2n parcial TR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 4º curso
Asignatura Tecnologia de la reproducció
Año del apunte 2015
Páginas 40
Fecha de subida 27/03/2016
Descargas 16
Subido por

Vista previa del texto

Noelia Carrión 2n parcial TR CONTROL NEGATIU DE LA FERTILITAT AUTOAPRENENTATGE ESTERILITAT/INFERTILITAT HUMANA INTRODUCCIÓ Si mirem escoles anglosaxones/OMS, només parlen d’infertilitat. Ho defineix com una malaltia del sist reproductiu que es caracteritza per o aconseguir un embaràs dp de com a mín 12 mesos intentant-ho. La OMS estima que 1 de cada 6 parelles en països desenv es veurà afectada x infertilitat.
La OMS la divideix en dos tipus: Infertilitat primària: una dona no aconsegueix tenir una gestació ja sigui pq no es pot quedar embarassada o pq es incapaç de portar la gestació a terme (avortament).
I. secundària: una dona és incapaç de tirar endavant un embaràs però abans ha tingut algun antecedent d’embaràs Altres societats diferencien esterilitat i infertilitat: L’esterilitat és quan la parella mai ha aconseguit una gestació. Esterilitat 2aria quan la parella té antecedents d’altres embarassos.
Infertilitat és quan es produeix un embaràs però no es duu a terme (avort).
Els 12 mesos es posen pq es considera que una dona menor de 35 anys té una probabilitat de quedar-se embarassada d’un 25% per cicle, buscant aquesta gestació (en el moment de l’ovulació).
Un dels factors limitants de la repro humana és l’edat de la dona. A partir dels 40 anys la probabilitat disminueix fins un 10%.
Causes de l’esterilitat/infertilitat La causa és masculina en 40% dels casos, femenina en un altre 40% i mixta, és a dir, femenina i masculina, en el 20% restant.
Sense diagnòstic Quan l’estudi diagnòstic de la parella descarta altres causes possibles, es parla d’esterilitat/infertilitat sense diagnòstic (Idiopàtica) i, per tant, es tracta d’un diagnòstic per 1 Noelia Carrión 2n parcial TR exclusió. Això no vol dir que no hi hagi cap raó per explicar l’esterilitat, sinó que la causa no s’ha pogut identificar.
Aproximadament, entre un 15%-20% de les parelles estèrils/infèrtils pertanyen a aquest grup.
FACTORS CAUSALS DE LA INFERTILITAT/ESTERILITAT Alteracions en la producció de gàmetes Alteracions que no permeten o dificulten el contacte entre les gàmetes: no hi ha fecundació Alteracions en la implantació: hi ha fecundació.
Pot ser deguda a un factor únic o diversos factors concomitants Factors femenins Anovulació: no es dona una ovulació correcte. Es presenta en el 25% de casos d’infertilitat. Si es deu al mal desenv dels ovaris (atresia) no es fàcil. Si el problema es pel nivell d’hormones és fàcil de tractar, només s’ha d’administrar les hormones que fallen. En els casos de disfunció ovàrica, no s’usen els gàmetes de la dona.
Endometriosi: el tx uterí es troba fora de l’úter. Aquest tx té molta proliferació durant l’ovulació. Pot arribar a ovaris, trompes, intestí, bufeta, peritoneu i fins i tot a pulmons. Pot afectar a totes les dones. El tractament pot implicar cirurgia. Al voltant del 10% de dones tenen endometriosi, un 35% de les estèrils la presenten. Pot ser de causa genètica, no se sap bé.
Factor tubarics: afecta a l’oviducte. ~25% d’esterilitat es deuen a això. Les trompes de Fal·lopi són estructures molt delicades, té poca consistència en les seves parets, qualsevol alteració, dany...
el conducte sofreix fins i tot per una cicatriu. Els Z no poden travessar aquesta discontinuïtat o l’embrió no es pot implantar (no baixa). Pot tenir dif origens: infecció que provoca una cicatrització anòmala, operació d’apèndix mal feta, petita incisió...
Aquest factor va fer sorgir la fecundació in vitro.
Altres: anomalies en gàmetes, anomalies fecundació, anomalies desenv embrionari, anomalies cromosòmiques... en un 15% de dones.
- Avaluació de factors femenins Avaluació aparell reproductor i tracte reproductiu: Ecografia: usa ondas sonoras de alta frecuencia para observar órganos y estructuras al interior del cuerpo 2 Noelia Carrión 2n parcial TR Histerosalpingografia (HSG): radiografía especial en la que se usa un tinte (medio de contraste) para observar el útero (matriz) y las trompas de Falopio Laparoscòpia: visualiza abdomen y pelvis. Procedimiento quirúrgico mediante el cual se introduce un laparoscopio a través de una incisión.
