TEMA 1 - Tècniques espectroscòpiques (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Tècniques instrumentals bàsiques
Año del apunte 2015
Páginas 22
Fecha de subida 14/05/2015
Descargas 46
Subido por

Vista previa del texto

TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tema 1 – Tècniquès èspèctroscopiquès PRINCIPIS BÀSICS 14/04/15 L’espectroscòpia és l’estudi de la interacció entre la radiació electromagnètica i la matèria.
La radiació electromagnètica és un camp electromagnètic variable que es propaga en l’espai.
Electromagnètic vol dir que tenim nu camp elèctric en una direcció i un camp magnètic perpendicular a ell.
La llum té una naturalesa dual – pot considerar-se com un corpuscle (hi ha fotons, que són els que porten l’energia associada) i també té una naturalesa ondulatòria (es propaga en forma d’ona).
A nosaltres ens interessen uns paràmetres determinats que influencien els tipus d’espectroscòpia que existeixen i de quina manera afectaran a les nostres mesures.
PARÀMETRES - El paràmetre més important i més usat sobretot en l’espectroscòpia visible i d’UV és la longitud d’ona (ʎ) la longitud d’ona és la distància entre dos punts idèntics de la ona (es mesura en metres). Generalment, usarem nanòmetres.
- Un altre paràmetre és la freqüència, que es mesura en unitats de temps-1. Sobretot s’usa en espectroscòpia d’infrarojos.
𝝂= - 𝒄 ʎ L’energia del fotó 𝑬=𝒉∗𝝂= 𝒉∗𝒄 ʎ On h és la constant de Plank que equival a 6,62*10-34 Joules*segon - La velocitat de propagació de la radiació electromagnètica en el buit: 𝒄 = 𝟑𝟎𝟎. 𝟎𝟎𝟎 𝒌𝒎/𝒔 - La intensitat de les radiacions, equivalent a l’energia per unitat de superfície i temps.
Aquests darrers 3 paràmetres no els usarem tant.
1 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Les molècules tenen diferents nivells energètics. Quan la llum interacciona amb la matèria, hi ha canvis en aquests nivells energètics. Aquests canvis depenen de la longitud dona de la llum incident.
Poden haver canvis en els nivells rotacionals, poden haver canvis en els nivells vibracionals i també de l’estat basal o fonamental a l’estat excitat. Tot en funció de la ʎ amb què s’irradiï una substància.
En aquesta imatge veiem representada la correspondència entre les diferents zones de l’espectre de la radiació EM i quin tipus de transicions tenen lloc.
En les zones dels rajos gamma i rajos X, tenim ruptura d’enllaços (són les radiacions més energètiques). A mesura que disminueix l’energia, arribem a la zona dels UV i de la llum visible on hi ha transicions electròniques (passem d’estats basals a estats excitats). En el cas de l’IR, hi ha transicions en els nivells vibracionals. En les microones tenim canvis en els nivells rotacionals i en les radiofreqüències, transicions de spin.
2 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Per tant veiem com en funció de quina gamma de longitud d’ona tinguem, tindrem un tipus de transicions o un altre.
Quan parlem de l’espectroscòpia d’absorció, les transicions que es donen són de tipus electrònic – hi ha una transició d’un estat basal a un estat excitat. Per tant veurem fonamentalment transicions electròniques.
TIPUS D’INTERACCIÓ AMB LA MATÈRIA - - Absorció – és el pas de l’estat fonamental a l’estat excitat. La radiació té una longitud d’ona que la molècula pot absorbir.
Dispersió – la radiació EM incideix, però en no estar en fase amb cap de les longituds moleculars, es dispersa (estar en fase – perquè s’absorbeixi una radiació, aquesta ha de ser de la mateixa magnitud que les distàncies moleculars). Tindrem fenòmens de refracció i de reflexió.
Emissió – té lloc quan tornem d’un estat excitat al basat de mínima energia – s’emet radiació EM (per exemple en la fluorescència).
TIPUS DE TÈCNIQUES ESPECTROSCÒPIQUES ESPECTROSCÒPIA D’ABSORCIÓ - Espectroscòpia UV i visible Espectroscòpia de llum polaritzada – dicroisme circular (mirar canvis en estructures secundàries de proteïnes).
