Mòdul 2: Mecanismes bàsics de replicació del DNA (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Genòmica Humana
Año del apunte 2014
Páginas 8
Fecha de subida 12/02/2015
Descargas 31
Subido por

Vista previa del texto

Mòdul  2:  Mecanismes  bàsics  de  la  replicació  del  DNA     La  replicació  de  la  molècula  del  DNA  segueix   un   model   semiconservatiu,   és   a   dir,   es   conserven   la   meitat   de   les   cadenes   originals.   Implica   la   separació   de   la   doble   hèlix   i   la   polimerització  de  dos  noves  cadenes  a  partir   de   les   cadenes   originals,   que   anomenarem   cadenes  motlle.  Tot  això  estarà  regit  per  unes   proteïnes  conegudes  que  ja  estudiarem.       La   demostració   d’aquest   model   es   fa   fer   a   través   de   la   impregnació   amb   isòtops   radioactius   de   la   doble   cadena   original.   Les   cadenes   que   posseïen   aquests   isòtops   es   pogueren   aïllar   als   laboratoris   en   un   tub   d’assaig   pel   diferents   gradient   de   densitat   (com  mostra  la  imatge).     Aquest   experiment   va   permetre   doncs   aprovar   el   model   semiconservatiu   i   descartar   les   altres   dues   hipòtesis:   el   model   conservatiu  i  el  model  distributiu.       Com   hem   comentat   abans   la   replicació   del   DNA   està   regulada   per   un   conjunt   enzimàtic  de  separar  les  dues  cadenes  motlle  originals  o  parentals  i  sintetitzar  les   cadenes  noves  o  filles.       La   forca   de   replicació   és   el   lloc   concret   on   es   separen   les   dues   cadenes   originals.   Aquesta   estructura  fa  avançar  la  síntesi  del  DNA  de  forma   semiconservativa.     Dóna   al   DNA   que   s’està   replicant   una   aparença   en  forma  d’ull  entre  el  DNA  que  no  es  replica.     Hi   ha   dos   models   de   replicació:   unidireccional   i   bidireccional.     En   el   model   unidireccional   es   crea   una   sola   forca   de   replicació.  En  canvi,  en  el  model  bidireccional  es  creen   dues   forques   de   replicació   que   es   mouen   en   direcció   oposada.   El   model   bidireccional   és   el   que   trobem   en   l’espècie  humana.       Els   replicons   són   aquells   segments   de   DNA   que   contenen  els  orígens  de  replicació.  Propis  de  l’espècie   humana  i  d’unes  200kbp.  Es  poden  fusionar  entre  ells.       És   important   saber   que   l’addició   de   nucleòtids   sempre   té   lloc   en   l’extrem   3’   (encebador).  En  altres  paraules,  el  DNA  es  sintetitza  des  de  l’extrem  5’  a  l’extrem   3’.     El   nucleòtids   es   van   afegint,   normalment,   seguint   la   complementarietat   de   les   bases   nitrogenades:   A-­‐T   i   G-­‐C.   Aquesta   reacció   està   catalitzada   per   la   DNA   polimerasa,   que   actua   de   l’extrem   5’   cap   a   l’extrem   3’   de  la  nova  cadena  o  naixent  (de  3’-­‐>  5’  sobre  la  cadena   motlle).   També   presenten   una   activitat   correctora   per   evitar  errors  en  la  complementarietat,  però  no  és  del  tot   eficaç   i   a   vegades   tenim   mutacions   de   les   que   ja   en   parlarem  en  altres  temes.     La   DNA   polimerasa   té   forma   de   mà   i   està   formada   per   tres  dominis  (polze,  dits,  palmell).  El  DNA  monocatenari   entre  per  un  orifici  i  se  li  afegeixen  el  nucleòtids  sortint   per  un  altre  orifici  ja  bicatenari.     