Histeroscòpia: examina el útero Test hormonals: nivell baix FSH  probl en l’ovari.
LH elevada + FSH normal  Síndrome d’Ovari Poliquistic).
Estradiol  f(x) ovàrica.
Prolactina molt elevadahiperprolactinemia.
Progesterona: 1w dp de l’ovulació x descartar insuficiència de cos luti.
Testosterona elevada  SOP Test post-coital Estudis genètics: Citogenètica Screening genètic Factors masculins Causes pre – testiculars: problema endocrí. Es produeixen pocs Z per anomalies en els nivells hormonals. El tractament es administrar hormones.
Causes testiculars: probl del funcionament del propi testicle. Normalment afecta a la producció de Z. En el 55% dels casos. Això passa quan hi ha manca d’un o dos testicle (no baixen, cripto...), varius en els testicles (varicocele), infecció en el testicle (orquitis), paperes, inf de vies urinàries, per copa o lesions en els testicles (afecta a la barrera hematotesticular), exposició a calor excessiu, anomalies citogenètiques, anomalies en l’estructura dels Z, delecions cr Y...
Causes post testiculars: 30 – 35% d’incidència. Apareixen per problemes obstructius en els conductes per on els Z son portats cap a les vesícules seminals on s’uneixen al líquid seminal.
Aquestes obstruccions poden ser degudes a: Malformacions congènites. P.e absència de vassos eferents: ejacula però quan arriba al epididim no surten. Aquesta absència pot ser uni o bilateral. Aquesta malf va associada a fibrosi quística.
Infeccions de vies genitals. Cicatrius. Produeixen una obstrucció.
Cirurgia. Post – vasectomia Traumatismes 3 Noelia Carrión 2n parcial TR Probl en l’ejaculació (ej retrògrada): en comptes d’anar a l’exterior, el semen torna enrere, a la bufeta. Pot ser per probl congènits o neurològics (lesions columna, neuropatia diabètica...).
- Avaluació factors masculins Seminograma: volum, pH, nº Z, morfologia, diversitat, aspectes bioquímics, aspectes immunològics, nivells de frustosa.
Aspectes funcionals dels Z Test d’integritat de la membrana (HOS test) Reacció acrosòmica: si es dona a destemps, no fecunden l’oòcit Test post-coital: s’agafen mostres i es mira si hi ha bona relació entre el moc cervical i els z Test de penetració (hamster test): es mira la capacitat del Z per fusionar-se amb la mb plasmàtica de l’oòcit. S’agafen oòcits de hamster, es treu la ZP i es posen amb els Z humans. Els bons, es fusionen sense ZP  poden penetrar la mb de l’oòcit Test hemi-zona: avalua la capacitat d’unió dels Z a la ZP. Es tenen oòcits humans immadurs que tenen ZP. Es talla l’oòcit per la meitat, té 2 parts de ZP. Una part de la ZP s’enfronta a Z control, l’altra s’enfronta a una mostra problema. Dp s’avalua quants Z s’han unit. Haurem de tenir els mateixos que en el control. Prova difícil.
Tenim valors de ref del volum, nº de Z, motilitat... DIAPO 17 Nomenclatura: asteno: motilitat; a: ausencia; terato: anormal P.e: azoospermia  no hi ha Z. Sí motilitat Oligoastenozoospermia: poc moviment Test hormonals FSH: afavoreix la sintesi de testosterona, estimula l’espermatogènesi i la conversió de la testo a estradiol (1.0 – 12.0 mUI/mL) LH: ref 2.0 - 12.0 mUI/mL Prolactina: valors normals 2.5 – 17 ng/mL (53 – 360 mUI/mL). Valors elevatsnivell baix de testo, impotència...
Testosterona: normal entre 300 i 1000 ng/mL. Valors inferiors + FSH i LH elevades = hipogonadisme primari. Valors superiors + FSH i LH baixos = hipogonadisme secundari 4 Noelia Carrión 2n parcial TR Estudis microbiològics: infeccions Anàlisi immunològics Avaluació aparell reproductor i tracte reproductiu Biopsia testicular Vasografia Termografia i venografia Estudis genètics Citogenètica: es mira el cariotip Screening genètic: si hi ha absència de vassos eferents es miren mutacions freqüents Si el diagnòtic té un tractament s’aplica. Quan el Tx no funciona, tenim tècniques de repro assistida.