Espectroscòpia de l’IR – també s’usa per veure canvis en estructures secundàries associats a pèrdues o guanys de protons, pertorbacions...
Espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear – estructura 3D de les proteïnes, processo de plegament...
ESPECTROSCÒPIA D’EMISSIÓ - Fluorescència ESPECTROSCÒPIA DE DISPERSIÓ - Rajos X – estructura 3D proteïnes cristal·litzades Totes aquestes tècniques tenen en comú que registren un espectre ja sigui d’IR o de la zona del visible. Aquest espectre és la variació de la intensitat de la radiació EM absorbida o emesa en funció de la longitud d’ona o de la freqüència.
3 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 ESPECTROSCÒPIA D’ABSORCIÓ (UV/VISIBLE ) ESPECTROFOTÒMERS L’equip usat per mesurar l’absorbància és l’espectrofotòmetre. Aquest té el següent: - - Una font de llum blanca (làmpada). Aquesta llum passa a través d’una ranura d’entrada al monocromador.
El monocromador descompon la llum en les diferents longituds d’ona i de totes elles selecciona específicament aquella que tu has predeterminat en l’espectrofotòmetre (si tu vols mesurar a 500 nanòmetres, deixa passar a través de la ranura de sortida només la longitud d’ona seleccionada de 500 nanòmetres).
Aquesta longitud passa a traves de la mostra (compartiment de mostra) Un cop la travessa va fins un detector que registra quins canvis hi ha hagut entre la radiació emesa i la recollida en el detector.
ASPECTES QUANTITATUS DE L’ESPECTROCÒPIA D’ABSORCIÓ LÀMPADES Tot i que l’espectrofotòmetre serveixi tant per les regions de UV com per les de la llum visible, quan usem una longitud d‘ona o una altra, les làmpades canvien – tenim diferents tipus que proporcionen llum per les diferents zones de l’espectre EM.
- En les regions de UV (185-400 nm), s’usen làmpades de deuteri (very expensive) Per la zona del visible o l’UV proper (290-900nm) tenim làmpades de tungstè.
Quan l’espectrofotòmetre només s’usa en la regió l’espectre visible es denomina colorímetres.
4 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 MONOCROMADORS Com hem dit, en el monocromador és el sistema que descompon la llum policromàtica en tota la gamma de longituds d’ona i selecciona una d’elles mitjançant filtres i sistemes òptics adequats.
En tenim dos tipus: - N’hi ha que consten prismes de quars que realitzen una refracció i descompon la llum en les diferents longituds d’ona.
- N’hi ha que consten d’una ranura de reflexió i dos miralls. La ranura està formada per un gra número d’estries paral·leles. Els miralls són els que descomponen la llum. Està basat en el desfasament en la reflexió d’estries consecutives. La ranura la podem moure, podem graduar-ne l’angle. D’aquesta manera, per la ranura de sortida sortirà la longitud d’ona que vulguem.
CUBETES Tenim diferents tipus de cubetes. El més important del material de la cubeta és que ha de ser transparent a la radiació amb la que tu estàs il·luminant la mostra, ja que sinó t’interfereix.
- Cubetes de plàstic i vidre. Es poden usar per l’espectre de llum visible, perquè són transparents a les longituds d’ona de l’espectre visible.
Cubetes de sílice (quars). S’usen per l’espectre d’UV. Són very expensive. Té diferents passos de llum, en funció de la concentració de la mostra. També s’usen pel dicroisme circular.
5 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Totes les cubetes d’espectrometria tenen una cara transparent i una cara opaca. En el cas de les cubetes per l’IR, funcionen una mica diferent – tenim unes finestres circulars amb un separador. Diposites la mostra, tanques perquè no entri aire i tens un compartiment de mostra que va segellat. A més en aquests casos s’usen cubetes fluorur de calci.
