Tema 5. Transcripció en procariotes I (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Bioquímica II
Año del apunte 2015
Páginas 8
Fecha de subida 04/02/2015
Descargas 16
Subido por

Vista previa del texto

Tema 5. Transcripció en procariotes I 1. MECANISMES BÀSICS DE TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES La transcripció consisteix en la síntesi de RNA a partir de DNA mitjançant una RNA polimerasa DNA independent. Es tracta d’un enzim que actua de manera similar a la DNA polimerasa en el procés de replicació del DNA.
En el procés de transcripció no existeix un sol punt origen cromosoma sinó que cada gen presenta un origen de transcripció propi denominat ORF open reading frame. La regió anterior a aquest punt s’anomena 5’UTR mentre que la posterior s’anomena 3’UTR.
Anterior a ORF hi ha una regió promotora que indica a RNA polimerasa, en determinades situacions, que cal transcriure aquell gen. La transcripció tindrà un punt final que s’anomena tts terminal transcription site.
A diferència del procés de replicació en què es sintetitzaven quatre cadenes de DNA, en el procés de transcripció es sintetitza una sola cadena de mRNA en direcció 5’-3’.
RNA polimerasa d’E. Coli El descobriment de la RNA polimerasa d’E. Coli va realitzar-se gràcies a l’aplicació de rifampicina. Va observar-se que l’aplicació d’aquesta substància provocava la desaparició de tot el RNA de la cèl·lula i que per tant actuava com a inhibidora de l’enzim.
En eucariotes es va aplicar l’antibiòtic α-amanitina i van identificar-se 3 RNA polimerases que sintetitzaven mRNA, rRNA i tRNA respectivament. Aquestes es veien inhibides per α-amanitina a diferents nivells.
El quadre següent mostra les principals diferències entre DNA polimerasa i RNA polimerasa.
Velocitat Nº molècules/cèl·lula Nº centres d’inici Errors Processivitat Correcció d’errors DNA polimerasa Ràpida (1000 Nt/seg) Poques (10 molèc/cèl) Pocs Pocs (10-7) Alta Sí (activitat 3’-5’ exonucleasa) La RNA polimerasa d’E. coli té 5 subunitats principals.
 α Interacciona amb els factors de regulació  β i β’ Subunitats catalítiques  ω  σ70 Participa en el reconeixement del promotor RNA polimerasa Lenta (50 Nt/seg) Moltes (3000 molèc/cèl) Molts Molts (10-5) Alta Casi inexistent ααββ’ Cos, core ααββ’σ70 Holoenzim 45 σ70 rastreja el DNA gràcies a l’absència de càrregues negatives en la regió d’unió a DNA i gràcies a presència d’estructures capaces d’accedir al solc major i llegir les bases nitrogenades. L’enzim es desplaça fins identificar una seqüència TATTAT i, si a una distància de 17 ± 1 troba un hexàmer amb una seqüència TTGACA, es queda fixat en aquella posició. El conjunt dels dos hexàmers i la seqüència espaiadora formen el promotor.
Iniciació de la transcripció El punt d’inici de la transcripció s’anomena transcription start side (tss o tsp) i s’ubica després dels dos hexàmers identificats per σ70. La seqüència TATTAT, que és el primer hexàmer detectat per σ70, es troba 10 nucleòtids abans de tss i per això s’anomena element -10.
L’hexàmer TTGACA s’ubica 35 nucleòtids abans de tss i s’anomena element -35.
La transcripció d’un gen amb uns elements -10 i -35 idèntics a les seqüències descrites separats per un espaiador de 16-18 bases nitrogenades serà constitutiva. Alteracions d’aquestes seqüències provocaran una menor afinitat per σ70 i per tant un menor grau de transcripció.
RNA polimerasa identifica un promotor i forma un complex tancat amb una constant de dissociació de d’entre 10-6 i 10-9. Les cadenes se separen formant un complex obert on la unió de la RNA polimerasa ja és irreversible doncs la constant de dissociació és de 10-14.
Sigma70 pot mantenir-se amb polimerasa o pot ser alliberada per permetre la unió d’una nova RNA polimerasa. La seva activitat en el procés de transcripció després de detectar el promotor ja no és important.