TÈCNIQUES DE REPRODUCCIÓ ASSISTIDA Europa es on més TRA es fa (~54%) 1.INDUCCIÓ DE L’OVULACIÓ És la més fàcil. Són dones anovulatories, no ovulen o tenen cicles molts irregulars o patologia ovàrica. Són probl endocrins moderats.
S’administren hormones per arribar als nivells necessaris per a que ovuli. FSH: estimuladora del fol·licle; hCG: anàloga a la LH, acaba la maduració i indueix la ovulació Pautes: El dia de la menstruació, a partir del 3r dia es comença a administrar hormones en dosis petites fins el dia 8. El dia 9 es monitoritza la pacient. Es mira si als ovaris s’han desenv els fol, el seu tamany...
Ecografia vaginal: observació dels ovaris. Comprovació del tamany i ritme de creixement del fol. Un fol·licle comença a estar madur quan té un min de 18 mm.
Anàlisi de sang: coneixement del nivell d’estrogens (estradiol). Es produeix als ovaris i augmenta a mesura que l’oocit madura. Es miren els nivells d’estradiol per veure si la f(x) ovàrica es com deuria.
5 Noelia Carrión 2n parcial TR Dp s’ajusten les dosis i quan es veu que hi ha un fol de ~18 mm s’administra la dosi de hCG  indueix maduració i la posterior ovulació del oòcit.
El dia del hCG es el dia 0, el dia següent ha de tenir relacions sexuals i al següent. A les ~40h de la 2ª injecció tindrem ovulació.
2.INSEMINACIÓ ARTIFICIAL Consisteix en la introducció del semen, prèviament tractat en el lab, a l’interior del tracte reproductiu de la dona en hores properes a l’ovulació.
Indicada en casos de factors masculins moderats: pocs Z, poca mobilitat... si hi ha incompatibilitat immunològica (s’introdueixen dp del cèrvix i no són atacats pel moc) En funció de com siguin les característiques de la dona, en un cicle natural es pot fer un cicle estimulat (dona amb probl ovulatoris + home amb probl). Si aquesta inseminació la fem en el cas d’un factor masc moderat, s’usa la mostra de la dona  insem homòloga Si s’usa semen d’un banc, és heteròloga.
- Inseminació homòloga (IA) Inseminació heteròloga (IAD-Banc) Cicle natural Cicle estimulat La mostra de semen s’obté per masturbació (2-7 dies abstinència) i recollir en un contenidor estèril 34% de taxa d’embaràs en dones de fins 30 anys; 12% en dones a partir de 45 anys.
Per fer una inseminació amb èxit necessitem 5 milions d’Z mòbils.
La mostra de semen es diposita en l’úter de la femella. La dona està en posició ginecològica, es fica un espèculum per obrir el cèrvix, amb un cateter flexible es carrega una suspensió d’Z i es carreguen 0.3 – 0.5 ml. S’introdueix el cateter a dins de l’úter i es deixa anar la mostra de semen al fons uterí  inseminació intrauterina (la + comú).
Inseminació artificial en cicle estimulat La majoria d’inseminacions es fa en un cicle estimulat per induir ovulació. S’administren hormones.
S’ha de tenir ben monitoritzada a la pacient. Quan es dona la injecció de hCG s’ha de tenir en 6 Noelia Carrión 2n parcial TR compte quants fol·licles estan desenvolupant-se. Si hi ha molts fol·licles, es para el cicle i s’espera al següent.
Procediment: a l’endemà de l’administració de hCG se li fa la inseminació artificialment (dp de 3035h) de l’administració de hCG.
Si no es controla, es pot tenir un embaràs múltiple  risc per la dona i els fetus.
3.FECUNDACIÓ IN VITRO Es posen junts, en un cultiu, oòcits i Z. El 1r intent va ser al 1978 i al 74 va néixer el 1r.
Indicacions quan: Les dones tenen una bona funció ovàrica però tenen anomalies a les trompes (tubàriques), com oviductes obstruïts, absència congènita d’oviductes.
Si hi ha pocs Z o es mouen poc Incompatibilitat immunològica Parelles amb infertilitat idiopàtica Que necessitem tenir? Un nº suficient d’oòcits que ens permeti tenir èxit en la fecundació. Normalment, s’agafa més d’un oòcit s’ha de fer una hiperestimulació ovàrica controlada. L’objectiu es eliminar la dominància fol·licular administrant hormones.
