Informe: Purificación de espinacas (2016)

Pràctica Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 2º curso
Asignatura metodología
Año del apunte 2016
Páginas 15
Fecha de subida 02/10/2017
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¿Qué es lo que realmente contienen las espinacas? ¿Cómo cuantificamos la cantidad de proteína total? GRUPO B2: ANGELINA BACHEVSKAYA DIEGO ANTÓN VIANA SARA SIMÓN COLLAZO PROFESORA: XIMENA TERRA Facultad de Química 1 1. SÍNTESIS ................................................................................................... ………3  Introducción  Objetivo  Metodología  Resultados 2. METODOLOGÍA…………………………………………………………...…………..….4 2.1. Homogeneización…………….……………………….………………..………4 2.2. Precipitación con acetona ............................................................ .…..…4-5 2.3. Diálisis .......................................................................................... ..………5 2.4. Cromatografía en DEAE-celulosa………………..………….……………….5-6 2.5 Determinación de la actividad enzimática. FNR…………………..…………68 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………..……… ………..9 3.1. Purificación de FNR ...................................................................... ……..10 3.2. Concentración de proteína……………………………………………….…..11 3.3 Cuantificación de la purificación………………………………..….12-13 4. CONCLUSIONES ...................................................................................... .……..14 5. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................... .……..15 2 Introducción: En esta práctica se realizará la purificación de una proteína, la FNR, obtenida de las espinacas. La purificación consiste en separar una determinada proteína de su matriz biológica con la técnica del fraccionamiento para poder estudiar sus propiedades físicas y biológicas más adelante.
Objetivo: Con esto se conseguirá aislar esta proteína parcialmente y calcular su actividad enzimática. Esto servirá de ayuda para comprender mejor su funcionamiento y sus características además de saber si sería interesante trabajar con ella.
Material y Métodos: Para ello se realizan tres procesos basándose en tres factores de las proteínas: el fraccionamiento (según su solubilidad), la cromatografía iónica (según su carga) y la diálisis (según su tamaño molecular). Para realizarlo es necesario:  Tampón Tris-HCl  Espectrofotómetro  Centrífuga  Columna cromatografica  Saco de diálisis  Material común de laboratorio (vasos de precipitados, probetas, pipetas etc.) Resultados: A lo largo de los procesos se recogerán distintas fracciones para su análisis.
Tomando como referencia la fracción 1 (la cual tiene un rendimiento del 100% y una actividad enzimática de 258mol/ml), observamos que la fracción 2 tiene un rendimiento del 68,8% y una actividad enzimática de 177,6 mol/ml. Por último, la fracción 3 tiene una concentración del 53% y una actividad enzimática de 136,8mol/ml.
3 Conclusión: A partir de este experimento se ha conseguido medir la actividad enzimática y purificar la proteína FNR presente en las espinacas (Fig.1). Sin embargo, para purificarla completamente serían necesarios más tiempo y más procesos.
2.1 Homogeneización: En primer lugar, es realizada la homogeneización de 75 g de espinacas despecioladas en el túrmix con 110 mL de tampón Tris-HCl 50 mM frío.
Posteriormente se realiza el filtrado del homogenizado obteniendo el extracto crudo (E.C = 109 ml) del cual se congelará 1 ml (fracción 1).
2.2 Precipitación con Acetona En segundo lugar, se lleva a cabo el fraccionamiento con acetona al 35% para su posterior centrifugación a 4ºC y 5000 rpm después de la cual se descarta su precipitado.
Volumen de acetona a añadir = 109 ml 65% X ml acetona  35% 𝑋= 35 · 109 = 58,69 𝑚𝑙 65 En un vaso de precipitados se mezcla acetona fría con el agitado. Se deja reposar y se vierte en una botella de plástico El peso total que obtenemos es de 202,66 g. Se centrifuga 10 min a 5000 rpm. Al descartar el precipitado y medir el volumen sobrenadante obtenemos 148 ml.
Al sobrenadante (148 ml) se le añade acetona al 75%: 4 · Volumen de acetona a añadir = 148 = 51,8 51,8 = 96,2 96,2 · 75 = 288,6 25 51,8 = , Y tras dejarlo reposar se decanta y centrifuga de nuevo y de igual forma. Su sobrenadante es descartado en residuos halogenados y el precipitado se secará al aire. Posteriormente éste se es redisuelto utilizando la menor cantidad de tampón Tris-HCl posible.
2.3 Diálisis.
Ahora comenzará el proceso de diálisis. Para ello es necesario un vaso de precipitados de 2 L el cual contendrá tampón TRIS-HCl 5 mM. Para redisolver el precipitado en 10 ml de Tris-HCl 5 mM: 2000 · 5 1 · 1 50 = 200 50 La solución se introduce en el saco de diálisis anudado. Se coloca en el vaso de precipitados con los 2 L de Tris, tendrá lugar el intercambio de sustancias.