Alguns espectrofotòmetres són de doble fes. Funcionen de la mateixa manera, però la longitud d’ona que hem seleccionat que sortirà per la ranura de sortida passa per un separador que divideix la quantitat de llum en dos feixos idèntics. Cada un d’ells passarà per un compartiment de mostra. Per tant, tenim dos compartiments per posar mostres i els mesurarem alhora amb dos feixos idèntics. Això permet restar el blanc directament (no cal posar una cubeta, fer el zero i posar l’altre com hem fet sempre). El funcionament és el següent: poses dues cubetes amb tampó de la mateixa longitud d’ona per fer el que s’anomena una línia base. Això serà la referència. Quan anem posant cubetes amb les mostres, automàticament a cada mostra li restarà la línia base. Això es fa per mesures molt precises, ja que facilita l’obtenció de l’espectre directament restant el blanc a cada longitud d’ona.
6 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 NANODROP Què fem si volem analitzar volums petits de mostra? A vegades disposem de molt poc volum de mostra, i a més, a nivell de laboratori, no podem disposar d’1 ml de certes substàncies. Llavors, usem el nanodrop. Els nanodrops permeten mesurar microlitres i perdem molt poca quantitat de mostra. A més tenen un rang dinàmic molt gran (pas de llum 1mm a 0,2mm). El nanodrop anirà canviant els diferents passos de llum d’acord amb la concentració que detecta en la mostra, de manera que usarà l’òptim per mesurar-te la concentració de la mostra. Ho podem programar per mesurar DNA, RNA, proteïnes... A més podem treballar amb dissolucions molt concentrades i molt diluïdes, sense necessitat de fer dilucions.
A més no necessitem cubetes, podem dipositar la gota amb la pipeta directament – tenim un pedestal on dipositem la gota de la dissolució i per allà és per on passarà la llum.
L’únic que no pot fer i que sí poden fer els espectrofotòmetres és que no pot mesurar la cinètica de reaccions enzimàtiques.
7 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Com ja hem dit, l’espectroscòpia d’absorció es basa en el fenomen d’excitació dels electrons dels orbitals moleculars de l’estat basal a l’excitat.
Generalment aquesta absorció segueix la llei de Lambert Beer, que explicarem més endavant.
Les molècules que són capaces d’absorbir la llum UV o visible es denominen cromòfors. A més, cada substància cromòfor té un espectre d’absorció característic.
APLICACIONS - - Càlcul de concentracions. Ho podem fer usant diferents mètodes: o Mètode colorimètric com el mètode de de Trinder oxidasa/peroxidasa) (glucosa o Fent servir el coeficient d’extinció molar per a longituds d’ona específiques.
Identificació de molècules pel seu espectre d’absorció característic.
Detecció de canvis en les característiques dels biopolímers per canvis en el seu espectre d’absorció. Podem saber si un DNA, proteïna s’ha desnaturalitzat perquè ha canviat el seu espectre d’absorció.
LLEI DE LAMBERT-BEER Un espectrofotòmetre sap quina intensitat de llum és la incident i ell mesura la que travessa la mostra. Per tant mesura la transmitància (el detector mesura la quantitat de llum que ha passat a través de la mostra). La transmitància s’expressa en percentatge, i no és més que la relació entre la intensitat de la llum transmesa respecte la inicial.
8 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 La relació entre la transmitància i la concentració és una relació exponencial, i és complicat treballar amb relacions exponencials. Per tant, per obtenir una relació lineal entre la quantitat de llum que passa a través de la ranura i la concentració de la substància, apliquem el terme ’absorbància, la llum absorbida, que no és mes que una transformació logarítmica de la transmitància.
𝐴𝑏𝑠 = 𝑙𝑜𝑔 1 = − log(10−𝜀𝑙𝑐 ) = 𝜀𝑙𝑐 𝑇 Tenim que l’absorbància és el logaritme de 10 elevat al coeficient d’extinció molar (𝜀) multiplicat pel pas de llum (longitud de la cubeta en cm) multiplicat per la concentració de la solució (M, mol/L).
El coeficient d’extinció molar (𝜀) és la quantitat de llum absorbida per una solució o substància que té una concentració 1 molar en una cubeta de 1 cm i una longitud d’ona determinada. Es mesura en M-1cm-1. És un paràmetre constant per cada substància, i no és extrapolable.