Hi ha diferents grups de fàrmacs, es juga amb els tipus de fàrmacs i amb el temps que s’administren i quan. Depen de les característiques de la dona, del centre... s’usarà un protocol o un altre.
S’administren agonistes i antagonistes de GnRH per a que la dona tingui un nivell estable durant el cicle. Se suprimeix la producció de GnRH (no allibera) o bé l’acció sobre la pacient (la sintetitza però no troba la diana pq es sintetitzi FSH, no deixem que l’hipofisi fabriqui gonadotrofines). Els nivells que tingui la dona d’hormones serà el que li doni el metge.
Les gonadotrofines es poden obtenir per dues vies: purificades d’orina (de dones menopàusiques, embarassades...) o sintètiques (d’origen recombinant). El que es fa més sovint és usar FSH recombinant i dp hCG d’origen urinari.
Ex pauta d’estimulació A partir del dia 3 del cicle s’administra a la pacient FSH recombinant (150-225UI) *unitats individual A partir del dia 6 o quan veiem que hi ha fol·Licles que tenen 14-15 mm es comença a administrar antagonistes de la GnRH (se segueix administrant FSH). Quan s’observen fol·licles de 19-22mm induïm la maduració dels oòcit administrant hCG (5000UI). Al cap de 36-38h dp d’administrat la hCG fem puncions fol·liculars, no deixem que la pacient ovuli (el fol·licle no es pot trencar).
7 Noelia Carrión 2n parcial TR Punció fol·licular: la pacient està anestesiada, es fa sota control ecogràfic per via vaginal (no passa per l’úter) localitzem els fol·licles dons dels ovaris. Acoplat al ecograf s’incorporen agulles llargues acoplades a un catèter i a un sistema d’aspiració. Quan es localitza un fol·licle, s’introdueix a l’agulla per aspiració (aspira el líquid del fol·licle + oòcit). Cada fol·licle es recupera amb un tub independent. En un fol·licle ben desenvolupat poden haver 5-7ml de líquid.
Localització dels complexes cummulus-oòcit (COCs): al laboratori, sota una lupa, es busquen els oòcits envoltats de cummulus en el líquid que han extret.
Avaluació morfològica dels COCs: l’objectiu és seleccionar els oòcits madurs (metafase II). Ens basem en l’aspecte morfològic del cummulus.
Un cummulus condensat, amb moltes capes, apretat (1ª foto) és un signe d’immaduresa.
Les cèlls del cummulus estan expandides, laxes. Bon pronòstic. Foto 2 y 3 Podem trobar oòcit sobremadurats, trencats...
- Preparació mostra de semen: l’objectiu bàsic es seleccionar els Z més mòbils. Indirectament els induïm la capacitació.
2 procediments: Gradients de densitat: són unes columnes amb solucions de dif densitats, capes de polimer.
Aquestes capes seleccionen els Z. El polimer que s’usa és el Percoil i es fa un gradient de percoil al 50%, al 70% i al 95%. A la part superior es col·loca una det mostra de semen. La mostra pot ser sencera o sense plasma seminal. Aquest tub se centrifuga a 400g durant 20 – 45’. Els Z que tenen bona motilitat travessaran les 3 capes i van a parar al fons del tub; els altres es quedaran en fases intermitges. Dp recupero la capa del 95%i el botó cel·lular (pellet), fem rentats amb medi de cultiu per eliminar el Percoll i finalment aconseguim una suspensió de Z.
Swim-up: el semen es dilueix amb medi de cultiu, centrifuguem a 200g durant 10’. Els Z queden en el botó i el plasma seminal serà el sobrenedant. Anem fent rentats. En un dels últims rentats, resuspenc el pellet i a sobre possem (gota a gota) medi de cultiu. Els Z que tinguin molta motilitat aniran cap el medi de cultiu, amunt.
En alguns casos, trobem mostres de semen bones però dp de fer aquest procés de selecció perden motilitat al cap del temps. Tenim productes que tornen a potenciar la motilitat. P.e la Pentoxifilina  es barreja amb una solució de Z, s’incuba a 37º durant 30’ i dp rentem. Aquests Z s’usaran per fer la fec in vitro. Tb s’usa la cafeína.
- Inseminació en placa: en la placa tenim oòcits individualitzat en pouets. En cada pouet dispensem un volum det de Z. Es possen ~100.000 Z/mL o 25.000 Z/oòcit. Per fer aquesta fec, a l’oòcit no 8 Noelia Carrión 2n parcial TR s’elimina el cummulus ja que eviten la polispèrmia. Aquest procedimet es fa entre 4 i 6h dp de la recuperació dels oòcits. Si esperem abans els oòcits envelleixen.
