Biocatàlisi Tema 3 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 15

Vista previa del texto

1 INTRODUCCIÓ: QUÈ SÓN ELS ENZIMS? 2 CLASSIFICACIÓ I NOMENCLATURA DELS ENZIMS.
3 CINÈTICA ENZIMÀTICA (I).
3.1 INTRODUCCIÓ. COM TRIEM EL MÈTODE D’ASSAIG DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA? La cinètica ens parla dels mètodes més freqüents o representatius pels quals podem quantificar l’activitat dels enzims. No ens parla de l’estructura. Quan es vol triar un mètode per analitzar l’activitat d’un enzim hem de tenir en compte que ha de ser 1 Simple, perquè així podrem maximitzar el nombre de mostres sobre el qual aplicar-lo, 2 Consistent, no pot donar lloc a dubtes i 3 Específic per la reacció que vull mesurar.
Quines són les circumstàncies que poden afectar la tria del mètode? 1 QUÈ VOLEM? Un anàlisi cinètic precís per tenir totes les variables possibles del sistema o un anàlisi simple que només ens permeti detectar l’activitat de l’enzim? 2 COM ÉS LA MOSTRA QUE TINC? No és el mateix tenir la mostra amb l’enzim purificat que la mostra parcialment purificada. En el segon cas cal que faci tots els controls necessaris per veure si hi ha compostos que actuen d’inhibidors, etc. que alterin la lectura del resultat.
3 TRIAR LA TÈCNICA D’ASSAIG. Aquests mètodes els classifiquem segons la tècninca i el tipus d’assaig. Dins d’aquest trobem dos grans grups: mètodes continus i mètodes discontinus. Els primers em permeten mesurar la reacció durant el temps que vull sense interrupcions: puc veure si la cinètica és lineal, sigmoïdea, etc. Els mètodes discontinus ens permeten mesurar la reacció a temps concrets, aturant la reacció en aquests moments. Els aparells d’anàlisi continu poden utilitzar-se en discontinu, si així es vol. Un exemple n’és l’espectofotòmetre.
3.2 LES TÈCNIQUES D’ASSAIG 1 Mètodes espectofotomètrics: mesuren el canvi d’absorbància del substrat o del producte de la reacció. Llavors amb el coeficient d’extinció molar i la Llei de Lambert-Beer podem quantificar la reacció en micromols. Si no és possible mesurar-ho perquè no tenen absorbància a UV ni visible, cal utilitzar estratègies com mesurar l’absorbància de coenzims d’oxidoreducció (NAD/NADH) sempre i quan intervinguin en la reacció d’interès, o bé acoblar altres reaccions. Per exemple, imaginem que volem determinar l’activitat de l’enzim aldolasa que s’encarrega d’escindir la fructosa 1,6 bifosfat a la glucòlisi. En aquestes condicions puc fer una segona reacció, de manera que el producte faci de substrat d’una reacció on s’utilitzi NADH perquè així en poguem mesurar l’activitat (conversió de DHAP a glicerol 3 fosfat, després de l’isomerització de GA3P) . Cal tenir en compte l’estequiometria de la reacció.
Precaucions que s’han d’aplicar: volem determinar l’activitat de l’aldolasa, la resta de components del sistema que s’afegeixen han d’estar a condicions de saturació, no han de ser limitants de la reacció. Si volem tenir una senyal més intensa, afegir en el medi l’enzim triosa fosfat isomerasa a saturació de manera que la senyal del final és el doble - tant G3P com DHAP acaben passant a glicerol 3-fosfat. Si tenim en compte l’estequiometria a partir d’una activitat a nivell de l’aldolasa se’n produeixen 2 a nivell del NADH.
Tercera opció quan no ens va be fer reaccions acoblades. Els cromòfors sintètics són molècules que l’enzim reconeix com a substrat i que tenen una bona capacitat de catàlisi per part de l’enzim, modifica l’absorbància... però que no són els seu substrat fisiològic. Ex un dels derivats del nitrofenol que són reconeguts per enzims del tipus tripsina, quimotripsina... (serine-proteases). El substrat és reconegut per aquest tipus d’enzim i la base d’aquest mètode és que hi ha un canvi en l’absorbància durant la reacció i la podem quantificar.