A tot això, la llei de Beer-Lambert relaciona la intensitat de llum entrant en un medi amb la intensitat sortint després que en aquest medi es produeixi absorció.
Representació gràfica de la llei de Beer LIMITACIONS – Concentració La llei de Lambert Beer ens permet determinar la concentració d’una substància degut a la presència d’una relació lineal entre l’absorbància i la concentració de la substància. Però això no es pot fer sempre – per cada substància, hi ha un rang lineal on es compleix la llei. A partir d’una concentració, la relació ja no es lineal, i s’ha de fer una dilució si es vol seguir aplicant la llei. Això passa perquè en mostres molt concentrades les molècules s’apantallen unes a altres hi ha molta absorbància, s’absorbeix molta llum. La precisió amb la què mesurem la llum transmesa és molt poca, hi ha molt error, i deixa de d’haver una relació lineal. Quan això passa, tenim dilucions, cubetes de menys pas de llum (que disminueixen l’absorbància) o Nanodrops, per tal de poder estar un altre cop en el rang de linealitat.
9 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 LIMITACIONS – Agregats La mostra ha de ser soluble. Si hi ha agregats, aquests dispersen la llum.
LIMITACIONS – Radiació monocromàtica El coeficient d’extinció molar com hem dit està relacionat directament amb una longitud d’ona determinada. La qualitat de la mesura dependrà de la qualitat de l’òptica, de lo bo que sigui l’equip en determinar aquesta longitud d’ona específica.
Les longituds d’ona escollides per calcular els coeficients d’extinció molar són sempre les que es troben en els pics, on l’absorció és màxima. La variació de l’absorbància en aquests rangs és molt petita, i l’error serà petit. En canvi en les parts més baixes de la ona, l’error és més gran.
De manera estàndard sempre es determinen les concentracions molars i els coeficients d’extinció molar a partir de longituds d’ona corresponents als màxims d’absorció de cada substància. Per això abans hem dit que no es pot extrapolar. No és el mateix passar per un detector una proteïna amb AA aromàtics que una que no en tingui. El filtre físic ha de ser diferent per cada una.
Normalment les biomolècules donen bandes que són pics bastant amples i que hi ha un rang en el qual absorbeixen. Encara que la precisió dels equips no sigui la òptima, si uses el màxim sempre obtindràs resultats fiables. Si tinguéssim absorcions discretes (a 589 no absorbeix, a 590 sí, i a 591 ja no) no podríem treballar amb equips poc òptims.
10 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 ANÀLISI ESPECTROSCÒPIC DE BIOPOLÍMERS PROTEÏNES Les proteïnes tenen els següents grups cromòfors: els enllaços peptídics, que absorbeixen al voltant de 210-214 nm; els AA aromàtics, que tenen el centre aproximadament a 280 nm; grups prostètics o cofactors que generalment tenen absorbància en la zona de l’espectre visible, com és el cas dels grups hemo, el NAD, etc. En funció del què vulguem analitzar podem fer servir els tres grups o solament l’enllaç peptídic (moltes proteïnes no tenen AA aromàtics, per tant determinar la concentració usant aquest grup no serà sempre possible).
APLICACIONS – Determinar la concentració total de proteïna Mètode colorimètric (lowry/bradford) – detecta la quantitat de proteïna total (és inespecífic).
Aquests mètodes s’usen per seguir les purificacions – vols saber en quina de les teves fraccions hi ha proteïna. Després ja analitzaràs quin tipus de proteïnes hi ha.
11 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Banda d’enllaç peptídic (210 nm) d’alta sensibilitat – amb coeficients d’extinció molar de les proteïnes a 210-214 nm, pots determinar la concentració usant la llei de Lambert-Beer. És una zona molt sensible – la magnitud del pic és molt intensa (hi ha molta quantitat d’absorció), per tant, encara que hi hagi poca quantitat de proteïna, la detectarà.