Totes   les   DNA   polimerases   requereixen   un   extrem   3’-­‐ OH   per   començar,   és   a   dir,   no   poden   començar   la   replicació.  Qui  inicia  la  replicació  és  la  primasa.         La   primasa   no   requereix   una   estructura   en   doble   cadena   per   iniciar   la   polimerització.   Sintetitza   una   seqüència   inicial   de   nucleòtids   d’unes   10bp   que   conformen   el   RNA   primer,   sobre   el   qual   iniciarà   l’actuació   la   DNA   polimerasa   i   que   posteriorment   serà   reemplaçat  per  DNA.       A   causa   de   la   disposició   antiparal·lela   del   DNA,   el   mecanisme   de   replicació   és   diferent   per   a   les   dues   cadenes  naixents.  Distingim  doncs  dues  cadenes:   -­‐ Conductora  o  leading  strand:  sintetitzada  de  mode  continu   -­‐ Retardada   o   lagging  strand:   es   sintetitza   de   mode   discontinu   donant   lloc   als  fragments  d’Okazaki  (100-­‐200bp)  que  posteriorment  s’uniran.               El  fragment   d’Okazaki   s’origina  per  l’acció  d’una  primasa  i  posteriorment   de   la   DNA   polimerasa   III.   La   DNA   polimerasa   I   substituirà   el   RNA   per   DNA   i   la  ligasa  és  l’encarregada  d’unir  els  fragments.                               La   forca   de   replicació   avança   però   gràcies   a   un   altre   enzim:   les   helicases.   Permeten   avançar   la   forca   de   replicació   separant  la  doble  hèlix,  la  qual  és  una  activitat  amb  despesa   energètica  –ATP  i  que  es  realitza  sobre  la  cadena  5’-­‐>3’.     Són  proteïnes  hexamèriques  amb  forma  d’anell.   Hi   ha   unes   proteïnes   que   s’uneixen   al   DNA   monocatenari   que   encara   no   ha   estat   replicat   evitant-­‐ne   el   plegament,   anomenades   RPA   o   proteïnes   d’unió   a   DNA   monocatenari.       La   síntesi   de   la   cadena   retardada   del   DNA   no   seria   processava   ni   eficient   si   la   molècula  de  DNA  polimerasa  s’hagués  de  dissociar  lliure  en   acabar   cada   fragment   d’Okazaki.   Hi   ha   un   factor   de   processament   conegut   com   PCNA   que   atorga   processivitat   al   procés   i   una   major   estabilitat   a   la   DNA   polimerasa.   És   una   anella   lliscant   que   interactua   amb   la   cadena   de   DNA   i   la   DNA   polimerasa   evitant  que  aquesta  es  despegui.       Totes  les  proteïnes  que  actuen  en  la  forca  de   replicació   acaben   formant   un   replisoma.   Es   crea   un   llaç   en   la   cadena   retardada   per   a   sintetitzar   les   dues   cadenes   en   la   mateixa   direcció   de   l’espai.   Ho   fa   gràcies   a   un   gir   de   180º   per   a   que   les   dues   polimerases   actuïn   en   el   mateix   sentit.   Això   provoca   un   superenrotllament,   per   lo   tant,   requerim   de   topoisomerases  per  a  compensar-­‐ho.       Inhibidors   de   la   replicació   com   metrotraxat,   hdiroxiurea,   camptotecina   i   etoposides  són  usats  en  quimioteràpia.       El   complex   ORC   és   qui   reconeix   l’inici   de   la   replicació   en   fase   G1del   cicle   cel·lular.   En   la   mateixa   fase   s’associa   a   Cdc6   i   el   complex   mcm   (helicases)   que   s’activen   en   la   fase   S   iniciant   la   replicació.       La   síntesi   de   la   cadena   retardada   no   pot   completar-­‐se   en   els   extrems   dels   cromosomes,   en   els   telòmers.   