4.INJECCIÓ INTRACITOPLASMÀTICA D’Z (ICSI) Es un procediment de FIV.
S’injecta dins els cyt de l’oòcit tot l’Z (cua i tot). Per fer això es necessita una tecnologia de micromanipulació.
Indicacions: en factors masc severs (pocs Z, poca motilitat), fallos previs de FIV, indicacions especials. Tb quan s’usen Z de l’epididim.
ICSI té mes taxa de fecundació (75%)que la FIV.
Sist de micromanipulació: amb uns comandaments (~joystick) es fan moviments grans que es transformen a la punta de l’eina en mov petits, fins. La platina ha d’estar a 37º. Es fa dins d’una cambra estèril.
Procediment: al centre de la placa hi ha una gota amb l’Z i al voltant hi ha microgotes amb oòcits.
Amb l’agulla d’injecció aspirem un Z (del final de la gota, pq s’enlentixen) i amb l’agulla se li trepitja la cua (desorganitzem la cua i l’axonema, quan el deixem anar, la cua estarà cargolada. Li parem la motilitat pq no trenqui les estr oocitàries; tb desestructura la mb del Z, que facilita la incorporació dels elements del Z dins del oòcit). A continuació aspirem l’Z fent-lo entrar a la pipeta desde la cua.
No hem d’agafar massa vol de medi!!!! Ara, passem a treballar amb la microgota on està l’oòcit.
L’oòcit el mantenim subjecte amb una agulla de holding. A continuació localitzem el corpuscle polar (no entrem per aquí que hi ha la placa metafàsica): es col·loca el corpuscle polar a les 6 o a les 12.
Amb l’agulla punxem l’oòcit, atravesso la ZP, la mb plasmàtica i quan estic al cyt aspirem una mica per assegurar que estic a dins (agafarem un liquid granular), injecto l’Z i finalment retirem l’agulla.
Repetim el procediment amb les altres microgotes.
En aquest cas, els oòcit no tenen cummulus: col·loquem els oòcits en una só amb hialuronidasa.
Queda un forat a la ZP i la mb plasmàtica es torna a sellar.
Utillatge “extra”: Sistemes òptics de llum polaritzada (PolScope): té una il·luminació amb llum polaritzada, al deixar passar la llum, veiem estructures més refringents, com el fus. Abans de fer la microinjecció, il·lumino amb llum polaritzada x localitzar la placa metafàsica, l’apaguem i punxem. Això es fa pq no sembla la placa està per sota el corpuscle.
IMSI (intracytoplasmatic morphologically selected sperm injection): són adaptadors que magnifiquem les imatges dels Z. Podem veure les regions dels Z.
Control fecundació 9 Noelia Carrión 2n parcial TR 16-22h post procediments. Hem de veure 2 PN i 2 CPolars.
Taxa fec FIV: ~70% Taxa fec ICSI: ~85% 5.CULTIU EMBRIONARI IN VITRO Els embrions es deixen en cultiu i en estadis més avançats seran transferits. Aquest cultiu in vitro és un sistema de selecció, agafem els embrions amb més potencial de desenvolupament.
El dia 2 dp del cultiu veiem embrions en estadi de 2 i 4 cells. El dia 3 trobem embrions en estadi 6-8 cells. Al final del dia 3 veiem 32 cells. El dia 4 ja veiem morules. Al dia 5 trobem blastocists. Al dia 6 trobem un blastocit expandit, al màxim de la seva capacitat.
A partir del dia 6, l’embrió comença a eclosionar, fan un forat a la ZP i surten. Quan el blastocist abandona la ZP s’ha d’implantar. Si no troba cap lloc on implantar-se, morirà. En cultiu no es pot implantar.
Aquest seguiment es fa al laboratori, es valoren dif paràmetres de cada embrió. Aquestes valoracions ens serveixen per escollir els embrions de major qualitat. Podem transferir l’embrió en qualsevol estadi, no hi ha un moment ideal; depén de la pacient, centre...però s’ha vist que hi ha més taxa d’embaràs en dones joves si fem transferència en l’estadi de blastocit. S’ha d’arribar a un equilibri, no podem tenir els embrions fins a estadis avançats si veiem que no tenen molta qualitat, si tenim pocs...
EmbryoScope: són sistemes d’incubació i valoració d’embrions. Té petits incubadors, amb plaques de 6-8 pouets (pocillos) i a sota de cada pouet hi ha una càmera. Es grava el desenv dels embrions i així podem fer un seguiment dels embrions de manera continua, valorem més paràmetres i no cal treure els embrions de l’incubadora (més estable).