Residus aromàtics S’usen els residus aromàtics de les proteïnes. L’absorbància de la fenil-alanina és molt baixa. La de la tirosina és mitja, i la dels triptòfans és molt alta. Si les teves proteïnes tenen triptòfan, les podràs seguir bé a 280nm. Si les teves proteïnes tenen tirosina o fenil-alanina, dependrà de la quantitat de proteïna que tinguis. S’usa per proteïnes que tenen o tirosines o triptòfan.
La presència de fenil-alanina es mesura per enllaç peptídic perquè per aquest mètode porta bastant error, ja que no hi ha quasi senyal.
Per aquest mètode, és menor la sensibilitat (la magnitud és menor si comparem amb el mètode de la banda d’enllaç peptídic) però és major l’especificitat, ja que només absorbeixen les proteïnes que tenen AA aromàtics.
APLICACIONS – Identificar proteïnes Per la presència d’un grup prostètic – per exemple el grup hemo té una banda d’absorció característica sobre els 430-450 nm. Això es pot fer també amb altres grups prostètics que permeten la identificació de proteïnes.
12 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 APLICACIONS – Seguir una reacció enzimàtica Per seguir una reacció enzimàtica per absorbància. Normalment, posem la mostra amb el tampó, l’enzim i el substrat. Tu en una reacció enzimàtica mesurem o bé la disminució de la concentració de substrat o l’augment de la concentració de l’aparició de producte. El que s’usa molt és la parella de cofactors NAD+/NADH presents en moltes reaccions. Hi ha una diferència entre els espectres d’absorció del NAD+ i del NADH (màxim a 340 que no està en el NAD+). Per tant qualsevol reacció que consumeixi o produeixi NADH és susceptible de ser mesurada mitjançant un espectrofotòmetre.
Hem de tenir sempre una substància consumida o produïda la qual absorbeixi a una longitud d’ona diferent a la seva parella. També hem de tenir el coeficient d’extinció molar.
ÀCIDS NUCLEICS APLICACIONS – Determinació de la concentració En el DNA la mesura de la seva concentració es basa en l’absorció de les bases nitrogenades. Les bases nitrogenades tenen un pic d’absorció al voltant dels 270nm. No és exactament 270 per cada base, però quan tenim una molècula de doble cadena de DNA, veiem que la combinació dels espectres d’absorció de les diferents bases dóna un pic centrat als 570nm.
En el gràfic tenim l’absorbància de les bases per separat i del DNA en general.
13 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tenim una equivalència en la qual 1 unitat d’absorbància a 260 nm de DNA de doble cadena correspon a una concentració de 50 micrograms / mL.
𝟏(𝑨𝟐𝟔𝟎 ) = 𝟓𝟎 𝝁𝒈 𝒎𝒍 Però no ho expressem com un coeficient d’expressió molar. És a dir, és que és preferible usar aquesta relació a un ε. El motiu és que si fem un ε específic, està determinat per la longitud del DNA, perquè hem d’usar el pes molecular o calcular-lo. Per fer el càlcul d’un ε ens manca el pes molecular. Com que podem treballar amb DNAs de pesos diferents, el factor d’equivalència ja està expressat en unitats de concentració tenint en compte la quantitat de substància. Quan tenim una molècula de DNA de doble cadena a una concentració de 50 𝝁𝒈 𝒎𝒍 l’absorbància ha de donar 1.
En el cas del RNA, l’absorbància és de 40 𝝁𝒈 𝒎𝒍 i pel DNA de cadena senzilla també és diferent. El tipus d’àcid nucleic determina el factor d’equivalència.
14 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 APLICACIONS – Determinació de la puresa o qualitat de la preparació En el DNA també ens interessa saber si és pur o si està contaminat, cosa que pot determinar què podem fer després amb aquest DNA.
Hi ha controls addicionals a part de mirar l’absorbància a 260 nm. Es poden mirar altres longituds d’ona que permeten realitzar anàlisis qualitatius del DNA. L’espectre típic del DNA és el que té el màxim a 260, però n’hi ha un de comú, que té DNA i proteïna, està contaminat, que també té el màxim a 260. Per saber si és pur 100%, es mira a 260, a 280 i a 230, i es calculen els següents quocients: 260/280 (els AA aromàtics de les proteïnes absorbeixen a 280) que ha de donar aproximadament 1,8, i el quocient 260/230, que ha de donar valors superiors a 2,2.
