Tema 4 - Tècniques CGM (I) - FISH (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 19
Fecha de subida 09/04/2016
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 4 – Tècniques citogenètiques moleculars Les sondes emprades en les tècniques citogenètiques moleculars ens permeten identificar, localitzar i quantificar. Les tècniques que fem servir per localitzar són les hibridacions in situ.
Amb aquestes hibridacions, sobretot amb la FISH, podrem localitzar un RNA en el citoplasma o en teixits, i localitzar seqüències de DNA en cromosomes o nuclis.
FISH – Hibridació in situ fluorescent Les avantatges d’usar aquesta tècnica són: - - Comparant amb les ISH: o Rapidesa. La detecció és més ràpida que en les ISH no fluorescents.
o Seguretat. És menys perillós que l’ús d’isòtops radioactius.
o Versatilitat. Permet un anàlisi múltiple, amb diferents sondes per detectar diferents RNAs. Es detecten en funció de l’emissió fluorescent específica de cada sonda (ús de diferents fluorocroms). En les hibridacions in situ radioactives només podem utilitzar una sonda, ja que si en fen servir més no podem distingir d’on ve el senyal.
Comparant amb les tècniques citogenètiques: o Sensibilitat. La sensibilitat a la fluorescència és bastant elevada, més que en les tècniques citogenètiques clàssiques. Amb petites quantitats de sonda ja obtenim resultats amb una bona resolució.
o Anàlisi de mutacions cromosòmiques en cèl·lules interfàsiques. Les tècniques citogenètiques clàssiques precisen analitzar cèl·lules en divisió. En canvi aquí no és necessari tenir una metafase per poder observar l’alteració cromosòmica.
Una desavantatge de la hibridació in situ és el fet que la sonda arribi al seu destí. Per exemple, en els mitocondris és molt més difícil, ja que es troben dins de la cèl·lula i tenen membrana pròpia. Ens podem trobar casos en què no tenim senyal perquè la sonda no ha penetrat correctament. Això ho podem modificar en funció del pretractament que fem.
En el mercat trobem diferents fluorocroms que podem utilitzar. Cada fluorocrom té un espectre d’absorció i un d’emissió, en funció dels quals donaran un color determinat a diferents longituds d’ona. L’ús de més d’un fluorocrom permet la combinació de detecció de més d’una longitud d’ona.
97 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Detecció múltiple en RNA in situ. En aquesta imatge tenim l’expressió de diferents mRNA en un embrió de Drosophila. Cada transcrit ha estat marcat amb un fluorocrom diferent. Podem observar la distribució del RNA.
Els fluorocroms tenen un espectre d’excitació (absorció) i emissió característics per cada fluoròfor. Podem utilitzar fluoròfors amb diferents espectres i distingir els diferents colors amb un microscopi de fluorescència, ja que ens permet analitzar diferents longituds d’ona (amb diferents colors) segons el filtre.
En aquesta taula tenim la longitud d’ona màxima d’excitació/emissió pels fluorocroms més freqüentment usats.
Quan treballem sobre preparacions fent servir el microscopi de fluorescència, si fem servir múltiples sondes, usarem diferents filtres que permeten seleccionar la longitud d’ona de l’emissió que t’interessi.
Podem detectar alteracions cromosòmiques en cèl·lules quiescents (que no es divideixen; nuclis interfàsics). Fins la invenció de FISH eren necessàries les metafases.
98 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Desenvolupament de les tècniques FISH Per dur a terme una FISH, hem de trencar les estructures de doble cadena que puguem tenir per facilitar la hibridació; tant la mostra com la sonda s’han de desnaturalitzar.
MOSTRA Predesnaturalitzacó Desnaturalització Fixació SONDA Marcat Fragmentació Desnaturalització Mostra 1. En la mostra mantenim l’estructura; fem una predesnaturalització, un tractament suau del teixit. Podem tractar el DNA amb RNAses o bé amb proteïnasa K per eliminar o bé les proteïnes o bé el RNA perquè no interfereixin en les nostres sondes. Si aquesta pre no es fa de manera correcta no trobarem senyal perquè la sonda no penetrarà a la cèl·lula, i en fer rentats s’eliminarà.
2. Tot seguit treballem amb agents desnaturalitzants; s’ha de baixar la Tm i el pH tot el que es pugui, però no s’ha de fer en condicions massa severes, ja que les estructures s’han de mantenir.
