Tema 9.1 (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Genètica
Año del apunte 2013
Páginas 16
Fecha de subida 17/10/2014
Descargas 38
Subido por

Vista previa del texto

Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 ESTRUCTURA I FUNCIÓ DEL MATERIAL GENÈTIC: REPLICACIÓ, TRANSCRIPCIÓ I TRADUCCIÓ La replicació, la transcripció i la traducció són processos que podríem considerar equivalents en eucariotes i procariotes.
Tot i això, procariotes no vol dir que siguin idèntics. En aquesta assignatura majoritàriament parlarem d’eucariotes. Així doncs, es tracta de mecanismes conservats i només hi hauran alguns detalls que seran diferents.
Una diferència fonamental entre aquests mecanismes si pensem en un bacteri o en una cèl·lula de mamífer és la velocitat d’avenç de la replicació ja que la bacteriana és molt més gran que la eucariota. En conseqüència, el procés serà més ràpid en un bacteri que en un eucariota. Si trobem que la diferència no és molt gran, podrà ser conseqüència que en el cromosoma de mamífer el nombre d’orígens de replicació és més gran.
Una altra diferència és el nucli ja que les cèl·lules eucariotes el tenen completament diferenciat, de manera que per tal que es produeixi un procés cal un determinat temps. En un bacteri, aquests tres processos són simultanis, en canvi una cèl·lula de mamífer necessita una seqüència temporal. Això pot semblar trivial però és molt important.
En conseqüència, tenen diferents temps de regulació als canvis ambientals ja que les cèl·lules bacterianes ho fan més ràpidament.
Així doncs, a nivell de traducció són aspectes de detalls ben diferenciats però el procés està conservat per l’evolució.
LA TRANSFORMACIÓ BACTERIANA EN STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Al 1928 Griffith va fer un experiment i tot i que ha passat molt de temps, continua sent una estratègia experimental vàlida.
El Streptococcus pneumoniae causa pneumònia i pot ser mortal en alguns mamífers com ara en humans o ratolins. Es van fer experiments amb diferents soques de pneumococos, on extreien una substància X dels individus morts per aquestes soques mortals.
La idea era que es podia aïllar la substància que fos la causant de la transformació bacteriana, és a dir, una soca adquireix un caràcter que en aquest cas és la virulència que abans no tenia. SI un considera que aquesta característica té una base genètica i som capaços d’extreure aquest material i inocular-lo en un altre individu, podem esperar que aquella característica es manifesti a l’experiment.
Al 1928 el concepte de DNA no existia. En aquell moment parlaven de cromosomes, material genètic, etc. tot i que no sabien què era. El que sí que estava descrit era la doble hèlix del DNA. Així doncs, aquests són experiments que de mica en mica s’acosten a quin és el material genètic hereditari majoritàriament (posteriorment es va veure el cas dels virus de RNA) i que no són les proteïnes. En principi a aquest material ells el van anomenar transformant.
Més endavant, quan ja es coneixia més el DNA encara hi havia autors que deien que al fer l’anàlisi química d’aquella substància transformadora es detectava una petita fracció de proteïna. Com que en aquell moment molta gent pensava que les proteïnes era el més important, no creien que una fracció molt petita fos la que fes referència a les proteïnes.
1 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Millorant les tècniques experimentals es va aconseguir aïllar la matèria transformant i es va veure que aquesta era el DNA.
A partir d’aquí, amb una seguretat del 100% ja que no hi havia cap dubte d’arrastrar cap altre compost, s’estava segur que es tractava del DNA.
COMPONENTS DELS ÀCIDS NUCLEICS Quan pensem en els components o en les unitats que composen el material genètic (DNA) pensem en: adenina, timina, guanina i citosina. Aquestes bases nitrogenades s’uniran a un esquelet on hi ha el fosfat i el sucre que és una pentosa. El sucre en el cas del DNA serà la ribosa i en el cas del RNA la desoxiribosa.
Observem que tenim 4 elements diferents, les bases nitrogenades, i un esquelet comú per tots ells. El fet d’aconseguir tanta variabilitat amb només 4 elements diferents ve donat pel fet que tenim una cadena molt llarga on no hi ha cap restricció que en un punt de la cadena es col·loqui una base o una altra.
Sabem que la molècula de DNA és de doble cadena. Per tant, una vegada és fixa la seqüència d’una cadena, l’altra ja està establerta en cada posició ja que a les dues cadenes, les bases han de ser complementaries. Aquesta complementarietat es compleix, en principi, sempre.
Les dues cadenes són antiparal·leles de manera que la seva polaritat no és la mateixa, i per tant, és important indicar quin és l’extrem 5’ i quin el 3’.