Si el primer quocient baixa de 1,8 tenim molta proteïna i poc DNA. Si el puja a valors propers a 2 el DNA està contaminat amb RNA, ja que tens més absorbància a 260 de la que hauries producte d’aquest espectre d’absorció. El valor de 1,8 surt de la relació que h ha entre la absorbància a 260 i a 280 en un espectre de DNA pur. Si està incrementat, tens una altra cosa que està absorbint molt més a 260. L’espectre estarà deformat per culpa d’una molècula que acostuma a ser RNA que absorbeix també a 260.
Si el segon quocient baixa de 2,2 vol dir que tenim molta absorbància a 230, cosa que generalment ve donada per proteïnes o fenol.
APLICACIONS – Desnaturalització / efecte hipercròmic Usant l’espectroscòpia d’absorció es va descobrir l’efecte hipercròmic del DNA – quan tenim el DNA en forma de doble cadena, tenim les bases nitrogenades situades a l’interior de la doble hèlix. A 260 nm mirem l’absorbància d’aquestes bases. Quan es desnaturalitza el DNA per calor o per la presència d’àcids o bases, el DNA estarà en forma de DNA de cadena senzilla, cosa que exposa les bases nitrogenades. Una molècula de DNA desnaturalitzada augmenta l’absorbància a 260nm, ja que estan més exposades.
15 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Al gràfic, en blau tindríem la conformació de doble cadena i en vermell tindríem la conformació de DNA en cadena senzilla.
D’aquesta manera es calcula la hipercromicitat que és la relació entre les dues absorbàncies expressada en %: 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏à𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐷𝑁𝐴𝑑𝑒𝑠𝑛𝑎𝑡 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏à𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐷𝑁𝐴𝑛𝑎𝑡𝑖𝑢 ∗ 100 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏à𝑛𝑐𝑖𝑎 𝐷𝑁𝐴𝑛𝑎𝑡𝑖𝑢 Hi ha certs valors d’hipercromicitat caracteritzat per certes espècies. En la majoria d’espècies, un genoma desnaturalitzat dóna un valor d’hipercromicitat que oscil·la entre el 30 i el 40%.
APLICACIONS – Estudi de les corbes de fusió És l’estudi de la desnaturalització tèrmica del DNA. El punt d’inflexió de la corba que obtenim és que anomenem temperatura de melting o de fusió (Tm) que correspon a la temperatura a la qual tens el 50% del DNA desnaturalitzat i el 50% en forma de doble cadena.
Aquest paràmetre s’utilitza per les PCRs (per definir la T a la qual farem la hibridació) i també per identificar productes després de ser amplificats per PCR.
Aquesta Tm depèn del % en GC i de la longitud del DNA. Com més alt sigui el $ de GC més temperatura caldrà, ja que hi ha 3 ponts mentre que entre A i T n’hi ha 2.
16 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS FONAMENTS D’ESPECTROFLUOROMETRIA PARCIAL 2 16/04/15 Mentre que l’espectroscòpia d’absorció es basava en absorbir la llum i excitar els electrons, l’espectroscòpia d’emissió es basa en el fenomen de desexcitació (passem d’un estat excitat a un estat fonamental). En aquest procés es produeix llum i és el que es coneix com a fluorescència.
Tenim dos tipus de desexcitació: - - No radiativa – formes de desexcitació que no emeten radiació. Trobem relaxacions vibracionals, processos de conversió interna (anar del nivell d’energia més baix del nivell vibracional de l’estat excitat a un altre estat excitat), creuament de sistemes (passar del nivell vibracional de més baixa energia de l’estat excitat al nivell fonamental emetent calor), etc.
Radiativa – quan passa de l’estat excitat a l’estat fonamental emetent llum. Trobem processos de fluorescència i fosforescència.
ESPECTROFLUORÍMETRE L’aparell que mesura la fluorescència és l’espectrofluorímetre.