6.ECLOSIÓ ASSISTIDA (ASSISTED HATCHING) En alguns casos, abans de la transferència es fa una eclosió assistida. Es fa un forat a la ZP per facilitar la sortida de l’embrió. Com es fa? El més habitual es fer descarregues de làser (degradació x fotolisi). S’apunta amb el làser a una regió de la ZP (cap a l’exterior) i es donen pulsos de làser. Foto DIAPO 27 Indicacions: En dones de >37 anys, embrions que tenen una ZP molt gruixuda, embrions amb fragments cel·lulars (hi ha cells lisadesl’embrió té menys energia), dones que tenen 3 fallades prèvies d’implantació i en embrions congelats (s’endureix la ZP).
S’aplica en ~2% dels cicles de FIV/ICSI. Taxa d’embaràs dp de l’assisted hatching: ~32-40% 7.RETIRADA DE FRAGMENTS Foto DIAPO 28 10 Noelia Carrión 2n parcial TR El desenv de l’embrió es pitjor quan es trobem fragments. Es fa un forat a la ZP, s’introdueix una pipeta i s’aspiren aquests fragments. Deixem els blastomers que tenen bona morfologia. L’embrió dp de netejar-lo tindrà menys cells però continuarà el seu desenv. Aquest procediment es fa fora de l’estufa. Els blastomers són massa grans per sortir pel forat que fem.
8.TRANSFERÈNCIA D’EMBRIONS S’escullen els de més qualitat; segons criteris de morfologia, ritme de divisió, característiques cel·lulars.
Es fa x transferència intrauterina sota control ecogràfic. Entren el cateter fins al cèrvix. Es deixen els embrions el més al fons possible. Ells mateixos s’implantaran.
Per llei, es poden transferir fins a 3 embrions.
Hi ha altres tipus de transferència embrionaria, p.e transferència intratubarica  posen els embrions a la trompa. És més perillós. Es fa en països que no fan cultius, els col·loquen en estadi de pronuclis.
La taxa d’embaràs es de ~40%. Varia en funció del nº d’embrions transferits(si transferim 1 embrió la TE ~26%, si transferim 2 la TE augmenta fins al 42%), pacients, edat...
Els embrions de bona qualitat no transferits es criopreserven en un banc d’embrions.
Destí dels embrions criopreservats: ús propi dona/parella, donació, recerca, cese conservació. Els projectes de recerca han d’estar aprovats per organismes oficials.
Cada any a catalunya es congelen 30.000 – 35.000 embrions.
Com més anys portin congelats, menys qualitat.
Transferència d’embrions criopreservats Cicle espontani (no es torna a donar fàrmacs a la dona), monitoritzat amb coincidència descongelació i estat fisiològic de la receptora (sempre que sigui possible) Èxit descongelació: ~65% dels embrions criopreservats. Variabilitat relacionada amb qualitat dels embrions quan es van congelar, origen, estadi embrionari (PN, cells, blastocit), protocol congelació.
Cultiu in vitro post-congelació/transferència sense cultiu Suport fase lútia: donen progesterona T. embaràs ~33% 9.DONACIÓ DE GÀMETES 11 Noelia Carrión 2n parcial TR Donació d’Z (IA/IAD/FIV de donant). Indicacions: factors masculins, dones sense parella masculiina, causes infeccioses, post tractaments de certs càncers, risc de transmissió d’anomalies genètiques) Donació d’oòcits. Indicacions: edat avançada, manco d’ovaris o oòcits, post-tractaments oncològic, risc transmissió anomalies genètiques...
Un mateix donant pot tenir un màx de 6 fills. Si queda mostra d’aquell donant s’elimina.
Fan un simulacre d’estimulació de la fertilització per veure com respon (fertilitat prèvia en alguns centres) Sincronització cicles donant-receptora: se sincronitza els dos cicles menstruals. La donant li administren anticonceptius durant un periode x activar la producció ovarica. A la receptora tb es fa.
Quan les dues estan al mateix punt del cicle, a la donant es comença a administrar agonistes de la GnRH i a la receptora se li administra estrogens. A la donant se li fa el mateix protocol que el de una FIV (administració FSH. Quan tingui un tamany de fol·licles adequat se li dona hCG) i a la receptora se li comença a donar progesterona. Amb els oòcits es farà una FIV o una ICSI. A la receptora se li continua administrant progesterona fins el dia 100 de gestació.