Se deja agitando toda la noche.
Mediante este proceso la FNR se separará de las proteínas más pequeñas, ya que el peso molecular de ésta es mucho mayor al peso de las proteínas que pueden salir del saco de diálisis.
2.4 Cromatografía en DEAE-celulosa Tras la diálisis tiene lugar la cromatografía. Para hacer la columna cromatografica es necesario un disco de papel de filtro que recortado y colocado al final de una jeringuilla fijada lo más verticalmente posible. Es necesario que esté conectada a un tubo de goma por el cual saldrá el líquido 5 de la jeringuilla de manera regulada mediante una pinza Hoffman unida a este tubo.
Con la columna cerrada, se añaden 2-3 ml de Tris-HCl 50 mM.
A continuación, se llena la columna con DEAE-celulosa (previamente equilibrada y suspendida en el mismo tampón). Se repite este proceso hasta que la columna alcance ⅓ de su altura.
2.5 Determinación de la actividad enzimática. FNR Después de lavar la columna con 15 mL de Tris-HCl el contenido del saco de diálisis es recogido y pesado (37,97 g).
Con el contenido del saco se realiza otra centrifugación a 14.000 rpm y 4°C durante 10 min. Después de medir el volumen del sobrenadante, 1 ml de esta muestra se corresponderá con la fracción 2.
Todo el sobrenadante es aplicado a la columna lentamente y abriendo la jeringuilla. Tras lavar de nuevo con 15 mL de Tris-HCl la columna, se diluye la fracción FNR con 30 mL de Tris-HCl 50 mM - 0.15 M NaCl para que se libere la proteína (Figura 1).
El volumen final es recogido en un tubo de 50ml y, tras medir su volumen, 1ml de éste será recogido como la fracción 3.
Figura 1: Explicación gráfica de la liberación de la proteína FNR 6 Tras esto se mide la actividad diaforasa de la FNR. Para hacerlo es necesario preparar 3 alícuotas de 1mL cada una.
La primera contendrá la fracción 1 sin diluir; la segunda, la fracción 2 con 750 mL de Tris en dilución ¼; y la tercera, la fracción 3 con 750 mL de Tris en dilución ¼.
A continuación, es necesario preparar 7 cubetas.
La primera contendrá 200 µl de DCPIP 0.19 mM y 800 µl de tampón Tris 50mM a pH 8; mientras que las cubetas 2 y 3 contendrán 390 µl de Tris, 500L de DCPIP y 100 µl de NADPH y 10 µl de la fracción 1.
Las cubetas 4, 5, 6, y 7 contendrán las mismas cantidades de Tris, DCPIP, NADPH y 10µl de las fracciones 2 y 3. Cuando estén hechas todas las cubetas se mide la absorbancia de cada una a 620 nm durante 180 segundos, empezando desde 0 y viendo la absorbancia cada 20 segundos.
También representaremos una recta patrón a partir de los siguientes datos, la cual usaremos más adelante para calcular la concentración de proteína de las fracciones: Tabla 1: Datos para realizar la recta patrón: Tubo 1 2 3 4 5 6 mL Albúmina 1 mg/mL 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 mL agua destilada 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 mg proteína/mL 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Para calcular la concentración de los patrones hemos realizado los siguientes cálculos: Tubo 2: , , , =0,2 mg/ml El resto de concentraciones se calculan utilizando el mismo método.
7 Figura 2: En esta gráfica se ve representada la recta patrón a partir de la ecuación de la cual podremos calcular la concentración de cada muestra.
Se tienen que realizar las siguientes diluciones: Tabla 1.1: Diluciones de las fracciones: Se realizan dos réplicas tanto de las alícuotas como de la recta patrón.
Fracción Dilución Vol. Muestra (µL) Vol. Agua (µL) F1 1/20 25 475 F1 1/50 10 490 F2 1/5 100 400 F2 1/20 25 475 F3 1/5 100 400 F3 1/20 25 475 8 A partir de los valores de la Tabla 1 se realiza la siguiente gráfica en la cual se ven representadas las absorbancias respecto al tiempo de las distintas fracciones.
Fig. 3: En la siguiente gráfica están representadas las medias de las absorbancias de cada fracción respecto al tiempo (eje Y), siendo ABS F1 fracción 1, ABS F2 fracción 2 y ABS F3 fracción 3 respectivamente.