Cas del O-nitrofenil-β-D-galactòsid. Molts dels estudis de clonació es fan dins del gen que dóna la β-galactosidasa que genera galactosa i un producte de la o-nitrofilil (ONP) que absorbeix a la regió del visible del blau. Una simple observació visual permet saber si el gen s’ha incorporat o no: si la colònia es torna blava el gen no s’ha incorporat.
La fluorescència és molt més sensible que l’absorbància. Un inconvenient que té és que els aparells són molt més cars. Exemple NADH té un pic d’absorbància a 340nm i el pic de florescència a 465nm. A mesura que el NADH es va transformant a la forma oxidada (NAD+) baixarà la fluorescència.
Una aplicació més concreta de l’ús de la fluorescència és el cas d’alguns assajos de biologia molecular, on no pot haver activitat ribonucleasa i s’utilitza un sistema molt sensible per detectar aquest tipus d’activitat utilitzant un oligonucleòtid de seqüència curta que té dos loops. Per una banda té un extrem que emet fluorescència i per l’altre extrem té un quencher, grup que apantalla. En condicions inicials no hi ha fluorescència perquè el quencher l’està tapant. Apliquem la mostra i la deixem el temps d’incubació. Si hi ha activitat ribonucleasa s’haurà trencat l’oligonucleòtid i s’haurà separat el quencher del fluoròfor i emetrà fluorescència. Sistema molt sensible, detecta fins a 5picograms. Bona forma per quantificar aquests enzims.
Mètode l’anàlisi de la turbidesa. Amb aquesta tècnica es mesura la difracció de la llum quan passa per una solució amb partícules que desvien la llum. S’empra per caracteritzar enzims susceptibles d’afectar el creixement bacterià, com per exemple el lisozim. Aquest és un enzim amb activitat glucosidasa, catalitza la hidròlisi dels glúcids de la paret bacteriana. Quan afegim aquest enzim a un cultiu, la turbidesa disminueix.
2 Mètodes electroquímics Un altre grup de mètodes d’assaig enzimàtic són els mètodes electroquímics: bàsicament consisteixen en un electrode capaç de quantificar l’oxigen o el canvi de pH del medi. En la mesura de l’oxigen, el que es mesura són els canvis en la pressió parcial d’aquest que estan associats a una activitat enzimàtica determinada, com per exemple l’activitat de la catalasa (a partir d’aigua oxigenada dóna oxigen i aigua). De la mateixa manera també podem quantificar reaccions de consum d’oxigen.
Un mètode de més àmplia utilització és el “pH stat” o pH estacionari. Es mesura el canvi en la concetració de protons del medi com a conseqüència de l’activitat enzimàtica. Exemple: reacció de reducció del dihidrofolat per acció del coenzim NADPH+H, que capta un protó del medi. En aquesta reacció, el pH del medi augmentaria (es basificaria, concentracio de protons baixaria), però hi apliquem àcid a mesura que va avançant la reacció per mantenir el pH constant (per això l’anomenem “pH estacionari”). El sistema ha de ser prou sofisticat com perquè la solució d’àcid (o base) que afegim no sigui tan diluït ni tan concentrat com perquè hagi d’alterar el volum de la reacció.
Si comparem la sensibilitat, és 10 vegades més sensible el mètode de pH estacionari que el mètode espectofotomètric.
A partir del volum que hem d’afegir d’àcid o base podem establir la velocitat de la reacció. En l’eix d’ordenades tenim el volum d’àcid o base que hem d’afegir per mantenir el pH i en l’eix d’abscisses el temps. Amb la fórmula descrita, ens serveix per passar de volum d’àcid/base a concentració milimolar consumit per unitat de temps (activitat).
3 Assaigs radiomètrics. Són gairebé sempre utilitzats en discontinu, cal parar la reacció. Es basen en utilitzar en l’assaig un substrat marcat radioactivament (isòtops), i observar com el senyal passa de S a P. Un exemple és la determinació de l’activitat quinasa. En les reaccions de fosforil·lació, el substrat incorpora un fosfat de l’ATP (gamma). Cal separar el substrat del producte, per això hem d’aturar la reacció. Els podem separar per solubilitat, mida o càrrega. Un cop separats, quantifiquem la radioactivitat. Com que és un mètode molt tòxic, s’ha substituït per mètodes fluorimètrics.
