Tema 10 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 27/05/2016
Descargas 20

Vista previa del texto

Biología Molecular 2º NyN Tema 10: Técnicas de hibridación Introducción Formación de dúplex estable entre ácido nucleico y una sonda específica, que suele ser otra cadena de ácido nucleico (DNA normalmente), complementaria a la diana, marcada para su detección.
Marcaje Existen diferentes tipos de marcaje según la sonda y su aplicación Marcaje radioactivo Presenta desventajas relativas a la bioseguridad. El personal ha de ser especializado, y llevarse a cabo en instalaciones adecuadas para ello.
Los marcadores radioactivos más empleados son:    32 P, 33P.
S.
3 H (tritio).
35 La detección se puede llevar a cabo mediante:   Contador de centelleo. En medio líquido, mide la cantidad de radiación emitida.
Autorradiografía. Una placa de radiografía toma la radiación y queda marcada con ella. Podría complementarse con una electroforesis.
Marcaje no radioactivo Es un método más seguro. Se pueden distinguir los siguientes métodos de detección (ordenados de menor a mayor sensibilidad):     Colorimétrica. Una enzima produce un sustrato coloreado. Puede detectar hasta 0,1 pg.
Fluorescente.
Quimioluminiscente, en la que una reacción química produce luz. Puede detectar hasta 0,03 p.
Electroquimioluminiscente.
Biología Molecular 2º NyN Técnicas de hibridación Las técnicas de hibridación pueden clasificarse según el soporte sobre el que se realizan.
Sobre porta    Hibridación in situ (detección de RNA).
FISH, hibridación sobre cromosomas (detección de DNA).
Microarrays, hibridación sobre spots, DNA, RNA o proteínas.
Sobre membranas y sin separación previa Etapas de la hibridación sobre membranas 1. Separación por electroforesis (sólo si la técnica lo requiere). Se realiza en otra matriz (gel).
2. Transferencia, pasando el producto de la matriz electroforética a la membrana donde ocurre la detección.
3. Bloqueo (prehibridación) con moléculas que no interaccionen con la sonda. Se añade molécula que recubre las zonas sin muestra, da manera que la sonda no se una a la membrana. Es decir, se satura la membrana.
4. Hibridación o interacción entre moléculas, con la sal y temperatura adecuadas.
5. Lavados para retirar el exceso de sonda. En ellos, puede cambiarse la concentración salina y la temperatura.
6. Detección.
Hibridación Es importante calcular la Tm del híbrido para calcular la temperatura de hibridación.
Tm = 81,5 oC + 16,6·logM + 0,41(%G +%C) -500/n M = concentración de cationes monovalentes N = número de pares de bases del híbrido % de GC y la longitud son características de cada híbrido. Sin embargo, la fuerza iónica y la temperatura son variables que se pueden modificar para regular la astringencia (especificidad).
Thibridación = Tm – 25 oC. En general, depende del grado de homología entre la sonda y la diana.
Etapas de la hibridación    Pre-hibridación. Se bloquea la membrana.
Hibridación.
Post-hibridación.
Según el objetivo del proceso, la hibridación puede llevarse a cabo a diferentes niveles de astringencia, que se modifica con calor, fuerza iónica o formamida.
 Astringencia elevada (procesos más restrictivos).
o Temperatura elevada (65 oC – 68oC ) o 42pC en presencia de 50% formamida.
o Lavados con baja fuerza iónica.
Biología Molecular 2º NyN  Baja astringencia.
o Baja temperatura, bajo % de formamida.
o Lavados con alta fuerza iónica.
Dot-Blot Aparecen puntos donde se presentan colonias positivas. Se van colocando ácidos nucleicos como puntos ordenados en una membrana, haciendo tres disoluciones seriadas de la misma muestra.
Sirve para averiguar si un gen está presente o no. Permite trabajar con muchas muestras a la vez, pero es un proceso lento.
Se hace una detección semicuantitativa según la señal.
Colony Dot Se emplea una membrana de nitrocelulosa del tamaño de la placa, a la que algunas células de cada colonia se adhieren.
Se añade NaOH, que provoca la lisis de las células y la desnaturalización del DNA, que se pega a la nitrocelulosa por su carga negativa.
Finalmente, se realiza el bloqueo, se añade la sonda y se lava y detecta.
Útil para determinar qué colonias de una placa tienen determinado gen.
Biología Molecular 2º NyN Sobre membrana con separación por electroforesis Southern Blot (detección DNA) Se realiza una separación previa en la membrana, que permite la detección del DNA.
El DNA genómico entero aparece como una única banda. Éste se digiere con enzima de restricción, obteniendo diferentes fragmentos. A continuación, se realiza una electroforesis. El DNA se desnaturaliza, y luego se transfiere a una membrana por capilaridad (membrana encima del gel, con papeles de filtro y peso hacen que el DNA se una a la membrana). Finalmente, se incuba la membrana con una sonda y se detectan los fragmentos donde la sonda se ha hibridado, de manera que aparecen muchas menos bandas de las que había originalmente.
Un gen puede tener diferentes posiciones en cada cepa, apareciendo así un patrón diferente.
Útil en procesos como RFLP, DNA fingerprinting, reordenamientos genéticos, clasificación de polimorfismos, saber si en la progenia se ha mantenido un transgen… Northern Blot (detección de RNA) vs Southern Blot En el Northern Blot no se realiza una digestión previa (detectar moléculas individuales de RNA), y la desnaturalización se realiza en la electroforesis, que se hace en presencia de formaldehído.
Sirve para detectar expresión (equivale a qPCR), aunque es una técnica que puede ser, como mucho, semicuantitativa.
Biología Molecular 2º NyN Western Blot Detección de proteínas mediante interacción entre un antígeno (proteína) y un anticuerpo específico, en lugar de una sonda de DNA. Sirve para detectar una proteína de un lisado con todas las proteínas de una célula.
Se realiza una electroforesis en SDS (desnaturaliza). Las proteínas tienen carga negativa, de forma que, si se pone una membrana hacia el polo positivo, las proteínas migrarán a la membrana deseada.
En la membrana, se incuba con anticuerpos. En primer lugar, un anticuerpo primario detecta la proteína y se une a ella (sería muy caro marcar todos los anticuerpos primarios). Finalmente, un segundo anticuerpo, marcado y genérico, se une al anticuerpo primario.
Este segundo anticuerpo funciona por reconocimiento del fragmento constante del anticuerpo primario.
South-Western Permite el estudio de interacciones DNA-proteína ...