3. Un cop desnaturalitzada, la fixem al portaobjectes. Aquesta fixació es fa amb Carnoy.
Sonda 1. La sonda ha d’estar marcada i 2. fragmentada abans de 3. desnaturalitzar-la. Aquí no fem servir agents, sinó que baixem la temperatura o el pH.
Mostra i sonda 4. Un cop tenim mostra i sonda desnaturalitzades, es dóna pas a la hibridació (renaturalització baixant les condicions de severitat). Tot seguit es fan rentats per eliminar la sonda que no hagi hibridat.
5. Per la detecció, primer fem incubacions i després rentats. Podem detectar mitjançant contratinció o antifade. La detecció es fa amb microscopis de fluorescència.
Una contratinció és una tinció que fa que les cèl·lules o estructures siguin més visibles quan no s’aconsegueix que ho siguin del tot amb una tinció principal. Normalment es fa servir clorur de propidi.
99 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 El microscopi de fluorescència només detecta llum fluorescent; per tal de posar de manifest els nuclis o els cromosomes objecte del nostre anàlisi per FISH, hem de fer contratinció. Si no hi ha contratinció, no fas un anàlisi in situ, perquè no analitzes les estructures.
Per exemple; marquem regions centromèriques. Només veurem un color i no sabrem on estan els nuclis. Si fem una contratinció del nucli en, per exemple, vermell, podrem delimitarlo, així com si volem marcar els telòmers.
Els tractaments d’antifade fan que la tinció sigui resistent durant molt de temps (mètodes antidecoloració o antiesmorteïdors). Es poden tractar les mostres amb DAPI o amb Iodur de propidi (PI). S’apliquen les solucions directament sobre les mostres de cèl·lules o teixits marcats amb fluorescència en portaobjectes de microscopi. L’antifade manté durant molt de temps l’emissió de la fluorescència.
100 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tipus de sondes Tenim diferents tipus de sondes: - De regió específica. Marquen una regió específica del cromosoma.
- Telomèriques. N’hi ha que reconeixen seqüències repetitives presents en tots els telòmers, per tant marquen tots els telòmers presents (pantelomèriques), i n’hi ha que són específiques pel telòmer d’un cromosoma en concret, per tant obtindrem senyal en el telòmer d’un parell de cromosomes (de seqüència única).
- Centromèriques. Marquen el centròmer. També poden marcar el d’un en concret (pericentromèriques) o poden hibridar amb tots els centròmers (pancentromèriques).
- Cromosòmiques. Poden marcar el braç curt o el braç llarg d’un cromosoma o bé el cromosoma sencer.
- Genòmiques. Marquen tot el genoma.
101 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 SONDES CENTROMÈRIQUES Si marquem centròmers d’un parell de cromosomes, en funció del senyal fluorescent del nucli, podrem saber quantes còpies tenim d’aquell cromosoma. Serveix en el diagnòstic d’aneuploïdies.
Sonda centromèrica del cromosoma X Per tal d’analitzar els cromosomes marcarem el cromosoma X i el cromosoma Y. Si només utilitzéssim una sonda per l’X, no podríem diferenciar X0 de XY.
La presència de l’X es pot detectar tant en metafases com en nuclis interfàsics.
L’ús de controls (referència) sempre ens proporciona una certa seguretat a l’hora de fer un diagnòstic.
102 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Diagnòstic prenatal d’aneuploïdies A partir del líquid amniòtic, podem fer múltiples tipus d’anàlisis citogenètics. Tradicionalment es feia el cariotip a partir de cèl·lules metafàsiques d’aquest líquid prèviament cultivades. Per aconseguir-les s’havia d’estimular la seva divisió (les cèl·lules amniòtiques no es divideixen), i això pot complicar l’estudi.
Actualment, la tècnica FISH permet detectar aneuploïdies en cèl·lules sense necessitat que estiguin en divisió. L’avantatge de FISH és que podem utilitzar qualsevol tipus de cèl·lula; no necessitem estimular la mitosi en aquest tipus de cèl·lules. Es poden analitzar les possibles aneuploïdies en el nucli interfàsic. A més ens permet diagnosticar les aneuploïdies en 2 – 4 dies a partir de cèl·lules amniòtiques no cultivades (l’anàlisi cromosòmica prenatal convencional podia durar de 8 a 14 dies).