Els aparellaments complementaris es mantenen mitjançant ponts d’hidrogen, concretament entre adenina i timina en tenim 2 i entre citosina i guanina en tenim 3.
La desnaturalització parcial d’un fragment de DNA fa referència a una localització en la qual s’ha desfet totalment o parcialment els ponts d’hidrogen entre les bases del DNA i es forma una mena de bombolla que deixa oberta la cadena. Hi ha molts procediments experimentals per desnaturalitzar, com per exemple la calor. Cal tenir present que si no mantenim l’element desnaturalitzant, les bases tindran tendència a unir-se de nou. Així doncs, si nosaltres volem fer un experiment i mantenir la desnaturalització, haurem de mantenir l’agent desnaturalitzant per aconseguir-ho. Sabem que una regió rica en citosina i guanina serà més difícil de desnaturalitzar ja que en aquella zona hi ha un nombre superior d’enllaços per pont d’hidrogen. Recordem que entre C-G hi ha 3 ponts d’hidrogen i entre T-A només 2.
2 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 REGLES DE CHARGAFF Abans d’arribar als anys 50 i fonamentalment gràcies als estudis d’un investigador: Chargaff, es va observar que en analitzar el DNA de diferent procedència (vedella, fetge de bou, bacteris, llevats...) les proporcions de A-T i G-C es mantenien iguals.
Això passava perquè hi ha complementarietat, per tant en un DNA de cadena doble hem de tenir tantes C com G i tantes A com T. S’ha de complir que les proporcions de: A + G = C + T, és a dir, proporció de purines = proporció de pirimidines.
Si parlem de RNA, a les bases nitrogenades tenim uracil (U) en comptes de timina. Tot i això, si estem analitzant DNA trobem un petit percentatge d’uracil. Es va arribar a la conclusió que a vegades hi ha processos naturals que fan que de forma transitòria, per desaminació d’una citosina, aparegui un uracil en el DNA. Com que aquest uracil no és reconegut com una base pròpia del DNA tenim els enzims uracil glucosilases que de manera específica tallen els uracils i com que tenim la cadena complementària, es torna a sintetitzar la base que corresponia a citosina.
Dues línies d’evidència Quan ja se sabia la proporció de les bases complementaries, i per tant, el tema químic a nivell de quantitats moleculars estava determinat, encara hi havia qüestions sense resoldre: no se sabia com estava configurada aquesta molècula que se suposava que era de doble cadena. Per arribar al model de la doble hèlix, que actualment està acceptat, a més dels temes relacionats amb els ponts d’hidrogen i les proporcions entre les bases, va jugar un paper molt important el fet que es coneixes coses sobre l’estructura de proteïnes.
Per una banda va intervenir L. Pauling que havia proposat un model de DNA amb 3 cadenes. Per una altra banda, per fer els estudis del DNA es requerien fer fotografies de difracció de raigs X i que fonamentalment ho van fer Rosalind Franklin i Maurice Wilkins, van observar que es repetien uns patrons de forma regular i que la molècula presentava una mena d’esglaons on la distància entre els quals es mantenia constant.
La primera vegada que es descriu de manera correcta l’estructura de la hèlix del DNA van ser uns estudis molt curts i sintètics elaborats per Watson i Crick. El model proposat, posteriorment, es demostra que és la forma biològica la qual tenim el DNA a les cèl·lules i funciona. Ells arriben a aquesta conclusió sense haver fet cap experiment, és a dir, llegint el que els altres diuen van arribar a elaborar aquest model.
3 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Interpretació del patró de difracció dels raigs X Per tal d’entendre un espectre s’ha de fer un estudi profund sobre aquest i sobre el que s’està veient. A la imatge de la dreta les taques regulars fan referència a les parelles de bases que, òbviament, com que la hèlix gira, van canviant en cada volta.
MODEL EN METALL DEL DNA En totes les altres propostes del DNA que s’havien fet, les bases s’havien imaginat a l’exterior de la molècula ja que es pensava que si estaven a l’exterior, alguns processos com ara el de replicació es podia elaborar més fàcilment, però aquesta idea no és correcta.
Si l’important pel que fa a la informació no és el sucre ni el fosfat, sinó que són les bases, quan estan a l’exterior són més atacables i degradables. Així doncs, la millor manera és que estiguin a l’interior unides. Com que els ponts d’hidrogen és un tipus d’unió feble, a la cèl·lula no li costa gaire separar les dues cadenes, de manera que quan estan separades hi ha total llibertat per transcriure, replicar, etc.
Tot i que els ponts d’hidrogen siguin febles, aconsegueixen mantenir l’estructura del DNA perquè és una cadena molt llarga de manera que hi ha una gran quantitat d’enllaços al llarg de tota la molècula.