Per   al   manteniment   d’aquests   tenim   un   enzim   encarregat   d’addicionar   mòduls   de   seqüències   telomèriques:   la   telomerasa.   Això   garanteix  el  manteniment  dels  telòmers  i,  per  tant,  la  integritat  dels  cromosomes.     La  científica  Elizabeth  Blackburn  va  guanyar  el  permi  Nobel  en  Medicina  o  Fisiologia   l’any  2009  pel  seu  estudi  sobre  els  telòmers.  Afirma  que  a  mesura  que  una  cèl·lula  es   divideix  el  telòmer  es  va  escurçant  i  que  aquest  escurçament  és  un  marcador  de  l’edat   de  la  cèl·lula  i  de  l’organisme.  Qui  sap  si  corregint  aquest  escurçament  aconseguiríem   la  joventut  eterna.       La  recombinació  genètica  és  el  procés  pel  qual  una  cadena  de  material  genètic  es   fragmentada   i   posteriorment   unida   a   una   molècula   de   DNA   diferent.   Hi   ha   diferents  tipus  de  recombinació:     -­‐ Homòloga:  es  dóna  entre  seqüències  homòlogues   en   espermatogènesi   i   oogènesi   en   qualsevol   punt   del   genoma.   Implica   l’aparellament   físic   entre   les   dues  cadenes  complementàries  dels  dos  DNA  dels   progenitors.   Aquest   intermediari   en   la   recombinació   són   els   quiasmes,   que   presenten   forma  de  X.  S’inicia  per  un  tall  en  les  dues  cadenes   de  la  doble  hèlix  generant  un  extrem  3’  lliure  que   envaeix   l’altra   doble   cadena   en   busca   de   regions   homòlogues.   Una   vegada   associats,   la   primesa   sintetitza  el  primer  i  el  nou  DNA  es  polimeritza.     -­‐ Especialitzada:   són   recombinacions   homòlogues   específiques,  que  només  tenen  lloc  en  fragments  curts  i  en   una   localització   específica.   Hi   intervenen   les   integrases.   Són   proteïnes   tetramèriques   que   situen   dos   subunitats   en   cada   cadena.   Aquestes   subunitats   trenquen   una   cadena   de   la   doble   hèlix.   A   través   dels   extrems   –OH   de   les   cadenes   separades   aquestes   s’uneixen.   A   més   a   més,   aquest   tipus   de   recombinació  permet  la  integració  d’un  DNA  circular  en  un   DNA  lineal.       -­‐ Transposició:   permet   la   inserció   d’una   seqüència   de   DNA   en   una   altra   sense   que   hi   hagi   cap   tipus   d’homologia.   El   transposó   és   el   nom   que   rep   aquesta   nova   seqüència   de   DNA   que   s’afegeix,   són   un   possible   origen   de   DNA   moderadament   repetitiu   i   transportats   per   les   transposases.   La   seqüència  diana  del  lloc  d’unió  es  duplica  durant  la  inserció  del  transposó.   Constitueixen  un  30-­‐40%  del  nostre  genoma.     Els   retrovirus   utilitzen   mecanismes   d’inserció   similars.   El   RNA   que   alliberen   sobre   la   cèl·lula   hoste   es   transforma   a   DNA   per   transcripció   inversa.  Aquest  nou  DNA  és  un  transposó  que  s’insereix  al  material  genètic   de  la  cèl  hoste  modificant-­‐ne  el  seu  genoma.  Els  LTR  són  les  seqüències  dels   extrems  invertides.       Els   canvis   que   es   produeixen   en   la   seqüència   del   DNA   són   les   mutacions.   Poden   tenir  causa  espontània  o  induïda  per  agents  mutàgens:   -­‐ Espontània:     o DNA  polimerasa:  en  eucariotes  provoca  una  mutació  de  cada  105-­‐106   generacions.  En  canvi,  en  procariotes  cada  300  generacions.     o Tautometerisme:   per   isòmers   de   les   bases   nitrogenades.   