Per tant, les tècniques FISH presenten avantatges respecte la tinció de bandes convencional.
Però el cariotip també té avantatges respecte la FISH, i és que es poden detectar alteracions cromosòmiques que no detectaries amb una FISH, com ara aneuploïdies provocades per una edat materna avançada. Les aneuploïdies més freqüents per aquesta causa són les que afecten els cromosomes 13, 18, 21 i els sexuals. La més freqüent és la del 21. La resta d’aneuploïdies fan que el fetus sigui inviable.
103 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Aneuploïdies dels cromosomes 13, 18, 21 i X En aquestes imatges tenim nuclis de cèl·lules amniòtiques del mateix fetus. En molts laboratoris es conjuguen sondes per detectar aneuploïdies en els cromosomes mencionats alhora. Normalment es treballa amb 5 sondes: una pel 21, una pel 13, una per l’X, una pel 18 i una per l’Y.
104 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 SONDES PANTELOMÈRIQUES 15/03/16 La diana d’aquestes sondes és el conjunt de telòmers de tots els cromosomes, ja que hibrida amb seqüències repetitives (TTAGGG) en tàndem presents als extrems de cada cromosoma. Aquestes sondes poden servir per determinar la grandària relativa dels telòmers.
Variacions en la llargada dels telòmers Hi ha moltes malalties descrites on la llargada dels telòmers es veu afectada. Els telòmers es poden observar tant en interfase com metafase.
La llargada dels telòmers es manté constant a les cèl·lules embrionàries i les de la línia germinal. En canvi en les cèl·lules somàtiques el telòmer es va escurçant progressivament al llarg del temps (pèrdua activitat telomeràsica). Aquest escurçament pot creuar un llindar a partir del qual la llargada del telòmer pot provocar malalties i síndromes anomenades premature ageing syndromes, malalties accelerades per l’edat.
En la següent imatge tenim marcats el telòmer (FITC-verd) i el centròmer (TAMRA-vermell) amb sondes de contrast amb TOTO-3 (blau) en biòpsies de còlon. La mostra A correspon a una donant jove que mostra intensitats de tinció iguals en telòmers i centròmers tant en l'epiteli com en les cèl·lules de l'estroma. La mostra B correspon a una donant gran que mostra una intensitat de tinció reduïda dels telòmers en les cèl·lules epitelials en comparació amb les cèl·lules de l'estroma en aquesta mateixa secció. No hi ha diferència significativa en la intensitat de la tinció de centròmer i DNA entre els diferents tipus de cèl·lules.
105 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Algunes malalties hereditàries presenten translocacions en el gen de la telomerasa o en el gen que codifica el RNA de la telomerasa, donant lloc a un escurçament progressiu més ràpid dels telòmers. A cada generació els símptomes són més greus, ja que els telòmers es van escurçant generació rere generació.
Les sondes pantelomèriques es poden utilitzar com a element de diagnòstic o com a suport d’aquest. En funció de la llargada del telòmer, podrem determinar una sèrie de possibles conseqüències i alhora de possibles causes.
Algunes malalties provocades per l’escurçament dels telòmers afecten el sistema immunitari i el sistema hematopoètic (disminució dels glòbuls blancs, anèmia, cèl·lules sanguínies immadures...).
106 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Q – FISH Les tècniques FISH es poden utilitzar per quantificar els telòmers, de manera que en cromosomes metafàsics es poden detectar els quatre telòmers de cada cromosoma.
Actualment es disposa de sistemes de software que quantifiquen la intensitat de les senyals fluorescents. Aquests sistemes s’anomenen Q-FISH (Quantitative Fluorescent in situ hybridization), i ens donen informació de cada telòmer de cada cromosoma.
També es pot mirar de quantificar mitjançant un Southern blot, però no obtindríem informació d’una cèl·lula en concret, sinó del global de la mostra. Pel Southern blot el que es fa són talls en dianes molt concretes (no es troben en les regions repetides dels telòmers).
D’aquesta manera, en tallar amb els enzims de restricció, la regió telomèrica queda intacta.
Tot seguit hibridem amb una sonda específica i observem una dispersió de la grandària; ens fem una idea global de la grandària dels telòmers, però no específicament per cada cèl·lula.