DESNATURALITZACIÓ DEL DNA La desnaturalització del DNA consisteix en la separació de les seves dues cadenes i un mètode per fer-ho és elevar la temperatura a la qual es troba. Sabem que una major proporció de G-C en un DNA implica una major temperatura de desnaturalització ja que en regions G-C el nombre de ponts d’hidrogen és més elevat.
Molts autors quan parlen de desnaturalització del DNA empren la paraula fusió.
4 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 ESTRUCTURA DEL DNA Hèlix levògires i dextrògires En el moment en el que es publica el treball de Watson i Crick s’estava estudiant la possibilitat que les molècules en forma d’hèlix fossin levògires (giren cap a l’esquerra) o dextrògires (giren cap a la dreta). Ells van proposar que el DNA és una molècula dextrògira i per tant que gira cap a la dreta.
Avui dia se sap que podem trobar DNA levògir: el DNA Z. Si mirem als llibres podrem observar que es descriuen diverses estructures del DNA. D’aquestes cal fer una diferenciació:  Estructures B que són biològicament actives i majoritàries en tots els DNA de tots els organismes  Estructura Z que té una conformació de ziga-zaga on l’estructura de la molècula passa de ser helecoidal a més angulosa. És una forma que una part del DNA pot adoptar i aquesta forma Z pot estar associada a la capacitat de transcripció o no d’aquell DNA.
Així doncs, la forma i la funció del DNA veiem que estan relacionades.
Dades sobre el DNA En el DNA hi ha dos tipus de solcs: el major i el menor i que estan repartits al llarg de la molècula. Cal saber una sèrie de dades sobre el DNA ja que podrien ser necessàries per elaborar alguns dels problemes a l’examen. Hem de saber que:  La distància entre les bases consecutives és de 3,4 Å (34 nm).
 Entre el solc menor i el major hi ha 10 parelles de bases. Per tant, cada 34 Å s’elabora el canvi de solc major a menor.
 Les dues cadenes antiparal·leles tenen bases complementaries. Com a valor representatiu, podem dir que la distància que les separa és de 20 Å o 2 nm.
Quan un sap la distància entre les bases adjacents, si ens donen una llargada, podem saber quantes bases hi ha a aquesta molècula. Si a més a més, se sap quin és el pes de la base nitrogenada, també es pot relacionar amb la quantitat de massa del DNA contingut en aquell tros.
Relació estructura del DNA i herència La estructura del DNA subministra una explicació enormement simple del fenomen de l’herència. Per una banda, la separació de les cadenes és un mecanisme bàsic per entendre una replicació fidel.
El fet que un canvi de base pugui representar un canvi d’aminoàcid, i per tant un eventual canvi fenotípic permet justificar de manera immediata canvis observables a partir de canvis puntuals. En aquest sentit hem de pensar que quan un està pensant en un canvi puntual i ha de generar una mutació, aquell canvi ha de ser transmissible i heretable. Si el canvi no ha estat fixat, no es considera una mutació.
5 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Relació estructura del DNA i funció La estructura del DNA va molt bé per portar la informació ja que es tracta d’una molècula molt llarga que al disposar de 4 elements variables que es poden combinar de qualsevol manera, tenim una gran potencialitat de variar una informació sense tenir moltes peces en el puzle.
La complementarietat és important ja que un cop està definida la seqüència d’una cadena, ja està definida l’altre. De manera que no hi ha graus de llibertat. Quan el DNA s’ha de replicar, tindrem dos motlles antiparal·lels i que finalment obtindrem la molècula original gràcies a la complementarietat del DNA.
A la transcripció en tindríem dues poblacions de missatgers diferents ja que hi hauria dos possibles motlles o patrons.
Experimentalment es va veure que per cada DNA que s’està transcrivint únicament obtenim un missatger, de manera que només tindrem una còpia d’un dels motlles. En principi, la transcripció es fa copiant una sola cadena però això no ho podem agafar al peu de la lletra ja que per a un gen determinat pot ser que s’hagi de transcriure la regió d’una part del motlle, però que una altra necessiti la cadena.
El que sí que és cert és que per un mateix gen (unitat transcripcional), el missatger únicament se sintetitza a partir d’una sola cadena, de manera que no hi ha hibridació.
REPLICACIÓ DEL DNA Quan una molècula de doble hèlix s’obre i ha d’anar cap a replicació es genera una tensió des del punt de vista físic molt important. Això dificulta l’avenç de la replicació, de manera que necessitem uns enzims que són coneguts com DNA topoisomerases i que tallen una o les dues cadenes del DNA per evitar la tensió, és a dir, ajuden a avançar en la replicació.
Les topoisomerases tenen noms concrets i es diferencien en:  Topoisomerasa tipus I que talla una única cadena de DNA.