4 Separació per cromatografia. S i P es poden utilitzar sistemes cromatogràfics, el més utilitzat és HPLC (High Pressure Liquid Cromatography), perquè és molt més ràpid que una cromatografai convencional. En el nostre exemple, tenim una diferència molt petita entre S i P (Gln Glu). Hem d’aturar la reacció en el punt que ens interessa, injectant-li un producte que faci aquesta funció (àcid, per exemple). Fem aquest procediment per a diferents temps. En cada temps, mesurem la fluorescència o l’absorbància, depèn de la tècnica que triem. Amb això obtenim la quantitat de S i P a cada temps (per Lambert-Beer).
Aquesta tècnica ens permet analitzar processos de catàlisi en què el substrat és un polímer i no obtenim un producte sinó molts.
En l’exemple tenim un polímer sintètic que simula un RNA, que és substrat d’enzims amb activitat ribonucleasa.
En mesurar l’absorbància a temps 0, identifiquem el pic del substrat.
A mesura que avança la reacció el polímer de RNA es va trencant en fragments curts, de manera que obtenim més d’un producte de reacció, i la mida d’aquests va variant a mesura que la reacció avança. Com més petit es fa el polímer s’elueix abans. A t=8 i t=20, el pic del substrat ha desaparegut i ha sigut substituit per varis pics. Ens dóna informació quantitativa sobre el procés de catàlisi.
5 Tècniques electroforètiques. El què ens interessa és poder detectar en una barreja de proteïnes la presència d’un tipus de proteïna de MW definida que tenen l’activitat enzimàtica que vull. Fem gels d’electroforesi amb poliacrilamida com qualsevol, la diferència és que quan es polimeritza el gel en el medi de reacció hi hem posat substrat. Aquest substrat ha de ser prou gran molecularment com perquè quedi atrapat a la xarxa i quan apliquem el camp elèctric no es mogui. També és important que no posem SDS al gel, per mantenir els enzims natius i que conservin la seva funció. Posem la mostra proteica en els carrils i la fem córrer per el camp elèctric. Al final de l’electroforesi agafem el gel, el rentem amb tampó i l’incubem en condicions òptimes perquè l’enzim que m’interessa faci la seva funció. Llavors l’enzim anirà degradant el substrat atrapat al gel. En una última etapa posarem colorant que tenyeixi el substrat; quedarà el gel tenyit pel substrat excepte les zones on hi ha l’activitat que busco perquè l’enzim ha degradat el polímer. No ens permet quantificar l’activitat de l’enzim perquè no quantifiquem el temps, però sí que podem fer l’anàlisi qualitatiu: saber si una proteïna té acció proteasa, nucleasa, glucosidasa, lipasa, etc. Una altra tècnica electroforètica consisteix en fer el mateix procediment que el que acabem de veure però després de rentar el gel apliquem barreja de reacció que conté substrat. Sol ser una reacció acoblada, el producte de la reacció ha de ser insoluble i ha de produir una precipitació al lloc on es produeix la catàlisi. En aquelles zones on hi ha l’enzim que busco el producte quedarà dipositat i amb el color del producte.
3.3 MESURA DE LA VELOCITAT DE REACCIÓ.
Quan mesurem l’activitat dels enzims el què estem fent és mesurar la quantitat de substrat que esdevé producte en un temps determinat. Per fer-ho, cal que considerem quines són les condicions de la reacció: pH, tampó, força iònica, temperatura, concentració de substrat i productes... en la mesura del possible sempre és convenient treballar en condicions òptimes, que és quan es té la màxima activitat de l’enzim.
Com expressem matemàticament l’evolució de la reacció en el temps en relació a S i P? La velocitat, com ja hem dit, és el canvi en la concentració de substrat en relació al temps. La velocitat es pot expressar com a k (constant de velocitat de reacció) multiplicada per la concentració de substrat (1). Integrant aquesta expressió (2) podem arribar a l’expressió que ens permet saber, a partir de la concentració de substrat inicial (So), la constant de velocitat (k) i el temps (t) que ha transcorregut quina quantitat de substrat em queda (St) –expressió 3. Això al llarg del temps i representat gràficament ens dóna una exponencial negativa, corresponent a la disminució de substrat. Si fem una transformació de l’expressió 3 podem obtenir la gràfica en funció de producte format (4), i la forma serà d’exponencial positiva.