És semblant a l’espectrofotòmetre. En aquest cas, hem d’incidir a una longitud d’una determinada per excitar la molècula (ʎ1) i hem de ser capaços de detectar la llum produïda a una segona longitud d’ona (ʎ2). És a dir, les longituds d’ona d’excitació i emissió fluorescent no coincideixen.
ʎ1> ʎ2 – La longitud d’ona de la llum a la qual tu excites la molècula serà major que la longitud a la qual mesures la fluorescència, ja que ha de ser menys energètica, per tant més llarga.
17 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Destaquem la importància de la tassa de cafè en la imatge.
La llum emesa és recollida per un monocromador i la porta fins el detector. El resultat és un espectre d’absorció. En la imatge tenim un espectre d’absorció i un espectre d’emissió.
Podem fer el que anomenem escombrat d’emissió (barrido) – enlloc d’usar una sola longitud d’ona, usem un rang de longituds d’ona, per exemple entre 300 i 400nm, amb diferències de 0,5. Anem excitant a longituds d’ones concretes (300, 305...), fem un escombrat i obtenim tot l’espectre d’emissió. Llavors construïm un espectre, que pot ser tant d’absorció com d’emissió.
Aquesta és una manera de fer experiments de fluorescència.
Una altra manera de fer experiments de fluorescència és, coneixent ja prèviament l’espectre d’emissió, volem saber la intensitat en el màxim de fluorescència. Per fer-ho, excitem a 360 nm i recollim només la intensitat de la fluorescència puntual a, per exemple, 482 nm.
Com veiem en aquesta altra imatge, el màxim de l’espectre d’absorció està a 495nm, mentre que el màxim de l’espectre d’emissió està a 520nm. Aquesta diferència d’energia entre el pic d’excitació i el d’emissió es coneix com el corriment de Stokes.
18 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 APLICACIONS Mesura de la concentració. És més difícil calcula la concentració mitjançant fluoròfors que fent servir la llei de Lambert-Beer, ja que aquí no tenim un equivalent pel coeficient d’extinció molar, i els valors de fluorescència depenen molt de l’òptica de l’equip, per tant són bastant arbitraris els màxims poden fluctuar d’un dia per l’altre. A més necessitem sempre una recta patró en el moment per mesurar la concentració en el mateix moment de la mesura, és a dir és més complicat.
Tot i això, el motiu pel qual es fa servir la fluorescència és que hi ha molècules que tenim en molt poca quantitat i la fluorescència és molt més sensible que qualsevol altre determinació colorimètrica o espectrofotomètrica.
Es diu que hi ha una relació directa entre la intensitat de fluorescència i la concentració: 𝐼𝐹 = 𝑘 ∗ 𝑐 Per tant les avantatges respecte l’espectroscòpia en aquest aplicació és que es treballen en concentracions més baixes amb major sensibilitat i s’eviten problemes de terbolesa com ara agregats.
Seguiment de l’expressió gènica en transgènics per la GFP en organismes normals per immunocitoquímica. És l’aplicació més important. La proteïna de fluorescència verda, GFP, va revolucionar els mètodes de detecció. Hi ha molts derivats amb diferents colors i longituds d’ona. Es tracta d’una proteïna capaç d’emetre fluorescència i que a més és innòcua i molt petita en la majoria d’espècies (27 Kd). Aquestes permeten seguir l’expressió de proteïnes en animals transgènics, seguir l’expressió per microscòpia de fluorescència...
En la primera imatge tenim una Drosophila melanogaster transgènica que conté un promotor constitutiu fusionat a la proteïna GFP. En la segona imatge i tercera imatge tenim teixits l’aplicació de la microscòpia de fluorescència en teixits. El primer correspon a una arabidopsis (és un gènere plantucial) i el darrer correspon a cèl·lules tenyides amb DAPI de proteïnes de membrana marcades amb fluoròfors.
Però clar, en aquest cas depenem de les característiques intrínseques i especifiques que té aquesta proteïna.
19 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Fenomen de desactivació (quenching) de fluorescència. Hi ha altres aplicacions de la fluorescència on es treballem amb fluoròfors específics – unim fluoròfors i analitzem el seu comportament.