Quan no podem sincronitzar, es congelen els embrions de la donant. Es fa la transferència a la receptora en un altre cicle.
Una altra opció es congelar els oòcits  Vitrificació. Actualment tenim bans d’oòcits.
Les donacions són anònimes i altruistes (es rep una compensació).
10.MESA/PESA/TESA/TESE En aquells pacients azoospèrmics, es busquen Z en altres regions com en l’epididim o en el testicle.
Els trobem més immadurs però tb poden fer una bona fecundació.
MESA (microsurgical epididymal sperm aspiration): s’obre la bossa escrotal, es busquen Z al epididim i aspiren.
PESA (percutaneous epididymal sperm aspiration): punxen a l’epididim.
TESA/FNA (testicular percutaneous sperm aspiration/fine neddle aspiration): s’aspira tx testicular TESE (testicular sperm extraction): es fa una biopsia.
En tots aquests procediments s’ha de fer ICSI. 4-5% de casos.
Indicacions: absència de conductes deferents (es fan proves per saber si té fibrosi quistica), homes que s’han fet una vasectomia. Passem a testicle quan hi ha molts pocs Z (en tractament oncològics).
S’ha de disgregar el material, el tx testicular i allà, entre els tipus cel·lulars, sangs... hem de trobar algun Z.
12 Noelia Carrión 2n parcial TR 1r es recuperen Z, es congelen i dp al cap d’uns mesos s’estimula a la dona i quan es va a fecundarla es descongelen els Z.
TECNOLOGIES ASSOCIADES A LES TRAs 1.SELECCIÓ D’Z Se seleccionen els Z amb més potencial de fecundar, mobilitat. Hi ha procediments que els seleccionen segons el seu perfil genètic; s’apliquen en animals Aconseguim embrions del sexe que volem Fer-ho en humans està prohibit al nostre país.
el que es fa es usar una mostra de semen; es tenyeix amb un colorant amb afinitat pel DNA i emet fluorescència (Hoechst). El nucli de les cells queda tenyit (aquest colorant penetra molt bé a les mb i no té efecte mutagènic). A continuació, aquesta mostra es processa a través d’un citometria de flux i es valora la intensitat de fluorescencia (+ fluores  + DNA).
Els Z tenen una forma molt asimètrica, poden passar pel citometre en dif orientació. La casa comercial que va patentar aquest sistema, va fabricar dos detectors de fluorescència: amb un valora si el Z passa ben orientada i l’altre detector mesura el DNA.
Poblacions més enriquides en Z portadors de cr Y / Z portadors de cr X: en humans hi ha diferència d’un 2’8% en el contingut de DNA (X>Y).
En bovins hi ha una eficiència elevada: quan fem sorting pel cr X es de 80 – 90% i en el sorting del cr Y 70 – 80%.
2.DIAGNÒSTIC GENÈTIC PRE-IMPLANTACIONAL Caracterització genètica d’embrions en estadis preimplantacionals (o oòcits) amb l’objectiu de transferir aquells diagnosticats com sans.
Indicacions en el cas de: Alt risc de transmissió d'anomalies genètiques: Portadors de malalties monogèniques Portadors d’anomalies cromosòmiques Millorar resultats cicles reproducció assistida: si els pacients tenen avortaments de repetició, fracassos cicles previs, edat materna, factors masculins… 13 Noelia Carrión 2n parcial TR Altres: Compatibilitat HLA (benefici per tercers. P.e tinc un nen malalt que necessita transplantament de cells; se seleccionen embrions compatibles amb el nen. Dp de néixer s’usarà la sang del cordó), risc de malalties d’aparició tardana, risc càncer...
El DGP és una opció per les parelles.
Procediments Hem de tenir embrions. Per tant, es imprescindible que les parelles que entren en un programa de DGP passin per reproducció assistida (ICSI té millors T de fecundació i evita el risc de contaminació de la mostra).
Dp d’això hem d’obtenir biòpsies embrionaries. Amb micromanipulació.
Previ a l’obtenció de la biòpsia s’ha de fer obertures a la ZP: DIAPO 6 Per mètodes mecànics  una agulla travessa l’embrió sense tocar les cells i es fa fregant amb l’agulla gran fins que aconseguim fer un forat.
Mètodes enzimàtics: introduïm una pipeta que té un enzim que degrada la ZP; l’enzim es va dispersant al voltant de la ZP.
Làser: la + aplicada. Es fan descarregues de làser, per fotolisi degraden la ZP.