Un altre paràmetre d’interés és el temps mitjà de vida de la reacció: partint d’una concentració de substrat determinada, el temps que es tarda a consumir-se la meitat. Això es pot quantificar en reaccions enzimàtiques i també en reaccions no enzimàtiques (descomposició radioactiva, per exemple).
A temps relativament curts o en aquelles condicions que s’ha consumit molt poc S, tinc una relació lineal entre P format i temps que ha passat. A mesura que augmento el temps de la reacció es perd la linealitat perquè ja no estic en condicions de substrat inicial. Això és degut a que S ha disminuït molt i que la reacció es reverteix cap al sentit contrari.
En cinètica, sempre parlarem que estem mesurant la reacció en condicions de la velocitat inicial. Són aquelles condicions en les quals la quantitat de substrat que ha passat a producte és pràcticament despreciable. Com que no hi ha producte la reacció en sentit contrari no es produeix i la linealitat es manté. Es considera que estem a velocitat inicial quan la quantitat de substrat que ha passat a producte no supera el 5%.
En una reacció enzimàtica sempre es treballa a concentracions de substrat molt més grans que la concentració d’enzim. Quan la concentració d’enzim està saturada pel substrat s’arriba a la velocitat màxima. Per tant la velocitat inicial a una concentració de substrat determinada depèn del producte de la constant de velocitat (k) per la concentració del complexe (ES).
Cal no confondre els eixos de les gràfiques. Aparentment, les gràfiques tenen la mateixa forma. La gràfica superior ens mostra el progrés de la reacció (és a dir, en funció del temps). Aquesta, en canvi, està feta a partir de les velocitats inicials de molts experiments a diferents concentracions de substrat (gràfica que mostra una cinètica de tipus Micaelis-Menten).
3.4 EFECTE DE LA CONCENTRACIÓ DE L’ENZIM En una reacció enzimàtica que compleix els criteris que hem vist abans, veiem que la velocitat de la reacció depèn també de la concentració d’enzim. Si treballo a concentració d’enzim baixa tindré una velocitat relativament baixa. Si en aquestes condicions tinc una concentració de substrat molt més alta que la de complex E-S, ens trobem amb una reacció de pseudo-primer ordre.
L’ordre de la reacció ens indica com depèn la velocitat respecte la concentració de substrat i de producte. Pot ser que sigui una dependència lineal, exponencial...
Si treballem en condicions de velocitat inicial, quan la quantitat de substrat és baixa tenim una resposta lineal com ja hem vist abans. A vegades, però, tot i complint aquest requisit observem que a temps molt curts de reacció tenim una quantitat de P format que no es correspon a la teòrica, és a dir, que la linealitat és diferent. Podem tenir, per exemple, una cinètica de fase lag: a temps curts són més lentes (la línia té menys pendent) que a temps llargs. Les cinètiques amb efecte burst són al revés: hi ha dues pendents (cal no confondre amb exponencials!). Hi ha una primera etapa de la reacció que es produeix a molta més velocitat que la segona.
Les raons per les quals podem tenir comportaments d’aquest tipus poden ser degudes a problemes experimentals, de mecanisme, o simplement formen part del propi mecanisme de la reacció.
3.5 PROCÉS GENERAL DE PURIFICACIÓ D’UN ENZIM 1 Per què vull l’enzim? Per fer un anàlisi 3D per cristal·lografia, fer un fàrmac o fer un estudi cinètic necessito un alt grau de purificació. Si el vull per un procés industrial, que només ens interessa que l’enzim funcioni i que els altres components de la mostra no l’inhibeixin, no en necessitaré tanta.
2 D’on obtindré l’enzim? Si vull tenir només activitat enzimàtica per a destinar a producció, he de triar la font que em dóni més rendiment, la que sigui més econòmica. Les fons naturals d’enzims són els organismes vius: microorganismes, plantes, animals... l’extracte cru és aquell que obtenim de la disgregació mecànica del teixit o organisme del qual volem obtenir l’enzim.