 Topoisomerasa tipus II que tallen les dues cadenes del DNA.
Possibles models de replicació En un principi es van proposar tres models alternatius per la replicació del DNA però avui dia se sap que el model correcte és el model de la replicació conservativa.
Replicació conservativa.
En la replicació conservativa tota la molècula de DNA de cadena doble serveix com a motlle per la nova molècula de DNA i la molècula de DNA origina es conserva en la seva totalitat durant la replicació.
6 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Replicació dispersiva En la replicació dispersiva les dues cadenes de nucleòtids es dispersen, és a dir, es divideixen en fragments que serveixen com a motlles per la síntesi de nous fragments de DNA. Posteriorment, els fragments es tornen a assemblar per donar la molècula complerta. Les cadenes tindran material antic o nou de manera aleatòria.
Replicació semiconservativa La replicació semiconservativa és un procés intermedi entre els dos models anteriors. En aquest cas les dues cadenes se separen i cadascuna serveix de motlle per a la síntesi de una nova molècula de DNA.
Experiment de Meselson y Stahl Hi ha diferents aproximacions experimentals per demostrar que el model semiconservatiu és el correcte. Un dels experiments més coneguts és el que van fer Meselson i Stahl.
Aquests científics van treballar amb bacteris i ells sabien que degut a com havien cultivat aquelles cèl·lules, l’element químic podia servir com a marcador per diferenciar les molècules de DNA noves i velles. Ho van fer a partir d’isòtops de nitrogen. El nitrogen 14 és la forma comú i el nitrogen 15 és una forma pesada poc comuna.
Ells van fer créixer els bacteris en un medi de cultiu que només tenia una font de nitrogen 15. Després d’una gran quantitat de generacions, tots els bacteris haurien incorporat el nitrogen 15 en les bases de purina i pirimidina. El que van fer és agafar una mostra d’aquests bacteris i es van introduir en un medi només amb nitrogen 14. Posteriorment es van anant agafant mostres de diferents generacions cel·lulars.
Així doncs, cada mostra de DNA bacterià sintetitzat abans del canvi de medi contenia nitrogen 15 i era relativament pesat, en canvi, el DNA sintetitzat després del canvi de medi estava composat per nitrogen 14 i era relativament lleuger.
7 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Ells van diferenciar els dos tipus de DNA (lleuger i pesat) a partir d’una centrifugació en gradient de densitat on després de al centrifugació allò més dens anirà cap al fons. Es va veure que el DNA dels bacteris en un medi amb nitrogen 15 presentaven una sola banda, els bacteris que havien estat transferits de medi presentaven una banda intermèdia entre la del DNA només amb nitrogen 15 i la de DNA només amb nitrogen 14.
Així doncs, aquest experiment no és compatible amb el model de replicació conservativa on esperaríem una banda pesada (referent a les molècules de DNA originals) i una banda lleugera (referent a les molècules de DNA noves). Per una altra banda, tant el model semiconservatiu com el dispersiu predeien una sola banda intermèdia.
Per tal de diferenciar entre els dos models, Meselson i Stahl van proliferar els bacteris en un medi amb nitrogen 14. Després de segon cicle de replicació en medi amb N14, van apareixer dues bandes d’igual intensitat: una en posició intermèdia i l’altre en posició de DNA que només conté nitrogen 14. Es van analitzar les mostres produïdes en cicles de replicació posterior i es van continuar obtenint dues bandes però ara la que feia referència al DNA lleuger es tornava cada cop més intensa.
En conclusió, els resultats de Meselson i Stahl eren exactament els que s’esperaven en la replicació semiconservativa i no eren compatibles amb els models de replicació conservativa i dispersiva.
Enzims que participen en la replicació En qualsevol procés de traducció o transcripció participen una sèrie d’enzims, alguns dels quals són fonamentals, és a dir, que sense ells el procés no funciona. A vegades pot passar que davant la falta d’un enzim, el procés es pugui dur a terme gràcies a un altre enzim que en principi no té aquella funció però que la pot fer.
La replicació, la traducció i la transcripció són molt semblants a nivell d’organització però no són idèntics. Pel que fa als enzims que intervenen en la replicació del DNA tenen nomenclatura en funció del tipus d’organisme: 8 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Bacteris En bacteris els enzims que són capaços de sintetitzar el DNA són la DNA polimerasa I, II i II.
Pel que fa a la DNA polimerasa I podem dir que es va aconseguir replicar un cromosoma sencer. Tot i això no es tracta d’un enzim replicatiu sinó que és una polimerasa que in vivo el que fa fonamentalment és participar omplint els forats que es poden generar amb els encebadors o bé els que s’han generat per l’eliminació de seqüències equivocades. Per tant, quan hi ha un error i s’elimina la base mitjançant un tall, la polimerasa I és l’encarregada d’omplir el forat.