46 Elongació de la cadena En el procés de transcripció RNA polimerasa interacciona amb la cadena motlle i no pas amb l’altra cadena, la cadena codificant. La cadena codificant rep aquest nom donat que el RNA resultant serà idèntic a ella, amb la substitució de timina per uracil. Les cadenes poden anomenar-se també cadena sense sentit, la cadena motlle, i cadena amb sentit, la transcrita.
El promotor, que es troba anterior al punt d’inici de transcripció, no serà transcrit. Posterior a tsp i anterior al punt d’inici de traducció (ATG en DNA i AUG en RNA) es localitza la caixa ShineDalgarno, una seqüència de reconeixement pels ribosomes eucariotes.
Terminació de la transcripció Durant la transcripció es forma un complex triple estable format per les dues cadenes de DNA i la cadena de RNA que s’està sintetitzant. A l’arribar a la regió de terminació aquest complex perd estabilitat i es dissocia.
La terminació de la transcripció pot venir determinada per factors en cis o factors en trans. Els factors en cis són seqüències específiques de DNA mentre que els factors en trans són proteïnes.
En E. Coli hi ha dos tipus de terminació:  Terminació independent de Rho Depèn únicament de seqüències en el DNA  Terminació Rho-dependent Depèn de seqüències en el DNA i de la proteïna Rho 47 La terminació independent de Rho es dóna per la presència de seqüències riques en citosina i guanina que provoquen la formació d’un loop. Aquest loop provoca l’encallament de la RNA polimerasa i la cadena de RNA s’allibera.
La terminació dependent de Rho es basa en la presència d’una seqüència en el RNA que actua com a lloc de reconeixement per la proteïna Rho, una proteïna hexamèrica. Això genera un complex quaternari (2 DNA + RNA + proteïna) i de manera ATP dependent es produeix un estirament del RNA que debilita la interacció entre el motlle i el transcrit provocant la seva dissociació. També es dissocien la proteïna i la RNA polimerasa.
Inhibidors de la transcripció en E. Coli  Cordicepina Actua coma inhibidor perquè pot ser col·locada per la RNAP en substitució a un nucleòtid i no té un OH en la posició 3’, per tant s’impedeix l’elongació. S’utilitza com a antibiòtic, frena el cicle de bacteris.
 Rifampicina S’uneix a la subunitat beta de la RNA polimerasa  α-Amanitina Inhibeix RNA polimerasa, especialment RNAP II.
 Actinomicina D S’uneix al DNA en el complex d’iniciació de la transcripció 2. REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES Operó lactosa (Jacob i Monod) Un operó és una unitat genètica funcional clàssica en bacteris que inclou els gens necessaris per una funció. L’operó lactosa està format per un promotor seguit de tres ORF per la síntesi de β-galactosidasa, permeasa i acetilasa. Es denomina operador al lloc d’unió dels factors de transcripció.
L’enzim β-galactosidasa catalitza la hidròlisi de la lactosa per obtenir galactosa i glucosa i requereix també l’activitat permeasa i l’activitat acetilasa. De manera normal E. Coli no presenta aquests enzims donat que obté l’energia a partir de glucosa, per tant la transcripció només s’ha de produir en presència de lactosa i absència de glucosa.
LacI és una proteïna repressora que es sintetitza de manera constitutiva i reconeix uns parells de bases que es localitzen a la seqüència espaiadora del promotor de l’operó lactosa evitant la unió de la RNA polimerasa.
48 A més del domini d’unió al DNA, LacI presenta un domini d’unió a lactosa. La unió d’aquest metabòlit provoca un canvi conformacional que implica una disminució de l’afinitat de LacI pel DNA (augment KD), permetent-se així la unió de sigma al promotor.
L’absència de lactosa, però, permet únicament la interacció de sigma amb l’element -10, ja que presenta una afinitat baixa per l’element -35. La transcripció requereix també l’absència de glucosa.
CRP o CAP, igual que LacI, es sintetitza de manera constitutiva. La disminució dels nivells de glucosa impliquen un augment dels nivells de cAMP i aquesta molècula provoca un canvi conformacional en CRP exposant el seu domini d’unió al DNA. CRP s’uneix al domini cis (davant de -35) i s’uneix a la subunitat alfa de la RNA polimerasa, afavorint així el seu ancoratge.