107 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 SONDES DE REGIÓ ESPECÍFICA Aquestes sondes són útils quan ens interessa detectar què passa en una regió concreta d’un cromosoma de l’individu. Aquesta sonda detectarà únicament aquesta regió.
Per a què es poden fer servir aquestes sondes? La FISH és una tècnica d’elevada resolució que permet detectar anomalies submicroscòpiques fins i tot en els nuclis de cèl·lules interfàsiques. És molt més resolutiva que les tècniques bàsiques.
Hi ha múltiples patologies associades a microdelecions o microduplicacions.
Algunes d’elles les tenim exemplificades a la taula. Aquestes microdelecions o microduplicacions són regions petites repetides que estan per sota del nivell de resolució de les tècniques de detecció de bandes. Per tant, necessitem treballar amb cromosomes poc condensats i fins i tot així és complicat torbar resultats.
Tenim diferents nivells de resolució: a) Tinció de bandes en cromosomes metafàsics (>5Mb). Els cromosomes metafàsics estan en el seu estat de màxima condensació. Amb aquesta tinció (que és la tradicional) no podem detectar una deleció que sigui més petita que 5 Mb.
b) FISH en cromosomes metafàsics (>1Mb). Amb tècniques FISH ja podríem detectar la deleció que no havíem detectat abans amb el bandeig. Per tant, una deleció de l’ordre de 2 – 3 Mb és molt fàcil de detectar-la per FISH.
c) FISH en cromosomes interfàsics (20kb – 1Mb). Amb aquesta resolució podem detector sondes en cromosomes interfàsics.
d) FISH en DNA estès (5kb-700kb) (1 – 2kb). La màxima resolució.
Com veiem, la capacitat de resolució de les tècniques FISH és molt major.
108 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Detecció de microdelecions Síndrome de Williams La síndrome de Williams ve donada per una microdeleció en la regió 7q11.23 que inclou el gen de l’elastina, gen que codifica una proteïna que contribueix a l’elasticitat dels vasos sanguinis. Aquesta deleció no és observable en un cariotip estàndard, però sí en FISH.
Síndrome de DiGeorge El síndrome de DiGeorg és una patologia produïda per una microdeleció del braç llarg del cromosoma 22). Tenen afectat el sistema immunitari i poc desenvolupades la glàndula paratiroidea i la melsa.
Ambdues microdelecions són molt fàcils de detectar amb FISH mentre que són complicades de veure en un cariotip de bandes, ja que són anomalies que estan per sota del nivell de resolució de les tècniques convencionals.
Utilitzem en la seva detecció una sonda control d’un altra regió del mateix cromosoma, normalment de la regió centromèrica. Amb aquesta senyal que està associada a la del control podem saber que hi ha dos cromosomes i que un d’ells presenta una deleció.
109 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Trencament 17cen-p53 que origina la pèrdua de p53 En aquest cas analitzem la regió concreta del gen 17cen-p53. Habitualment la pèrdua d’activitat del gen p53 dóna un mal pronòstic en processos cancerígens. En oncologia, se sol fer un diagnòstic inicial per veure les possibles alteracions en gens concrets que acostumen a estar presents a gens tumorals.
Normalment el pronòstic es basa en veure si hi ha pèrdua d’heterozigositat (LOH) mitjançant marcadors, però també es pot analitzar amb FISH la pèrdua de la regió 17cen-p53.
En condicions normals hauríem de tenir les dues còpies d’aquest gen en cada cromosoma. En cas d’haver-se produït una deleció, tindrem dos senyals corresponents al centròmer del cromosoma 17 però només un corresponent a la regió p53, tal com podem veure en les imatges següents.
En el cas del carcinoma de mama, el gen que pot influir en el seu desenvolupament és el HER2 (receptor 2 de factor de creixement epidèrmic humà).
110 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En molt de casos trobem tumors on predomina un tipus d’alteració cromosòmica. En la següent taula es mostren translocacions en regions específiques presents en diverses malalties. La detecció d’aquestes translocacions són la principal font de diagnòstic per totes aquestes malalties.
Cromosoma Philadelphia – gen de fusió ABL – BCR En el cas el cromosoma Philadelphia, l’oncogen afectat és el gen ABL, present al cromosoma 9, el qual transloca amb el gen BCR, present al 22. Si volem saber si les dues regions han patit una translocació, dissenyem dues sondes específiques: una pel cromosoma 9 (gen ABL, en vermell) i una pel cromosoma 22 (gen BCR, en verd).