Les DNA polimerasa II i III són les principals polimerases replicatives, sobretot la del tipus III.
Per tal que puguin funcionar cal que hi hagi l’extrem 3’ amb el OH lliure. Si en aquella cadena no hi ha aquest extrem lliure, encara que hi hagi l’enzim, no podrem treballar. Això fa que l’addició en una o en l’altre cadena sempre té el mateix sentit: 5’3’. Com que les dues cadenes són antiparal·lels, una d’elles (la cadena avançada) es pot replicar de forma continua però en canvi, la seva complementaria haurà d’anar replicant mitjançant petits fragments que són anomenats fragments d’Okazaki en honor a la seva investigadora.
Eucariotes En eucariotes les DNA polimerases tenen una altra nomenclatura. En aquest cas s’anomenen com: alfa, beta, epsilon,etc.
Així doncs, el nom de les polimerases ens permet determinar si es tracta d’un bacteri o bé d’un organisme eucariota.
És important que, al revés de com s’afegeixen els nucleòtids de nova síntesi en bacteris, el mateix enzim que afegeix els nucleòtids pot dur a terme una activitat correctora. Això és interessant ja que imaginem una replicació, si aquesta funciona bé, les bases incorporades a la cadena de nova síntesi seran complementàries i per tant les parelles estaran ben fetes. A vegades pot haver-hi un error, per exemple que davant d’una A s’incorpori una Co una G. Podem considerar una taxa -5 -7 d’error normal en el procés d’addició de 10 . Si actuen els enzims que corregeixen, l’error final és de 10 , de manera que tindrem menys bases amb un aparellament incorrecte.
Hi ha un aspecte relativament interessant i és que aquests valors corresponen a la situació normal però, a vegades hi ha enzims mutants que corregeixen amb una major eficàcia. En aquestes situacions que són bastant estudiades en bacteris, la a replicació seria més fidel que la estàndard.
Cal tenir present que les polimerases conegudes només afegeixen nucleòtids en el sentit 5’  3’. Això és degut que si tenim l’extrem 3’ lliure no hi ha cap problema perquè la polimerasa II vaig incorporant nucleòtids, però com que en la cadena complementaria ens falta l’extrem lliure no podem continuar, en aquest cas per tal que es produeixi la nova síntesi cal que hi hagi una petita molècula inicial coneguda com a primer o encebador.
9 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Replicació contínua i discontínua Cal tenir present que l’encebador no és DNA sinó que és RNA. En principi pot estar afegit per una primasa, que s’encarrega de sintetitzar el primer, o bé per una RNA polimerasa.
L’encebador no té res a veure amb la informació genètica de la molècula i únicament servirà perquè a partir d’ell hi hagi un extrem 3’ lliure a partir del qual la polimerasa pugui actuar. Quan tenim uns quants nucleòtids afegits, el primer és eliminat i deixa un forat que és omplert per la corresponent DNA polimerasa.
Recordar que en els procariotes, la mida dels fragments d’Okazaki és molt més gran que en els eucariotes. Per donar un valor representatiu: en bacteris són d’un mínim de 1500 pb i en eucariotes d’uns 150.
Quan un estudia els enzims implicats en qualsevol d’aquests processos veu que hi ha un que no és específic però que participa en tots ja que si una cadena o molècula de DNA s’ha tallat, per refer la continuïtat necessitem d’una DNA ligasa. Hi ha cèl·lules o organismes que penant en reparació diem que reparen poc i quan observem els seus enzims de reparació veiem que són correctes però alhora representen un dèficit important en ligases. Per tant, no és que no reparin perquè no tenen ligasa sinó perquè aquesta no funciona correctament i no pot finalitzar el procés.
CARACTERÍSTIQUES DE LES DNA POLIMERASES EN BACTERIS E. coli DNA Polimerització Exonucleasa Exonucleasa polimerasa de 5’3’ de 3’  5’ de 5’  3’ I Sí Sí Sí Elimina encebadors i omple el buit II Sí Sí No Reparació III Sí Sí No Allarga DNA (síntesi) IV Sí No No V Sí No No Funció Reparació de baixa fidelitat En bacteris diferenciem les polimerases segons la seva nomenclatura en números romans. Podem trobar més de 5 DNA polimerases però aquestes són les més importants.
Si un diu que hi ha 3 DNA polimerases implicades en el procés de replicació del DNA bacterià és correcte ja que la IV i la V, encara que siguin capaces de sintetitzar un fragment, no són enzims replicatius sinó enzims de reparació i per tant, dissenyats per omplir un buit que s’ha produït per una escissió.