El fenomen del quenching o de desactivació de la fluorescència té lloc quan hi ha una interacció entre el fluoròfor i una altra molècula que és capaç d’absorbir l’energia del fluoròfor, de manera que la fluorescència no es pot manifestar. Aquesta molècula s’anomena desactivadora o quencher. Per tant depenem de la presencia d’una altra molècula a banda del fluoròfor.
Com usem aquest fenomen físic – en aplicacions de desactivació dinàmica (depenem de canvis dinàmics en l’estructura d’una proteïna). Aquesta aplicació es basa en la unió d’un fluoròfor en diferents zones de la proteïna i la posterior inducció del plegament d’aquesta proteïna. Aquesta proteïna plegada la posem en presència de molècules desactivadores o quenchers, que les veiem representades com petites esferes en negre en la imatge. En funció de si l’AA on es troba unit el fluoròfor està en l’interior o en l’exterior de la proteïna plegada, tindrem el fenomen de quenching o no.
Amb això podem seguir l’AA – si l’AA marcat pel fluoròfor està exposat al dissolvent i a la molècula desactivadora, per tant observarem quenching de la fluorescència, o si està en el nucli hidrofòbic protegida dels quenchers, per tant no veurem cap quenching.
20 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Una altra manera d’aprofitar aquest fenomen físic és en aplicacions de desactivació estàtica. Això s’usa molt en les reaccions de QPCR, de PCRs a temps real (quantitativa).
En la QPCR, a diferència de la PCR normal, és la presència d’un fluoròfor que permet seguir la formació de producte en la reacció.
Hi ha dos tipus de QPCR – les que tenen un fluoròfor unit de manera inespecífica al DNA, de manera que brilla tot, i les que usen sondes especifiques. En aquest darrer tipus, s’acoblen els fluoròfors i els quenchers. La sonda està unida al a zona que volem amplificar.
Posem els dos primers de la zona que volem amplificar. Tindrem a més un primer intern que serà complementari a la nostra seqüència diana i que en un extrem tindrà el fluoròfor i en l’altre el quencher.
Quan la polimerasa sintetitzi el DNA, es degradarà aquesta zona i se separaran el fluoròfor i el quencher, per tant hi haurà fluorescència. Si no hi ha amplificació no hi ha fluorescència.
La gràcia d’aquest mètode és que només el producte complementari al primer intern serà fluorescent. L’únic inconvenient és que és un procés molt més llarg.
Transferència d’energia o FRET (fluorescence energy transfer). Es basa en la presència de dos fluoròfors propers. Necessitem dues molècules fluoròfors properes en l’espai, a distàncies menors de 10 nm. Si no estan així de properes no veiem res.
Tenim el primer fluoròfor excitat a la seva longitud d’ona (donador) i emetrà la seva fluorescència. Mentre s’emet fluorescència, pot haver una ressonància (perquè hi ha un fluoròfor a prop)i part d’aquesta energia pot excitar el segon fluoròfor (acceptor) que emetrà a una segona longitud d’ona.
En el gràfic veiem que hi ha un solapament de l’espectre d’emissió del primer fluoròfor i l’espectre d’excitació del segon fluoròfor. Per això, el segon pot ser excitat per l’emissió del primer, i per això han d’estar propers, perquè la quantitat d’energia que rep el segon fluoròfor disminueix amb la sisena potència de la distància (distància6). Si està molt lluny, no arribarà l’energia, amb lo qual no s’excitaria. No hi ha emissió real del fotó del fluoròfor donador, sinó transferència directa de l’energia.
21 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Aquesta tècnica s’utilitza sobretot per veure acoblament entre proteïnes o regions de la mateixa, per verificar interaccions. Unim fluoròfors a una de les dues proteïnes o a un dels dos dominis de la mateixa proteïna. Si interaccionen, hi haurà transferència d’energia i veurem fluorescència.
En aquesta taula tenim diferents fluoròfors amb les distàncies a les que necessiten estar de l’acceptor. El més important és que hi hagi un solapament entre l’espectre d’emissió del primer i el d’excitació del segon.
22 ...