Els tres enzims sintetitzats a partir de l’operó lactosa no s’han de produir en la mateixa quantitat. Això no ve regulat per la transcripció sinó per les seqüències Shine-Dalgarno, que uneixen els ribosomes amb més o menys afinitat produint una major o menor traducció.
La taula següent mostra que la concentració de LacI es manté constant, doncs la seva síntesi és continua. La seva afinitat pel DNA, però, disminueix en un ordre de 8 magnituds en presència de lactosa o alolactosa i disminueix també el seu percentatge d’ocupació en cèl·lules.
Els procés pot resumir-se en els esquemes següents: 49 LacI té un sol operador, doncs és exclusiu per l’operó de lactosa. CRP però, s’uneix a diferents promotors a diferents distàncies del punt d’inici de transcripció, permetent la síntesi d’enzims per la degradació de diferents glúcids en absència de glucosa. Actua generant un bending, és a dir, provoca la curvatura del DNA.
Bacteriòfag lambda El bacteriòfag lambda és un virus de DNA amb càpsida i sense embolcall i, com tots els virus, presenta un cicle vital amb un cicle lític i un cicle lisogènic. La fase lisogènica consisteix en la incorporació del seu DNA al DNA cel·lular del bacteri (E. Coli) i la fase lítica consisteix en l’activació de la fase SOS de bacteri.
L’activació de la fase SOS d’un bacteri implica l’activació de diferents promotors i la transcripció de gens importants per la fase lítica del virus. En la fase lisogènica, per contra, la transcripció és bloquejada per acció del repressor lambda (gen cl), tot i que cada regió operadora podrà unir amb més o menys afinitat el repressor.
El repressor lambda és un dímer, que és l’estructura habitual dels factors de transcripció, que solen ser dímers o tetràmers. Actua inhibint els gens N i cro.
50 La regulació dels nivells del repressor lambda o gen cI és essencial donat que nivells baixos provocaran la transcripció dels gens cro i N, que iniciaran la lisi, mentre que nivells excessius podrien impossibilitar l’entrada a la fase lítica ja que seria necessària una disminució massa gran dels nivells de la proteïna. Els nivells de cI, per tant, s’han de mantenir constants a un nivell determinat.
El repressor lambda es transcriu de manera constitutiva i es regula per una autoregulació de la transcripció. Els diferents operadors als que lambda s’uneix presenten diferències en les bases nitrogenades, de manera que l’afinitat varia sent major per OR1 i menor per OR2 i OR3.
Donada l’elevada afinitat de λ per OR1, a nivells baixos de cI la proteïna s’unirà a l’operador, produint el bloqueig de la transcripció. A mida que la concentració de la proteïna augmenta s’uneix al segon operador, OR2, i actua com a factor positiu per la seva pròpia transcripció. Per últim, quan els nivells de cI sobrepassen un llindar determinat la proteïna s’uneix al tercer operador, OR3, i aquesta unió provoca un bloqueig de la transcripció del gen per disminuir els nivells de la proteïna.
Regulació de la transcripció per canvi de subunitats sigma De manera normal la RNA polimerasa d’E Coli està formada per σ70 i el core, format per ααββ’.
No obstant, en determinades situacions d’estrès per la cèl·lula es sintetitzen subunitats de sigma amb modificacions en la seva estructura que provoquen el reconeixement de seqüències diferents. En cas de que els gens hagin estat afectats per xoc tèrmic es sintetitza σ32 i en cas de formació de ponts de nitrogen es forma σ54.
51 Altres models de regulació procariota  Síntesi d’un RNA antisentit S’uneix a l’extrem 5’ d’un gen inhibint la seva transcripció.
 Proteïnes ribosomals Les proteïnes ribosomals s’anomenen de S1 a Sn per la subunitat petita i de L1 a Ln per la subunitat gran. De manera normal les proteïnes ribosomals s’uneixen a rRNA per formar els ribosomes, però si no hi ha rRNA disponible i el nivell de la proteïna augmenta s’uneixen a mRNA i inhibeixen de la seva transcripció per evitar una major acumulació.
 DNA looping Un enhancer és un regulador de la transcripció a una certa distància del promotor. Per unir aquestes regions es distorsiona el DNA i es forma un loop.
 SoxR/SoxS SoxR té un centre de ferro sulfur s’oxida davant un estrés oxidatiu provocant un canvi conformacional. Això provoca la transcripció de SoxS, una proteïna antioxidant.
52 ...