Seminario 4 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2016
Páginas 2
Fecha de subida 21/04/2016
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Biología Celular. Seminario 4.
Fraccionamiento subcelular Técnicas de rotura y fraccionamiento de células y tejidos Ultrasonidos mediante una barra metálica que vibra a frecuencia ultrasónica. Las células se suspenden en soluciones tampón en las que también se pueden añadir detergentes más o menos fuertes dependiendo si lo que queremos es permeabilizar las membranas o lisar las células y/o los orgánulos membranales. Si lo que queremos es preservar los orgánulos internos pero lisar la membrana se añade sacarosa, que igualara la osmolaridad de la célula evitando que el detergente lo lise todo. Entonces se pueden hacer pasar las células por un agujero pequeño a alta presión para romperlas o utilizar un tubo de vidrio con un embolo giratorio para romperlas. El tipo de técnica viene determinado por el estudio que le sigue. Cuando las membranas de retículo y de Golgi se lisan vuelven a formar pequeñas vesículas que constituyen la fracción microsomal. El resultado serán diferentes orgánulos de diferentes tamaños y diferente composición.
Para separar los distintos componentes se utiliza la centrifugación. P=mg. Se le llama Fuerza centrífuga relativa (FCR) a la fuerza centrífuga mínima a la que la partícula precipita, que será n veces P. FCR=nP=ng Se utilizan múltiplos de gravedades para determinar la FCR. Para crear la FCR se debe girar la muestra a gran velocidad. La FCR se traducirá en rpm del motor.
Existen diferentes tipos de centrifugas dependiendo de sus máximos rpms y de sus máximas g (3000g a 600.000g) o ultracentrífugas que llegan a 100.000 rpm y en las que se ha de hacer el vacío y mantener a temperatura fría mediante refrigeración para que no se incendie.
También existen diferentes tipos de rotores, fijos, que no mueven la muestra más allá de girarla o rotores basculantes que ponerlos tubos primero verticales y a medida que giran los ponen horizontales debido a la fuerza centrífuga.
El número de gravedades que se utilizan para precipitar cada partícula es fijo (mitocondrias= 20.000g, 1000g=núcleos). Lo que cambia es la centrifuga, depende del rotor, del radio de rotación, etc... Las centrifugas llevan una tabla de valores que relaciona las gravedades con los rpms. También existe una fórmula: FCR=0.0000118*r*N^2 Donde r es el radio en centímetros desde el centro de rotación hasta el fondo del tubo, y donde N es el rpm.
Las centrifugas actuales permiten seleccionar rpms o gravedades indistintamente.
Una vez rotas las células se obtienen un lisado celular o un homogeneizado celular que se pasaran a sedimentar. Así se irán aplicando fuerzas centrifugas progresivamente mayores para ir depositando las diferentes partículas por peso. -->Centrifugación diferencial.
(Apuntes página 5, abajo) Si a partir de la misma muestra vamos aplicando g crecientes tendremos diferentes tubos con los diferentes compuestos separados por peso.
Cuando se quisieran separar mitocondrias de lisosomas, se resuspendería la fracción en un tampón y se añadiría a un tubo donde hay una solución de sacarosa en un gradiente creciente a medida que se baja por el tubo. Al centrifugarlos en este medio, los separa por gradiente de densidad, haciendo que se separen unos de otros. Un gradiente de sacarosa del 5 al 20% separaría los lisosomas de las mitocondrias.
El resultado, se pincha el tubo por debajo y se recogen las fracciones por orden en diferentes tubos. (Seria como correrlos en un gel de Agarosa, pero del cual después se puede recuperar). Sedimentan en función del tamaño. Si se centrifuga por horas se quedara todo abajo.
Si se utiliza un gradiente más acusado del 20 al 70%, el orgánulo se quedara en aquella zona cuya densidad del medio se iguale a su densidad propia del orgánulo. Separando por densidades. Si se centrifuga por horas, se quedara todo en el mismo sitio.
El gradiente se establece mediante disoluciones crecientes de sacararosa que se van poniendo en el tubo, y como las densidades son diferentes no se mezclan.
Separación de proteínas mediante electroforesis Separamos las proteínas en un campo eléctrico (Western Blot), la velocidad de movimiento a través del gel y la dirección determinan su tamaño y su carga neta. Como no todas las proteínas tienen carga, se utiliza SDS para dar densidad a la solución y unirse a las cadenas polipeptídicas, adquiriendo carga negativa.
Se moverán, por tanto, hacia el polo positivo; y se separaran según su tamaño (las más pequeñas irán más deprisa y las grandes, más lentas). Además, se utiliza Beta-Mercaptoetanol (agente reductor) que suple las interacciones disulfuro entre proteínas no monoméricas, y por tanto, quedan todas las subunidades separadas y sin interacciones intramoleculares.
Para poder visualizar las proteínas, se deben marcar. No se marcara antes de hacer la electroforesis ni mientras las proteínas están en el gel. Se pasan las proteínas a una membrana y en ella es donde se realiza la tinción inmunocitoquímica. La tinción puede ser mediante anticuerpos primarios o secundarios, pero se ha de lavar la muestra, después, para eliminar el exceso de marcador.
En un momento de estrés térmico, las proteínas desnaturalizan y se induce la expresión de xaperonas.
Por inmunodetección, se pueden detectar los niveles de esas proteínas o de las xaperonas, y comparar los niveles con aquellas células que no han estado sometidas a choque térmico.
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