Per   exemple,  l’isòmer  de  T  pot  relacionar-­‐se  amb  G  la  qual  s’associa  a  C   fixant  la  mutació.     o Desaminació  espontània:  C  origina  U  per  la  pèrdua  espontània  o  per   acció  de  l’àcid  nitrós  del  grup  amino.     -­‐ Induïda:     o Agent  físic,  UV:  pot  provocar  la  dimerització  de  timines  que  queden   unides   per   enllaços   covalents.   Per   a   separar   aquestes   unions   són   necessaris  enzims.     o Agents  químics:  hidroxilamina,  nitrosoguanidina...     També  podem  classificar  les  mutacions  segons  l’alteració  de  la  seqüència  de  DNA   en:   -­‐ Puntuals:  inclou  transicions  i  transversions   -­‐ Insercions,  delecions  i  translocacions,  que  ja  estudiarem.       Tenim   diferents   vies   de   reparació   del   dany   sobre   el   DNA,   aquestes   alteracions   poden  ser   corregides   per   aquests   mecanismes   de   reparació   abans   i   tot   d’esdevenir   mutacions.     Som   capaços   de   duu   a   terme   la   eliminació   dels   uracils   produïts   per   les   citosines,   gràcies  a  que  els  uracils  són  propi  del  RNA  i  no  del  DNA.     Un  exemple  de  mecanisme  de  reparació  és  BER   o   base-­‐excision   repair   usat   davant   dany   oxidatiu  sobre  el  DNA  o  alquilació  del  DNA.  La   DNA   glicosilasa   és   l’encarregada   d’eliminar   la   base   mutada   que   serà   substituida   per   la     correcta   i   el   tall   originat   sobre   la   cadena   serà   reparat  per  la  DNA  ligasa.       Un  altre  mecanismes  NER  o  nucleotid  excision-­‐ repair,   que   arregla   emparellament   incorrectes   de   nucleòtids.   Defectes   en   els   nounats   en   aquest   sistema   estan   relacionats   amb   patologies   caracteritzades   per   la   sensibilitat   a   la   llum   solar   com   la   xeroderma   pigmentosum;   és   un   defecte   hereditari   en   les   proteïnes  que  reconeixen  les  lesions  causades  per  la  llum  UV,  és  causa  de  càncer  de   pell.       També   hi   ha   un   sistema   de   correcció   sobre   els   emparellaments   incorrectes   entre   les   bases.   Mutacions   en   aquest   sistema   MMR   (Mismatch   Repair)   comporta   inestabilitat   en   el   DNA   microsatèl·lit.   Els   gens   MMR   es   troben   mutats   en   alguns   càncers   com   endometrial,   gàstric,   colorectal   (aquest   heretat   com   un   caràcter   autosòmic  dominant  com  tans  d’altres  càncers,  gen  HNPCC)  i  altres.       La   recombinació   homòloga,   un   altre   mecanisme   de   reparació   del   dany   sobre   el   DNA,   pot   ser   un   factor   mutagènic   sempre   quan   no   existeixen   seqüències   homòlogues   properes   puix   que   uneix   directament   els   dos   extrems   separats.   Alteracions  en  aquest  sistema  estan  relacionades  amb  la  mutació  de  diversos  gens:     -­‐ Gen   ATM:   relacionat   amb   atalaxia   telangiecasia   AT   caracteritzada   per   problemes   neurològics   principalment   problemes   d’esquilibri   i   els   vasos   oculars  dilatats.   El   Nijmegen   breakage   Syndrome   NBS   és   una   malaltia   estranya   autosòmica   recessiva   molt   similar   a   AT.   Els   pacients   presenten   inestabilitat   cromosòmica   i   defectes   en   el   desenvolupament   (com   retard   mental).   Són   propensos  a  tenir  càncer  de  cèl  B  (limfoma).     -­‐     Gen  BRCA1  ,2:  relacionat  amb  el  càncer  de  mama  i  d’ovari.     ...