Tema 10 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T10 Tema 10. Congelació cel·lular RAONS PER MANTENIR ELS ESTOCS CONGELATS Trobem una sèrie de motius pels quals és recomanable mantenir estocs de línies cel·lulars congelats: 1.
En cultius de llarga durada, les cèl·lules poden patir:  Deriva genotípica deguda a la inestabilitat genètica en cultius de llarga durada. Si tenim les cèl·lules cultivant-se és més probable que es produeixin inestabilitat genètica. També s’estalvien els costos dels cultius.
 Envelliment cel·lular en línies no immortalitzades.
 Increment de les possibilitats d’immortalització. Algunes de les línies cel·lulars (3T3) que mostren inhibició per contacte si es cultiven a baixa densitat però si un cultiu d’aquest el deixes molt temps, poden perdre la inhibició per contacte i adquirir característiques de cèl·lules transformades. Així doncs, tenir cèl·lules en un medi sense el control de ningú pot portar a que desenvolupin característiques de cèl·lules transformades.
 Possibilitats de selecció i desdiferenciació.
2.
Increment de les possibilitats de contaminació per microorganismes en el cas que les mantinguem en cultiu.
3.
Increment de les possibilitats de contaminació creuada amb una altra línia cel·lular en el cas que les mantinguem en cultiu.
4.
Fallades de les incubadores.
5.
Estalvi de temps i materials pel manteniment de línies que no s’han d’utilitzar immediatament.
6.
Distribució a altres laboratoris.
ESTOCS CEL·LULARS Estoc de sembra. Primera expansió a partir d’un cultiu primari o bé a partir d’una línia adquirida. L’expansió implica diversos subcultius. Caracteritzada i testada per absència de contaminació serveix de reservori cel·lular.
Estoc de distribució. Un vial de l'estoc de sembra es descongela, es cultiva i s’expandeix per crear un segon estoc, anomenat de distribució. D’aquesta segona expansió és de la qual anem agafant els vials per treballar.
Estoc d’usuari. Els usuaris que necessitin estocs durant un període llarg de temps, cal que estableixin els seus propis estocs, que s’haurien d’eliminar un cop acabada l’experimentació.
L’estoc de sembra només es pot tocar si s’acaben els de distribució, per tal de fer un altre estoc de distribució.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T10 Conservació dels estocs cel·lulars La millor forma de mantenir els estocs cel·lulars és congelant les cèl·lules en nitrogen líquid. Per fer-ho cal: 1.
Congelar a concentracions elevades de cèl·lules.
2.
Una disminució gradual de la temperatura (-1ºC per minut) durant el procés.
3.
Utilitzar crioprotectors (glicerol o DMSO) per evitar la formació de cristalls de gel.
4.
Transferir les cèl·lules al nitrogen líquid a partir de –70ºC, tenint cura que durant el procés la temperatura no pugi de –50ºC.
5.
Mantenir les cèl·lules congelades, bé submergides en el líquid o bé en la fase gasosa de sobre el nitrogen líquid.
PROTOCOL DE CONGELACIÓ 1.
Cultiu a la part final de la fase log. Cal fer un recompte i tripsinitzar.
2.
Medi de congelació: medi de creixement més un 5-10% de DMSO o glicerol. Una alternativa és diluir el medi en un 50% en sèrum i afegir desprès el crioprotector a les proporcions indicades. NOTA: El DMSO penetra la pell i els guants de làtex.
3.
Resuspendre les cèl·lules en medi de congelació (1x106 a 1x107 cèl·lules / ml). Es poden deixar les cèl·lules a temperatura ambient 30 min en el medi de congelació.
4.
Distribuir les cèl·lules en criotubs i procedir a la congelació.
a.
Posar els criotubs en una canya, recobrir-los amb una espuma de parets de 15 mm in un cotó. (Congelació a 1ºC/min).
b.
Posar els criotubs en un container de congelació (Nalgene) i a – 80ºC. Els tubs sucats en alcohol isopropílic, es congelen a una taxa de 1ºC/min fins –70ºC. Després d’una nit a –70ºC es poden posar directament en nitrogen líquid.
c.
Congelador programable que controli la taxa de congelació a 1ºC/min.
Un cop tenim el nostre crioprotector amb l’espuma també podríem posar-ho directament a nitrogen líquid a causa de que l’espuma va agafant el nitrogen líquid poc a poc.
També podem tenir les cèl·lules congelades a -80ºC però s’ha observat que si aquestes passen un any en el congelador després, quan les descongelem, no tenen tan de vigor.
Per mantenir les cèl·lules congelades podem tenir els criotubs en el gas del nitrogen líquid (nivell nitrogen baix) o en el mateix líquid (nivell nitrogen alt). Hi ha alguns investigadors que han notat que és millor tenir-les en gas líquid, però no està molt clar 2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T10 PROTOCOL DE DESCONGELACIÓ 1.
Retirar el criotub del tanc de nitrogen líquid, i immediatament sucar-lo en un bany María a 37ºC. Submergir sols la part congelada del criotub, mai el tap.
2.
Un cop descongelada la mostra, rentar el criotub per fora amb alcohol al 70%, transferir el contingut a un flascó.
3.
Afegir el medi suaument, primer gota a gota, i la resta (fins 5 ml) en uns 2 min. Aquest procés gradual és particularment important quan s’ha congelat amb DMSO, ja que la dilució ràpida pot causar canvis osmòtics que redueixin la viabilitat.
4.
Extraure una alíquota i fer un recompte. Si cal es pot determinar la viabilitat cel·lular.
5.
El medi s’ha de canviar per medi fresc quan les cèl·lules s’han adherit, ja que el DMSO és tòxic per a les cèl·lules i per tant s’ha de treure (primer deixem que les cèl·lules s’adhereixin i l’endemà canviem el medi). Si són cèl·lules que creixen en suspensió, ho dissolem en concentració salina o amb medi, ho centrifuguem, agafem la part de medi i afegim medi fresc.
3 ...