ja que s'analitzen tots els cromosomes i un inconvenient és que els resultats tarden un termini llarg (4-15 dies).
* Quan es cultiva sang perifèrica s'ha de posar un agent estimulador de la mitosi. En l'amniocentesi i en la biopsia de corion no fa falta perquè les cèl·lules ja estan creixent.
Hi ha un moment en que parem el cultiu amb colchicina que inhibeix la formació del fus mitòtic. S'extreu el nucli per poder separar els cromosomes. Es tenyeixen les metafases amb Giemsa.
Hibridació in situ fluorescent (FISH) Pot aplicar-se tant a material no cultivat (nuclis interfàsics) com en cultivat (metafases i nuclis interfàsics).
Cromosomes 21/1/13/sexuals.
Un avantatge és que permet obtenir el resultat cromosòmic en 24 hores només d'alguns cromosomes i un inconvenient és que s'ha de completar amb un anàlisi de bandes.
39 Bioquímica Analítica i Clínica Síndrome de Lejeune o cri-du-chat o del miolar del gat: monosomia 5p Té una incidència de 1 de cada 7000 nounats. El cariotip seria 46, XX, del(5)p. La regió crítica delecionada és el 5p15. La zona crítica la pèrdua de la qual determina el plor característic és la banda 5p15.3.
Característiques: plor característic (miolar) per hipoplàsia de la laringe, cara rodona que es modifica amb l'edat, epicantus, estrabisme, hipoplàsia d'ossos nasals, malformacions diverses, retràs mental greu.
Translocacions robertsonianes (rob) Tenen lloc entre dos cromsomes acrocèntrics. El portador té 45 cromosomes. El cariotip és 45, XX, t(13;14)(q10;q10).
No solen tenir cap repercusió clínica pel portador, però poden ser origen de gàmetes monosòmiques o trisòmiques.
Trisomia 21: Síndrome de Down Té una incidència de 1 cada 800 nounats. El cariotip és 47, XX o XY, +21. Les característiques principals són: retràs mental, hipotonia al nèixer, alçada baixa, mans curtes i amples, clinodactilia del dit petit i plec palmar únic. Orelles d'implantació baixa i plegament típic. La cara en el Síndrome de Down té una fenedura palpebral cap amunt i enfora. Epicantus, heterocromia del iris (taques de Brushfield), amb el nas ample i pla.
Boca petita amb llengua prominent, coll curt i ample amb pell laxa al clatell.
FISH Es necessiten unes sondes específiques, és una tècnica fluorescent. S'ha de coneixer abans que volem estudiar. Es pot fer en cèl·lules amb interfase de qualsevol teixit. És una tècnica complementaria.
Amb sondes podem buscar mutacions en gens, telòmers o centròmers. Altres sondes són les painting que es pinta els cromosomes de colors.
FISH prenatal Els avantatges són la rapidesa de la prova (24-48 hores), no necessita cèl·lules cultivades, redueix el nivell d'ansietat dels pares.
Les limitacions són que no exclou aneuploidies d'altres cromosomes no analitzats en les sondes ni alteracions estructurals cromosòmiques. En mostres de líquid amniòtic amb contaminació hemàtica materna el resultat pot ser no informatiu. Sempre ha de complementar-se amb el cariotip fetal.
Síndrome DiGeorge Té una incidència d'1 de cada 2000-4000 naixements. El cariotip és 46, XX, del22q11. La deleció pot ser sospitada mirant el cariotip i pot ser confirmada per FISH ( líquid amniòtic) ja que es veu una pèrdua del senyal.
És una de les delecions citogenètiques més comunes. El fenotip clínic és anomalies craniofacials, retard mental i defectes del cor.
40 Bioquímica Analítica i Clínica Diagnòstic genètic pre-implantacional (DGP) Serveix per evitar transmetre anomalies genètiques a la descendència en families que es coneix història de malalties genètiques. Es necessiten les tècniques de fecundació in vitro.
Indicacions: - Alteracions del cariotip en els progenitors (portadors de variants o anomalies cromosòmiques).
- Edat materna avançada - FISH espermatozoides alterada - Avortaments de repetició - Errades repetides de cicles de FIV/ICSI: fecundació in vitro - Malalties lligades al sexe: FISH per selecció de sexe. Ex: hemofilia (Xq27) o Distrofia muscular de Duchenne (Xp21).
Si el pare és afecte es seleccionen els embrions masculins. Si la mare és portadora es fa una selecció dels embrions femenins que poden ser portadors perquè els masculins si ho haguessin heredat serien afectes.
Diagnòstic citogenètic pre-implantacional (DGP) Es pot fer fecundació in vitro (FIV) o injecció intracitoplasmàtica d'espermatozoides (ICSI).
Primer es fa estimulació ovàrica i després s'aspiren els òvuls. També s'obté i es procesa el semen, es cultiven els espermatozoides i ovòcit perquè hi hagi fecundació. Quan hi ha l'embrió format es fa un DGP i després s'implanta a l'úter. Es transfereixen a la mare els embrions de 5 dies. El DGP és fan al dia 3 que és quan l'embrió té 6-8 cèl·lules i té blastocist. S'agafa una cèl·lula que s'analitza. Es poden fer diagnòstics citogenètics i moleculars. També es pot fer el diagnòstic en els corpuscles polars i segons el que trobem podrem estipular com serà l'embrió tot i que s'acostuma a fer a partir de la cèl·lula de l'embrió. En aquesta cèl·lula es fa un FISH i es poden fer un genoma amplification, tècniques moleculars i CGH que és una tècnica molecular que detecta guanys o pèrdues en el DNA.