Les DNA polimerases I i IV, que participen en la reparació, són enzims amb una fidelitat baixa, és a dir, que incorporen molts errors en la seqüència de bases.
10 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 A nivell històric, la primera DNA polimerasa que es va descobrir és la I,però aquesta no és l’encarregada de fer créixer el cromosoma, d’allargar la cadena ja que aquesta és la III. La DNA polimerasa I el que fa és eliminar els primers i a més a més és capaç de sintetitzar per omplir el forat que queda quan és eliminat.
La DNA polimerasa II és un enzim que bàsicament participa en reparació. Avui dia se sap que aquest enzim també està implicat en reiniciar aquella replicació que ha estat aturada quan hi ha un dany ja que una manera d’eliminar un dany és aturant el procés a la fase de síntesi i aleshores intentar arreglar-ho. Un cop s’ha arreglat, el procés ha de continuar i és la DNA polimerasa II la que intervé.
A nivell de selectivitat, totes les que són capaces d’afegir un tros més gran o més petit han de tenir una activitat polimeritzadora en el sentit 5’ 3’.
Si en un exemple ens parlen de polimerases i el seu nom està indicat en nombres romans, podrem afirmar que es tracta d’un procariota.
CARACTERÍSTIQUES DE LES DNA POLIMERASES EN EUCARIOTES Podem fer una taula amb enzims implicats en el procés de replicació eucariòtic. Només parlarem de mamífers i no de plantes. Quan en algun exemple trobem que un enzim actua amb una fidelitat molt baixa vol dir que aquell procés no l’està fent de manera molt correcta, de manera que Les polimerases més importants són: DNA Polimerització Exonucleasa polimerasa de 5’3’ de 3’  5’ α Sí No Iniciació de la síntesi i reparació.
β Sí No Reparació i recombinació.
γ Sí Sí Replicació i reparació del DNA mitocondrial.
δ Sí Sí Síntesi de la cadena avançada i retardada. Reparació.
ε Sí Sí Funció Replicació de la cadena avançada i possiblement reparació nuclear.
Fa un moment fèiem referència a la cadena avançada i a la retardada. Cal saber que la cadena avançada és la que se sintetitza en el sentit 5’3’ ja que la polimerasa podrà sintetitzar-la de cop, en canvi la cadena retardada s’haurà de sintetitzar trosset a trosset i això és més lent. Per tant, encara que al final es repliquin les dues, la velocitat és diferent.
Alguns autors a la cadena avançada l’anomenen leading.
11 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 REPLICACIÓ DEL DNA (2) Per a la replicació de la cadena retardada cal afegir un encebador que proporcioni l’extrem 3’OH lliure a la polimerasa per tal que pugui actuar, els encebadors són molècules petitones que sempre són de RNA i que poden ser produïts per la primasa o bé per la RNA polimerasa. Els fragments d’Okazaki que es creen tenen una mida diferents segons es tracti d’eucariotes o bé procariotes: en eucariotes són d’uns 150 pb i en procariotes de 1500.
Quan a partir de l’encebador, la primasa ha pogut actuar i ha afegit un fragment, aleshores l’encebador ja pot ser eliminat.
Per tant, queden unes regions foradades que s’han d’omplir. Com que davant del forat hi ha la cadena motlle, hi ha la informació perquè davant de la base es fiqui la cadena motlle. Aquests processos són molt fidels, és a dir, si parlem d’un -5 -7 bacteri pot haver-hi un error de l’ordre de 10 i que si després hi ha una correcció de prova pot baixar a 10 .
En la cadena retardada en teoria hi hauria una discontinuïtat. Per tant, sigui replicació, sigui reparació o recombinació, quan ens queden dos extrems lliures, si no els ajuntem gràcies a l’acció d’una lligasa el procés no seria viable ja que no podem tenir una molècula fragmentada, el DNA ha de tenir una continuïtat. El paper de les lligases en el funcionament del DNA són fonamentals per tal que el procés pugui acabar correctament.
Imaginem que això es tracta d’un cromosoma bacterià, de manera que és un cromosoma de DNA de cadena doble i circular. Als anys 60 quan s’estava estudiant la replicació hi havia dues qüestions: si hi havia un origen de replicació o més d’un i l’altre era saber si la replicació avançava en els dos sentits. Avui dia se sap que en un cromosoma bacterià hi ha un sol origen de replicació, en E. Coli és l’ Ori C, i a partir d’aquí se sap que les cadenes avencen pels dos costats fins replicar completament la molècula de DNA. Cal tenir present que la replicació és bidireccional però s’està referint a que va en els dos sentits, en aquest cas s’està fent un mal ús de la paraula.
