pH, reacciones multisustrato y ligandos (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad de Oviedo
Grado Biología - 3º curso
Asignatura enzimología
Año del apunte 2017
Páginas 8
Fecha de subida 30/08/2017
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Efecto del pH Los enzimas pueden ser activos: Solo a pH bajo · solo a pH alto · en un determinado rango de pH El pH afecta al enzima porque: - Lo puede desnaturalizar, afecta a los puentes de H y a las cargas, produciendo una pérdida de la estructura tridimensional Puede eliminar las cargas de un aa necesarias para que se produzca la catálisis Puede modificar el sustrato, de manera que este ya no sea afín al enzima pKa de la proteína -pH por debajo del valor  protonado -pH por encima del valor  desprotonado Las partes de las proteínas que se pueden ver afectadas por el pH son especialmente los aminoácidos ácidos y básicos, también los polares, los extremos amino y carboxilo… El pH es por tanto un valor muy importante que tiene que estar muy controlado en los ensayos. Este control se realiza utilizando tampones, que mantienen las soluciones dentro de un determinado rango de pH. Por ejemplo el tampón tris mantiene un rango de 7-9, HEPES de 7-8. Hay que tener en cuenta que las moléculas del tampón son potencialmente reactivas, por ejemplo si estamos ensayando una fosfatasa no es una buena idea hacerlo en un tampón fosfato.
Un ejemplo de enzima activo a pH acido es la pepsina, un enzima lisosomal y de la digestión. El hecho de que solo funcionen a pHs bajos es una ventaja, ya que son muy peligrosos, y de esta forma se controla que no sean activos fuera de unas condiciones concretas.
Actividad a pH alto Tenemos un enzima con uno o varios residuos que tienen que desprotonarse para estar activa. YH es el último residuo que se desprotona del enzima, de todos los que se tienen que desprotonar.
La Vmax de un enzima a determinado pH es directamente proporcional a la fracción de enzima que se encuentre desprotonado, es decir, activo.
Con esta ecuación de una recta que acabamos de obtener podemos concluir lo siguiente: - - Cuando el pH es mucho menor que el pKa obtenemos una recta ascendente de pendiente 1, la Vmax que observamos se va aproximando a la Vmax optima a medida que aumenta el pH.
Cuando el pH es mayor que que el pKa obtenemos una recta de pendiente 0 igual a la Vmax optima, todo el enzima esta desprotonado y funcional Ambas rectas se cortarán cuando pH = pKa Actividad a pH bajo Suponemos lo contrario que en el caso anterior, el enzima tiene una serie de residuos que necesitan estar protonados para que sea funcional. ZH es el último residuo en protonarse.
En este caso la Vmax que se observe será proporcional a la fracción de enzima protonado a ese pH.
En este caso obtenemos la siguiente ecuación: - - Cuando el pH es menor que el pKa todo el enzima estará protonado y será activo, por lo que la Vmax será igual que la Vmax optima, recta de pendiente 0.
Cuando el pH es mayor que el pKa se obtiene una recta de pendiente -1, cuanto más aumente el pH menor fracción del enzima estará activa y la Vmax observara irá disminuyendo.
Ambas rectas también se cortarán cuando pH = pKa Actividad a un determinado rango de pH Este enzima tendrá determinados residuos que tiene que estar protonados y otros desprotonados. Consideramos la Ka del ultimo residuo que se desprotona, YH, y la Ka del ultimo que se desprotona, ZH.
Es como una combinación de las dos situaciones anteriores, la actividad del enzima será máxima en el rango de pH entre las dos Ka.
En este caso la Vmax nunca llegará a ser la Vmax optima, su valor siempre estará dividido por algo. Sin embargo, cuanto más alejados estén los valores de las Ka más pequeño será el denominador y más se acercará la Vmax a la optima.
Si la diferencia de pKa es de menos de dos unidades nunca estará todo el enzima en forma activa, cuando se hayan desprotonado todos los YH, también habrán empezado a desprotonarse los ZH.
El estado de ionización del enzima no solo afecta a la actividad catalítica (Vmax y Kcat), también puede afectar a la afinidad (Km), por lo que es más informativo estudiar el cociente Kcat / Km.
Reacciones multisustrato En este caso se forman complejos ternarios E-S1-S2. El mecanismo de la reacción puede ser: - Orednado: la unión de sustratos y liberación de productos se produce siempre en el mismo orden. Ej, lactato deshidrogenasa - Al azar: la unión y liberación de sustancias no tiene orden, da igual. Ej, creatina fosforilasa - Ping-pong: no se forma un complejo ternario, se une el S1 que modifica covalentemente al enzima y se libera, luego entra el S2 al que el enzima transfiere el grupo y también se libera. Ej, glutamato aminotransferasa Ecuación de Alberty Para reacciones bisustrato Si consideramos saturante uno de los dos sustratos obtenemos la ecuación de Michaelis-Menten. Se ve que la Km de cada sustrato es la concentración a la que Vmax/2 si la concentración del otro sustrato es saturante.
Si realizamos un aproximación para condiciones en las cuales la concentración de un sustrato es constante pero no sautrante podemos obtener la ecuación de una recta: Cambiando la concentración de sustrato constante podemos obtener gráficas primarias que nos permitan averiguar si el mecanismo es ternario (se cortan) o ping-pong (paralelas).
Cuanto mayor sea la concentración constante menor sera la pendiente y el punto de corte. En el tipo ping-pong la pendiente nunca varia ya que se mantiene la relación Km/Vmax =cte., lo que da rectas paralelas.