Dato: Para poder calcular la pendiente con más precisión suprimimos varios valores de la absorbancia Las rectas que hemos obtenido se corresponden con las siguientes ecuaciones: Fracción 1: y= 0,0099x + 0,7487 R2 =0,9978 Fracción 2: y= 0,0062x + 0,7847 R2 =0,983 Fracción 3: y= 0,0036x + 0,765 R2 =0,9962 9 Para calcular la actividad enzimática primero hacemos la media de las pendientes de cada fracción, para poder utilizarla en la fórmula el signo negativo se cambia al positivo. La actividad enzimática (U) se calcula mediante la siguiente fórmula: Por ejemplo: 1 = 0,0099 0,109 21 1 Factor de conversión: 5,3 = 5,3 10 10 = 3,081 Deshacemos la dilución: 3,0831 · 100 = 308,31 Para calcular el rendimiento de la primera fracción tomamos como referencia a esta misma, sin embargo, para calcular el rendimiento de la segunda fracción dividimos la actividad enzimática de la segunda entre la primera, similar en la tercera.
De este modo pasamos a completar las siguientes tablas: Tabla 2: Purificación de la FNR Fracción Pendiente Dilución cubeta lectura 1 0,0099 1/100 2 0,0062 1/100 3 0,0036 1/100 Dilución Volumen fracción fracción (ml) 1 109 1/4 22,5 1/4 30,5 U (µmol/ml) Rendimiento (%) 308,31 159,42 125,49 100 51,70 40,70 En la tabla se observa que el rendimiento ha ido disminuyendo desde la fracción 1 hasta la 3, esto puede ser debido a la pérdida de reactivo durante el análisis.
10 A continuación, calcularemos la concentración de las muestras sustituyen la absorbancia de las muestras la recta patrón (Fig. 2): = 0,5359 0,1475 La fracción 1 tiene una absorbancia de 0,6585 por tanto tendrá una concentración de: = , , , = 0,9535 Ahora para calcular los mg de proteína en cada fracción tenemos que deshacer la dilución y multiplicar por su volumen (el resto de fracciones siguen el mismo procedimiento): 0,9535 20 109 = 2078,71 Con los datos calculados anteriormente completamos la siguiente tabla: Tabla 3: Concentración de proteína Fracción mg/mL Dilución fracción Volumen fracción (ml) mg fracción 1 0,9535 20 109 2078,71 1’ 0,2612 50 109 1423,77 2 0,7063 5 22,5 79,46 2’ 0,1810 20 22,5 81,45 3 0,2650 5 30,5 40,41 3’ 0,0942 20 30,5 57,48 11 Con los datos obtenidos acerca de la actividad enzimática y los mg de proteína en los previos cálculos para completar las tablas 1 y 2 ya explicadas, podremos calcular la eficiencia de la purificación que hemos realizado.
Con esto sabremos si hemos purificado adecuadamente nuestra muestra de espinacas y si hemos obtenido los resultados esperados.
La purificación de proteínas se usa para conseguir una muestra homogénea de un solo tipo de proteínas y poder trabajar con ella posteriormente. En este caso sólo averiguaremos si podríamos llegar a trabajar con alguna de nuestras muestras, ya que no haremos ningún experimento posterior.
Para completar la casilla de la actividad específica debemos dividir los resultados obtenidos en la tabla 1, casilla U (actividad enzimática) entre los mg de proteína obtenidos en la tabla 2. De este modo obtenemos: 1 = 308,31 = 0,14732 2078,71 Para completar la casilla del factor de purificación dividimos en primer lugar la actividad específica de la fracción 1 entre ella misma. Esta es la fracción que tomaremos como referencia, la cual tiene un factor de purificación absoluto.
Para calcular el segundo factor de purificación dividiremos la actividad específica de la fracción 2 entre la actividad específica de la fracción 3; mientras que para calcular la de la fracción 3 dividiremos su actividad específica entre la de la fracción 2.
De este modo para calcular el factor de purificación de una fracción debemos dividir su actividad específica entre la de la fracción anterior a ella.
En el caso de la casilla 3’ dividiremos su actividad específica entre la de la fracción 1, pues tomamos esta como referencia. De esta manera vemos como 12 el factor de purificación va aumentando conforme cada fracción, debido a que cada vez tenemos una muestra más pura de la muestra inicial.
Tabla 4: Eficiencia de la purificación Actividad Factor de purificación Fracción específica 1 0,14732 1 2 2,20745 14,9836 3 2,7449 1,2661 3’ 2,7449 18,6322 En la tabla podemos ver como la actividad específica va aumentando de una fracción a la otra conforme el rendimiento disminuye. Esto se debe a que cada vez la proteína está más concentrada. Sucede lo mismo con el factor de purificación.
13 Para realizar este proceso hemos tenido que aplicar diferentes técnicas de purificación como fraccionamiento con acetona, cromatografía etc.
Contrastando nuestros valores de rendimiento y actividad específica con los del artículo colgado en Moodle podemos afirmar que hemos realizado una buena purificación de la proteína FNR de las espinacas.
14  Artículo Moodle  Purificación de proteínas  Método cromatografía  Diálisis 15 ...

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