A la imatge veiem un cromosoma d’E. Coli, però els plasmidis també poden tenir aquesta estructura, tot i que són més petits. D’entrada, totes les molècules de DNA doble tenen un sol origen de replicació i l’avanç és bidireccional.
Aquest dibuix correspon a una autoradiografia, és a dir, que aquelles cèl·lules bacterianes que s’estaven dividint i per tant hi havia reproducció cromosòmica, s’exposaven una substància com ara la timidina trítiada que permetien veure el que 12 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 estava passant. Amb aquest procés es van observar aquestes figures on hi havia una replicació que més o menys avançava d’aquesta manera i es formava una estructura coneguda com bombolla de replicació. A mesura que la forca avançava es feia més gran i arribava un moment, abans que tinguéssim tota la replicació nova, es veia una mena de llengua i que alguns autors l’anomenen theta. Totes aquestes estructures demostraven que la replicació tenia un sol origen.
Experiment amb cromosoma d’un fag Es va fer un experiment molt senzill que sense utilitzar grans aparells va aconseguir demostrar en un cromosoma d’un fag que en cromosomes circulars hi havia un sol origen de replicació amb un avenç bidireccional.
Quan tenim un DNA, aquest manté la seva estructura gràcies als ponts d’hidrogen entre les bases nitrogenades. Recordem que entre A – T hi ha dos i entre G – C hi ha 3. Per tant, per lògica, desfer una regió rica en G – C costarà més que una regió rica en A – T. Ara bé, sigui el que sigui, si som capaços de desnaturalitzar parcialment la molècula, en lloc de tenir la mateixa separació entre cadenes, s’obre. Per tant, físicament, quan tenim una zona desnaturalitzada pot semblar una mena de bombolla deguda a la distància entre les bases.
Cal tenir present que la bombolla generada per una desnaturalització parcial i la bombolla de replicació no tenen res a veure en quant al seu contingut.
Aquest investigador sabia que en aquest fag hi havia una regió rica en A – T i per tant, relativament fàcil de desnaturalitzar.
En aquests processos no és suficient desfer momentàniament els ponts d’hidrogen ja que si vols seguir tenint aquella regió desnaturalitzada perquè sigui un senyal o una marca, has de mantenir la regió desnaturalitzada. Per això tenim mètodes fisicoquímics que ens permeten mantenir-ho.
Imaginem que en un punt determinat és l’origen. Si resulta que la replicació hagués avançat de manera unidireccional, la bombolla de replicació no agafarà la bombolla desnaturalitzada fins a un cert moment (depèn de cap a quin costat sigui la replicació). En definitiva, sigui una situació o una altra, veiem que tardem temps diferents per arribar. Al fer l’experiment es va veure que com que la replicació avançava en els dos sentits, mentre que un anava progressant sense trobar la zona desnaturalitzada, l’altra banda la trobava més o menys de seguida. Per tant, com que aquesta segona versió és el que ell va trobar, es podia afirmar que hi havia un sol origen amb un avenç bidireccional.
Aquest experiment va tenir molt poca repercussió però és un experiment molt senzill, econòmic i que demostra el que es volia demostrar. Un punt negatiu podria ser que no es va fer en un cromosoma bacterià sinó que es va fer en un fag.
13 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Definicions A mesura que van avançant els coneixements, hi ha una certa tendència a crear noms. Tot i que el més important és saber quins són els mecanismes amb els que actuen.
Definim replisoma com el conjunt d’enzims(complex enzimàtic) encarregat de la replicació que coordina la síntesi de les dues cadenes.
El primosoma és una estructura formada per dos enzims: la primasa que és l’enzim encarregat de fabricar l’encebador, que si no trobem aquest enzim hi haurà una RNA polimerasa que té la mateixa funció. També trobem una helicasa que és important perquè per poder replicar cal desfer o desenrotllar les dues cadenes, i aquest enzim permet fer-ho.
Si la replicació avença, aleshores hi haurà una tensió molt important i que per poder desfer-la és important que hi hagi un altre enzim anomenat girasa que és una topoisomerasa que és capaç de tallar el DNA i desfer la tensió extra. En el DNA trobem del tipus I i II que tallen una o dues cadenes respectivament.
Quan desnaturalitzem, hem de mantenir desnaturalitzat. En el fons, en la replicació del DNA hi ha unes proteïnes que s’anomenen ssb (proteïnes d’unió a cadenes senzilla). Si tenim el DNA desnaturalitzat amb les cadenes obertes i no l’estabilitzem, la cadena senzilla es tornarà a tancar. Si ara hi ha les ssb, estabilitzaran la cadena senzilla i permetrà que quedin separades.
