Tema 3: Estudi de mutants (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Citologia i histologia
Año del apunte 2014
Páginas 4
Fecha de subida 03/02/2015
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

Citologia i Histologia Vegetal TEMA 3: ESTUDI DE MUTANTS Mutants deficients en la funció  comparar  salvatge (Wilde type) Veure un gen alterat  analitzar els efectes en el fenotip de l’organisme   Funció que es vol estudiar Significat per la planta  conseqüències perdre o guany de la funció PASSOS A SEGUIR: 1. A nivell de la planta: identificar plantes mutants amb la funció perduda o alterada (analitzar efectes en el fenotip) 2. A nivell de DNA i mRNA: identificar i clonar (difícil) el gen mutat i determinar on i quan s’expressa (comparar amb una normal) 3. A nivell de proteïna: obtenir la proteïna codificada pel gen i comprovar in vitro la funció bioquímica 4. A nivell de RNA i proteïna: trobar les dianes del gen: altres gens que interaccionen i altres metabòlits que interaccionen per saber com es regula 5. A nivell de biologia i sistemes (en sílice): com s’integra en el conjunt de la planta Mutagènesi (obtenció de mutants) Mutació a l’atzar Mutació especifica Mutacions espontànies (no es sap quin Varies mutacions  potser hi haurà una que mutarà) afecti la funció que estudio Agents mutàgens: químics, inserció DNA...
Silenciament  impedeix que s’expressi (falta la funció) Transferir l’ADN d’Agrobacteri cal codificar Sobreexplotació  activitat més alta de la plasmidi (evitar tumorogènesi) i col·locar gen funció marcador A l’atzar  silenciament Detecció de la mutació (comprovar efecte en la funció  creuaments per obtenir la funció) Identificar i clonar gen responsable (difícil) Analitzar paper del gen en la funció Si muta la flor (mutacions generalment recessives i letals)  gàmetes portadors de la mutació normalment heterozigots (en un sol cromosoma) Flors que no hagi anat la mutació seran normals m/+ m/+ Sense generació (procés complicat) m/m  mutant + freqüent mutació afecti o anteres o ovaris 1 Citologia i Histologia Vegetal Si l’ambient canvia  la mutació pot ser útil Si l’ambient no canvia  potser no es útil  afecta la funció MUTANTS D’INSERCIÓ (Arabidobsis): Amb la infecció de plasmodi d’Agrobacteri s’insereix a l’atzar el DNA a la cèl·lula infectada + gen marcador Arabidobsis: 5 cromosomes i diploide (simplicitat genoma) facilitat de maneig al laboratori 1. Transformació de les flors d’Arabidobsis per un plasmidi conté gen marcador  gen resistència a la kanamicina 2. Autofecundació de les plantes i obtenció de la llavor Multiplicació clonal  comprovar que realment tenen el fragment de DNA inserit 3. Recollida de llavors i selecció de les plàntules transformades amb kanamicina  sobreviuen amb presència de l’antibiòtic Seguiment del fenotip en els diferents estadis de la flor Classificació en categories segons el que afecten Phenome  base de dades ESTUDI FENOTIP 128: 128/128 homozigots 128/+ heterozigots Deficiència en el meristema apical del brot i en l’organogènesi de la flor  afecta gen per l’organització del meristema Homozigots  moren abans de florir Heterozigots  afecten en la flor semblants a la mutació d’Apètala 2 (gen ja conegut  important morfogènesi floreal) Gen 128  important per la flor Clonar i seqüenciar  obtenir proteïna  la mateixa regió del cromosoma i molt semblant a Apètala  128 al·lel d’apètala 2.
ON I QUAN S’EXPRESSA UN GEN: Ús d’un gen reporter (gen marcador) Cada cèl·lula té tots els gens, però només expressa:   Manteniment de les activitats vitals (respiració) “House-keeping genes”  comuns a totes les cèl·lules Gens específics  propis de la funció de les cèl·lules conjunt de gens específics que s’expressen en una cèl·lula en un moment determinat  transcriptoma Gen marcador (reporter)  per detectar el patró d’expressió d’un gen El seu producte es pot reconèixer fàcilment Regió promotora  responsable de que el gen s’expressi en un determinat teixit o no S’uneix Regió codificant (d’un gen reporter)  responsable de la proteïna que codifica un gen 2 Citologia i Histologia Vegetal   Transformació de la planta amb la construcció En les cèl·lules on el promotor és actiu  gen marcador s’expressa i permet detectar l’activitat.
GFP  fluorescència de la proteïna Gens marcadors GUS  detecta reacció enzimàtica Incubació amb substrat GUS  teixits on s’expressa el gen apareixen de color blau característic MUTANTS: La major part de mutants no passen de l’estat embrionari o plàntula (majoria de mutacions letals) Afecten posició apical i basal de l’embrió (desenvolupament de l’eix i alteracions que afecten l’embrió) MUTANT TOPLESS  dos pols radiculars de l’embrió Localitzar el gen en embrions normals (gens que determinen la formació de l’arrel)  expressions diferenciades que dongui un pol radicular i un apical.
Topless mutat  s’expressen tan en l’arrel com en el brot (2 pols radiculars) Expressió del gen Topless en el pol caulinar impedeix que es transcriguin els gens de l’arrel  si falta la proteïna no hi haurà acció repressora (sortiran dos pols radiculars) Pol radicular MUTANT FASS  es manté patró Cotiledons Pol radicular Però la forma no es manté.
Es manté:    Formació del sistema conductor Patró apical-basal Patró radial (teixit cilíndric) Fass  creixement cel·lular no es manté  desorganitzades (comença molt aviat del procés de desenvolupament) A nivell cel·lular: divisió del zigot  pla divisió diferent Orgànuls afectats i mecanismes  els que afecten el pla de divisió: Normal  molts microtúbuls Mutants  pocs microtúbuls i desorganitzades Clonació del gen  codifica fosfatasa 2A proteïnes reguladores desfosforilasa  regula la situació del citoesquelet Formació dels microtúbuls (defineixen on es formen els plans de divisió) Morfogènia i patró són independents  pla de divisió important Citoesquelet alterat  creixement alterat Funció afecta l’organització de la planta 3 Citologia i Histologia Vegetal 4 ...