Amb el FISH amb 24 hores tenim el resultat i podem descartar els embrions que no són bons. Amb les altres tècniques necessitem més temps per tenir els resultats i per això els hem de congelar cosa que no és gaire recomanable.
Transferència d'embrions sans a l'úter: durant el procés de diagnòstic es mantenen en cultiu o es congelen, 3 màxim, 35% d'embaràs (tasa baixa).
Els avantatges són que es poden fer varies rondes d'hibridació sobre el mateix blastòmer i analitzar diversos cromosomes, que és una tècnica ràpida que permet donar el diagnòstic en un termini curt (5-6 hores) i que es poden detectar embrions anormals abans d'implantar-los.
Els inconvenients són que no es coneix la dotació cromosòmica de l'embrió i que es poden produir errors d'hibridació que portaran a errors de diagnòstic.
41 Bioquímica Analítica i Clínica Si només tenim una cèl·lula es fan diverses hibridacions per poder utilitzar diverses sondes. Amb les sondes telomèriques podem veure els dos telòmers de cada cromosoma i així saber si hi ha una dotació cromosòmica normal o no.
- FISH en blastòmer: screening d'aneuploidies, DGP per translocacions Indicacions clíniques de l'anàlisi cromosòmic Estudis citogenètics en anomalies adquirides: citogenètica en neoplasies, finalitat diagnòstica, pronòstica i terapèutica. Es fa en el propi tumor o en fluids corporals en contacte amb la neoplasia.
Diagnòstic del càncer de bufeta per FISH - Citologia urinaria: no gaire sensible per graus baixos. Observació en el microscopi de cèl·lules de la orina.
- Cistoscòpia: invasivitat. S'introdueix una càmera de la uretra fins la bufeta. És una mica dolorós.
Amb FISH podem veure 4 cromosomes que sabem que estan alterats (3,7,17 → ampliats i es perd una regió del cromosoma 9). En aquest FISH hi ha tres sondes centromèriques pels cromosomes 3, 7 i 17 i una sonda 42 Bioquímica Analítica i Clínica específica per la regió del cromosoma 9 que es perd.
S'agafen les cèl·lules de la orina, es fa una extensió i s'hibriden amb les quatre sondes i veiem si el grup de cèl·lules de la orina tenen una dotació cromosòmica correcta. Com que les cèl·lules de la bufeta es van descamant, acaben a la orina i per això podem analitzar a través de la orina la presència de càncer de bufeta. En les cèl·lules afectades també veiem els nuclis més grans. Es poden arribar a tenir 8 copies del cromsoma 3 (p.e). Si veiem això a la orina es fa un diagnòstic i es passa a fer les proves invasives.
* En el microscopi de fluorescència no es poden posar tots els filtres de cop.
Diagnòstic del càncer de bufeta per FISH - Veiem la deleció homozigota de 9p21 - Amplificació cromosomes 3,7,9 i 17 Citogenètica del càncer de bufeta 43 Bioquímica Analítica i Clínica La citologia té un 100% d'acerts i la FISH té un 93% d'acerts ( a un 7% de pacients surt que tenen tumor quan no en tenen). En canvi en la sensibilitat veiem que el FISH la té al 76,3% mentre que la citologia no arriba al 48% , té un 47,3%.
La situació ideal és la cistoscòpia.
Alteracions gèniques implicades en el desenvolupament d'un tumor Proto-oncogens: - Són gens que la funció normal del seu producte gènic és promoure la proliferació cel·lular.
- Si la mutació li confereix un guany o canvi de funció, la proliferació cel·lular esdevé augmentada.
- Els proto-oncogens mutats s'anomenen ONCOGENS.
La reorganització cromosòmica pot fer que el cromosoma estigui activat constantment perquè té un promotor al davant mutat.
44 Bioquímica Analítica i Clínica En el cas de la leucèmia mieloide crònica hi ha una translocació entre el cromosoma 9 i el 22. En el cromosoma 9 hi ha el gen que codifica per Abl i al cromosoma 22 hi ha el gen BCR. El Abl és un protooncogen, és una tirosina quinasa. El BCR no se sap molt bé la funció que té.
En la translocació es produeix una hibridació entre una part de Abl i una part de BCR, no sempre té la mateixa llargaria. Aquesta translocació fa que la tirosina quinasa citosòlica (Abl) estigui constantment activa i per tant està donant senyals de creixement constantment.
El diagnòstic de la leucemia mieloide crònica es fa per cariotip i algun cop a través de FISH. El tractament que reben els malalts són inhibidors de la tirosina quinasa. El seguiment de la malaltia és va per PCR a través d'extraccions de sang.
Pronostic significance of chromosome change in acute lymphoblastic leukemia in children La major supervivència és dels t(12;21), després t(1;19), t(4;11) i finalment t(9;22) amb un 25% de supervivència.
Activació per amplificació gènica (càncer de mama) El 15-25% dels càncer de mama tenen amplificat el HER2. Els gens s'activen per duplicació. En un teixit normal hi ha dues copies del HER2 que és una tirosina quinasa de membrana que per ser activa necessita dimeritzar.
El tractament es fa amb herceptin (transtuzumab) que és un anticos que no permet que la tirosina HER2 dimeritzi i per tant no pot fer la seva funció.
45 ...

Comprar Previsualizar