Si tenim una molècula de DNA doble i circular aquest pot ser o bé d’un plasmidi o d’un bacteri i en aquest sempre trobarem un únic origen de replicació. Un cromosoma bacterià és una unitat de replicació i per tant l’anomenarem replicó. A analitzar la seqüència nucleotídica de l’origen de replicació de diferents cromosomes bacterians, aquestes tenen un grau de consens molt gran, acostumen a tenir un grau de semblança molt elevat, en general sabem que les seqüències que a nivell funcional tenen un paper transcendental acostumen a tenir un grau de conservació també elevat.
REPLICACIÓ DEL DNA EN EUCARIOTES Origen de replicació Pel que fa als eucariotes sabem que presenten més d’un cromosoma i òbviament aquest, quan la cèl·lula s’ha de dividir s’han de replicar. El mecanisme de replicació d’eucariotes no té res a veure al que hem vist anteriorment en procariotes ja que en eucariotes hi ha més d’un origen de replicació. En general, en tot el genoma eucariota trobarem com a mínim centenars d’orígens de replicació (en cada cromosoma tenim més d’un origen) fins a milers: en llevats 500 i en mamífers 60.000 en nombres generals.
14 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Ens fixem que si hi ha un origen de replicació i aquest és inicials als anteriors pot tenir una bombolla més gran i per tant, hem de tenir present que no sempre totes les bombolles de replicació tenen el mateix tamany. Si elaborem un estudi in vitro d’autoradiorradiograia i exposem una cèl·lula a timidina radioactiva i més tard la transferim a la mateixa forma no radioactiva en excés observarem com s’estén el DNA sobre un portaobjectes i després elaborem la autorradiografia. Segons la interpretació que es mostra a la següent imatge, hi hauria diferents punts de replicació en una mateixa hèlix del DNA.
Replicació del DNA eucariòtic Sabem doncs que dins els cromosomes hi haurà entintats de replicació anomenades replicons; a partir de l’origen tindrem que quan el replicó s’activa s’inicia el procés de divisió i aquest avençarà en dos sentits. Per tant, el que tenim en els cromosomes eucariotes són diversos orígens de replicació que s’activen i que en X temps s’activaran uns altres de manera que, no hem de pensar que els replicons actuen independentment els uns dels altres sinó que hi ha un conjunt que funcionen al mateix temps. Hem de tenir en compte, a més, que la velocitat en eucariotes és molt més petita que en procariotes i com que sabem que el genoma eucariota és més gran s’ha de compensar aquesta diferència de velocitat augmentant el nombre d’origen de replicació. Tindrem doncs, regions del DNA o de cromatina que presentaran una replicació més primerenca mentre que d’altres tindran una més tardana, més a finals de la fase S.
En quant a la replicació del DNA hem de tenir present el funcionament de diferents proteïnes importants:  Replisoma: és un complex enzimàtic que ajuda a la replicació ja que coordina la síntesis de les dues cadenes  Primosoma: està format per dos enzims, la primasa i la helicasa (desenrotlla el DNA)  Proteïnes d’unió a cadena senzilla (ssb, unió Y, que estabilitzen el DNA d’aquest tipus de cadena)  Topoisomerases de tipus I i II: permeten la relaxació del superenrotllament Observem a continuació diferents esquemes del procés de replicació: 15 Judith Gonzàlez Gallego Genètica T9.1 Nivells de cromatina Una manera de classificar o distingir a nivell de cromatina dels eucariotes cal fer la distinció entre eucromatina i heterocromatina, que són funcionalment diferents ja que tenen un grau de compactació diferent:  Eucromatina: és aquella cromatina que sempre té el mateix grau de compactació i visualització en quant al seu color.
 Heterocromatina: és aquella cromatina que pot variar el seu grau de compactació, pot passar de ser una cromatina activa a ser una inactiva o al inrevés. Com a conseqüència d’aquest fet no sempre la veurem de la mateixa manera al microscopi.
Aquests dos aspectes també els podem relacionar amb els termes facultatiu i constituïu: direm que una zona és constitutiva sempre que presenti un patró heterocromàtic mentre que serà facultativa si el seu patró depèn del moment. Un exemple d’heterocromatina és el corpuscle de bar, que un cop elaborat no es pot desfer.
Generalment hem de tenir present que aquella regió que té més compactació ho té més difícil per expressar els gents que contenen i per tant, difícilment podrien elaborar la seva funció. Així doncs, quan analitzem les diferents regions cromàtiques, les heterocromàtiques són aquelles de replicació més tardana (fins al final de la fase S no es repliquen).
Replicació d’un cromosoma lineal Hem de tenir present que la replicació d’un cromosoma lineal no presenta cap problema si la cadena és contínua però si aquesta és discontinua si que poden haver-hi problemes, que són solucionats per l’acció de les tesomerases, que faciliten a la cadena continuar la polimertizació.
16 ...