En un tipo de gráfica secundaria representamos los valores obtenidos de Vmax aparete frente a las concentraciones del sustrato constante. Nos permite hallar la Vmax, la KmB y su relación En otra grafica secundaria podemos representar los valores de m, la pendiente, frente a las concentraciones de sustrato constantes.
Ecuación de Dalziel O de coeficientes cinéticos. Se sustituye la Vmax por [E]Kcat, y por una serie de modificaciones se obtienen coeficientes cinéticos que son una relación entre la Km de cada sustrato y la Kcat.
Investigación de los mecanismos multisustrato - Gráficas primarias: nos permite distinguir los mecanismos con complejo ternario del ping-pong Intermedios de reacción: se aísla el enzima modificado, cuando tiene un sustrato unido Utilización de inhibidores: que impidan la unión de cierto sustrato Intercambio isotópico en el equilibrio Estudios de cinética rápida Inhibición por productos Las reglas de Cleland dicen: - La Vmax es afectada únicamente por inhibidores que se unan al enzima de forma distinta a como se une el sustrato variable La pendiente de las gráficas de dobles inversos es afectada por los inhibidores que se unen al enzima de la misma forma que el sustrato variable.
Teniendo esto en cuenta, cualquiera de las formas de los sustratos que se unen al enzima, se se encuentran en cantidades excesivas, actuarán como inhibidores de distintos tipos.
Unión de ligandos a proteínas Una proteína puede tener mas de un sitio de unión con un sustrato. Si estos sitios de unión son independientes entre si la constante de afinidad proteína-ligando será siempre la misma. Pero puede suceder que la interacción de un ligando con un sitio de unión modifique la afinidad de la proteína por esta sustancia. Puede haber cooperatividad positiva o negativa.
- Cooperatividad positiva: la unión de una molécula de ligando a una subunidad facilita la unión de ligando a otra subunidad Cooperatividad negativa: la unión de un ligando dificulta la unión de otra molécula a otra subunidad Alosterismo: cambios conformacionales en la estructura de una proteína inducidos por la unión de moléculas que se unen a sitios distintos del centro activo.
Tratamiento de Scatchard La representación gráfica de estas funciones nos permite hallar la concentración inicial de sitios de unión, y con ello el numero de sitios de unión que tiene una proteína.
Cuando [ML]/[L] = 0 es que [L]  infinito, por lo que todos los sitios de la proteína estarán ocupados  [M]0 = n[P] Según si el resultado de la gráfica es una recta o una curva podremos también saber si hay o no cooperatividad.
Datos experimentales Para poder obtener estos datos experimentalmente tenemos que poder cuantificar el ligando libre y el unido a la proteína. Esto se realiza habitualmente por diálisis: ponemos la proteína en una tripa por la cual el ligando puede difundir fácilmente y la introducimos en una solución con una concentración de ligando conocida. En el equilibrio la concentración de ligando libre en el interior y exterior será la misma, pero en el interior de la tripa observaremos una cantidad de ligando mayor, porque parte de él está unido a la proteína. Por tanto: [ML] = [L-interior]-[L-exterior] Tratamiento de Hill Suponemos el caso de una proteína con dos sitios de unión, en la que la cooperatividad de los ligandos es positiva máxima, una vez se une la primera molécula, inmediatamente se une la segunda.
Tratando estas distintas funciones obtenemos la ecuación de una recta, cuya pendiente es h, el coeficiente de Hill. Este coeficiente nos permite si hay cooperatividad y de qué tipo.
Todas estas variables las podemos transformar en cinemática enzimática de la siguiente forma: 𝑌= [𝑀𝑆] 𝐾𝑐𝑎𝑡 [𝑀𝑆] 𝑣0 = = [𝑀]0 𝐾𝑐𝑎𝑡 [𝑀]0 𝑉𝑚𝑎𝑥 → 𝑌= → 1−𝑌 =1− 𝑣0 𝑉𝑚𝑎𝑥 − 𝑣0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑣0 𝑌 𝑣0 𝑉𝑚𝑎𝑥 log ( )= = 𝑉𝑚𝑎𝑥 − 𝑣0 1−𝑌 𝑉𝑚𝑎𝑥 − 𝑣0 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑏 [𝐿]ℎ 1 [𝐿]ℎ [𝐿]ℎ = = ℎ 1 1 + 𝐾𝑏 [𝐿]ℎ + [𝐿]ℎ 𝐾𝑑 + [𝐿] 𝐾𝑏 → 𝑣0 [𝑆]ℎ 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]ℎ = → 𝑣 = 𝑜 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑑 + [𝑆]ℎ 𝐾𝑑 + [𝑆]ℎ Si h=1, es decir, no hay cooperatividad, la cinética es la misma que Michaelis-Menten Esta Kd no es la Km, es una constante de disociación aparente Kd = [S]h0,5 Significado fisiológico La cooperatividad, tnato positiva como necativa, tiene que tener una utilidad en el funcionamiento de la célula: - - Cooperatividad negativa: se obtiene la misma velocidad de reacción para cualquier cantidad de sustrato, se obtienen cambios minúsculos con las variaciones. Esto es adecuado para las proteínas House keeping, que realizan funciones esenciales en la célula y son como un interruptor, o están activas o no.
No cooperatividad: comportamiento de un enzima normal, que ya hemos observado.
Cooperatividad positiva: variaciones muy pequeñas en la concentración de sustrato hace que varia mucho la actividad del enzima. Este es el ejemplo de la hemoglobina, que tiene que modular su comportamiento según las condiciones de O2 en el medio.
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