Amb aquestes sondes, en una cèl·lula interfàsica no mutada trobaríem els senyals separats.
Per tant esperarem un nucli amb 4 senyals. En canvi, si s’ha produït la translocació, els senyals estaran junts en un anomenat gen de fusió (ABL-BCR). Per tant, en lloc de tenir quatre senyals tindrem 3 senyals en 3 llocs diferents (una verda per la còpia del 9, una vermella per la còpia del 22 i la verda-vermella pel gen de fusió).
111 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Limfoma de Burkitt – translocació 8 – 14; gen de fusió IGH – MYC Un altre exemple és el gen MYC. En aquest cas en la FISH tenim per una banda el gen del cromosoma 8 marcat en vermell i per l’altra el gen del 14 marcat en verd. Si mirem les imatges per separat, veiem tots els punts, però si les superposem veiem que hi ha tres senyals diferents, el que ens indica la presència de la translocació.
+ = En definitiva; aquesta és una manera de detectar diverses alteracions.
Tandem labeling Si dissenyem sondes al voltant de punts fràgils dels cromosomes, podem detectar si s’ha produït un trencament.
Quan es produeix un trencament, observem un cromosoma intacte que presenta dos senyals (en l’exemple de la imatge dos senyals verd i vermell) i després observaríem per separat un senyal verd i un senyal vermell.
112 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Hi ha molts casos en que els punts fràgils dels cromosomes van associats a tumors, com per exemple el del cromosoma 12, que està associat a càncer de mama. Els punts fràgils són element de pronòstic, però no de diagnòstic.
Aquesta tècnica a més, ens permet observar les diferències entre els processos de no disjunció i els trencaments: - - Si observem 3 punts grocs (corresponents a la suma dels senyals verd i vermell), hi ha hagut una no disjunció.
Si observem 1 o 2 punts grocs (suma de senyals verd i vermell) hi ha hagut un trencament.
SONDES CROMOSÒMIQUES Les sondes cromosòmiques marquen tot un cromosoma, de manera que podem mirar si aquest cromosoma té intercanvis amb altres cromosomes. Podem pintar els dos braços igual o un de cada color (pintat cromosòmic).
113 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En l’exemple, un cromosoma presenta translocació i una inversió pericentromèrica. Un altre cromosoma té una fusió que dóna lloc a un cromosoma dicèntric.
FISH MÚLTIPLE Sempre s’han volgut tenir sondes per tots els cromosomes. Fins fa poc s’utilitzava la combinació de 3 cianines diferents, que permetien obtenir 7 sondes diferents (es poden usar diferents proporcions).
Ara amb 5 cianines es poden obtenir 24 colors diferents per detectar els 24 cromosomes humans. Els software d’anàlisi els distingeix i ens els marca d’un color diferent perquè ho puguem diferenciar a simple vista.
114 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 FISH MULTICOLOR Aconseguint sondes pels 24 cromosomes podem estudiar tot el complement genòmic alhora.
Com hem dit, aquestes sondes actualment es poden aconseguir amb la combinació de 5 cianines diferents, que generen 24 sondes que ens permeten marcar tots els autosomes i els dos cromosomes sexuals que presenten els humans.
Amb això s’han desenvolupat nous mètodes que permeten l’anàlisi complex del genoma humà. Concretament, s’han dissenyat dos sistemes de FISH MÚLTIPLE per analitzar tot el complement: M-FISH i SKY, desenvolupats per laboratoris diferents.
M-FISH, Multiple Fluorescence In Situ Hybridyzation (Yale university) Consisteix en l’obtenció de cinc imatges digitals per separat per cada una de les cianines, que un software combina donant una imatge composta amb pseudocolors en funció de la composició dels fluorocroms.
SKY, Spectral Karyotyping (National Center for Human Genome Research Obtenció d’una imatge digital composta que un interferòmetre analitza les longitud d’ona de cada píxel i assigna a cada cromosoma un pseudocolor.
Ambdues tècniques tenen poques diferències, bàsicament en una els colors són més vius que en l’altra.
En aquesta imatge tenim una M – FISH d’una leucèmia mieloide crònica humana. Podem distingir les diferents reordenacions cromosòmiques.
115 ...