Normalment obtenir enzims de la font natural suposa limitacions perquè no sempre se’n pot obtenir en la quantitat que se’n necessita per a l’experimentació, o bé és molt difícil d’obtenir. La manera d’obtenir més fàcil i en més quantitat és a partir de l’ús de bacteris recombinants. Permeten una producció en gran quantitat i més fàcilment purificable, però el problema és que no són capaços de fer modificacions post traduccionals com són les glucosilacions, imprescindibles per al correcte funcionament dels enzims. En alguns casos amb les proteïnes expressades dins dels bacteris puc generar cossos d’inclusió, que hauré d’extreure, desnaturalitzar i replegar, procés que no sempre és exitós.
Els llevats també són una opció viable, ja que també produeixen molt però a més fan MPTS. Tanmateix, aquestes no són iguals que les de l’organisme hoste: fan hiperglicosilacions.
Les cèl·lules eucariotes són la opció amb més bon rendiment, però tot i així les modificacions finals no seran iguals que les que pot fer l’organisme d’origen.
3 Homogenització: es poden utilitzar mètodes mecànics i no mecànics. Serveixen per trencar el teixit o font natural a per obtenir la mostra, l’extracte cru.
4 Triar quin mètode de purificació utilitzaré en funció de les propietats de la mostra. Gairebé sempre necessitarem fer més d’un procediment: cal posar els processos més simples al principi i els més sofisticats i selectius al final. És lògic fer-ho així, doncs també suposa un avantatge econòmic: com més avall del procés anem menys volum de mostra tindrem i més barat ens sortirà fer la purificació. Els processos que són menys selectius, més barats i que per tant haurem de fer abans són: Separació per solubilitat depenent del pH. Per a qualsevol proteïna és vàlid que en el pI la càrrega neta de la proteïna és 0 i per tant la hidrofobicitat és màxima. Per tant, si trobem aquest punt de pH i sotmetem la proteïna a aquestes condicions la farem precipitar i la podrem separar del conjunt de proteïnes que no ens interessen (o també podem fer-ho al revés). Tanmateix, aquest mètode és una mica perillós d’utilitzar perquè amb la precipitació podem induïr accidentalment la desnaturalització de la proteïna, que no és gens desitjable.
Separació per solubilitat depenent de força iònica. La solubilitat de la proteïna varia en relació a la força iònica del medi. En la gràfica veiem la solubilitat de dues proteïnes en funció de la força iònica del medi ( en % de saturació salina, sulfat d’amoni). Veiem que la solubilitat canvia entre elles a mesura que augmenta la concentració salina. Quan veiem que les corbes estan suficientment separades, apliquem la concentració salina que ens indica i aleshores centrifuguem.
Una proteïna precipitarà i l’altra no, interaccionarà iònicament amb la sal i ens quedarà en el sobrenedant.
Així els podrem separar fàcilment.
Mètodes més sofisticats que puc fer en etapes més avançades són cromatografies d’afinitat, hidrofòbica, d’interacció iònica, etc.
A mesura que vaig fent el procés de purificació hem de controlar un seguit de paràmetres. En cada etapa de d’anar determinant el contingut proteic total, i la seva composició –es pot fer per mètodes electroforètics.
Sempre disminuïrà.
També cal mirar l’activitat específica de cada etapa, i relacionar-les amb l’activitat específica de l’etapa primera i de l’etapa que la precedeix. Sempre ha d’augmentar. Si baixa, que sigui compensada per una pèrdua també de proteïnes contaminants. És el més important a l’hora de valorar si continuo fent l’etapa o bé l’elimino. Si l’activitat específica no augmenta, fora.
El rendiment mesura quanta activitat mantinc a la meva mostra després d’una o unes quantes (n) etapes de purificació. Cal intentar que al llarg del procés baixi el mínim possible.
El recovery és el % de proteïna que recuperem respecte la mostra anterior.
La purificació és el % de proteïna que purifiquem respecte la quantitat que ja teníem.
El cost. Si tinc una etapa cara però la faig al final, quan tinc poca mostra, pot no resultar tan cara. El cost per pes és la relació entre el cost total i el pes de la mostra que tinc. El cost per activitat és el cost per pes en relació a l’activitat específica. Dels dos, és el més important i el que hem de tenir més en consideració.
...