Aquests procediments es poden fer amb l’oòcit. En comptes de fer una biopsia de blastomers, s’aspiren els corpuscles. Es fa una obertura a la ZP, introduïm una pipeta a l‘espai perivitel·lí i aspirem el CP. El CP es una imatge especular de l’oòcit. P.e si al 1r CP li falta un cr, aquest estarà a l’oòcit. Es poden agafar els 2 CP, tindrem + info.
El més corrent és usar biòpsies de blastomers. S’introdueix la pipeta en un blastòmer i s’aspira una d’aquestes cells.
Tb es poden usar cèlls del trofectoderm: es treballa amb blastocist. Es talla la ZP, s’aspiren un parell de cells del blastocist i amb el mateix làser fer un tall i retirem unes quantes cells.
Avantatges: no toquem l’embrió i no m’emporto material embrionari. Limitacions: només podem abordar patologies d’origen matern en el cas dels CP. Si en blastomer retirem + d’1 cell reduïm el potencial de desenv normal de l’embrió. L’avantatge de blastomers es que des de que retiro la cell fins que transferim l’embrió tenim més dies per fer l’estudi (1 cell es idèntica a les altres).
L’avantatge del trofectoderm es que tenim + cells. L’inconvenient es que la implantació pot no funcionar (els embrions es bloquegen) i tenim poc temps d’estudi. Podem congelar les cells per evitar aquests inconvenients.
Dp de treure les cells de l’embrió el deixem en cultiu in vitro o el congelem. Mentres, s’analitza genèticament la cell  ha de ser orientada a la indicació (mirar enfermetats 1r...), usar test fiables, 14 Noelia Carrión 2n parcial TR ràpids. La ppal limitació dels anàlisis genètics es que la quantitat de material per anàlisi és 1 cell (6pb DNA), pot ser que aquesta cell no sigui igual a les altres...
Dp de l’anàlisi es farà la transferència dels embrions diagnosticats com sans.
Cada biòpsia s’analitza individualment. S’han de manipular acuradament, especialment quan volem obtenir l’extensió (en portaobj) d’una cell. Identificació acurada d’embrions i biopsies. S’ha de treballar en unes condicions determinades per evitar risc de contaminació.
Tipus d’estudis: - - Caracterització citogenètica: tenim nucli interfase de la cell. Aconseguim l’extensió del nucli del blastomer. Es fa una FISH sobre aquests nuclis. DIAPO 11 1ª foto, centromer cr X i centromer Y (vermell) i centromer del cr 18. Es poden usar varies combinacions de sondes, marcar de dif color... 2ª foto: hi ha dos marques per cada cr, si a un li falta un tros només es veurà d’un color. Cr 18 i 21 en casos de trisomia i 16 i 22 en casos d’avortaments. Es mira si hi ha anomalies en aquests cr implicats. Els que tinguin alteracions no els transferirem.
3ª foto: deduir la quantitat de cada cr. Hi ha 2 marques pel cr 14 i 3 marques pel 13.
Actualment s’usen arrays. Abans de fer aquest array s’ha d’amplificar el DNA d’aquesta cell array CGH (aCGH). Obtenim un cariotip + acurat, veiem si hi ha guanys/pèrdues d’un determinat cr.
Caracterització gènica: s’amplifica del DNA (PCR). Tenim estratègies de diagnòstic i estratègies d’amplificació (detecció). Estudi de ~200 malalties severes genotipades. És ! no contaminar la mostra. Pot ser que en la 1ª ronda d’amplificació falli el procediment i pot ser que no tinguem resultat per manca de material. Hi ha casos que presenten fenomens de allele drop-out (ADO), dels 2 al·lels hi ha un que amplifica menys o quasi no ho fa; hi ha preferència d’amplificació d’un al·lel. Si l’al·lel mutat té un ADO, serà un error diagnòstic.
Per controlar això s’amplifica dif regions d’una mateixa seq.
Estudis genètics en corpúscles polars En dones normals, sense anomalies, tenen una elevada incidència cromosòmica als oòcits. En c.n, una dona fabrica >20% d’oòcits anormals. Això augmenta amb l’edat. Treure un CP en bones condicions es difícil. No+ ens dona info materna. Pot ser que hi hagi un al·lel mutat que estigui en el CP (l’oòcit estarà bé) però a la meiosi es dona recombinació i pot ser que s’acabi donant un cr amb una cromatide amb la mutació en oòcit i en CP. S’ha solventat fent l’anàlisi dels 2 CP. Si en el 1r sut afectat i en el 2n tb, l’oòcit es normal. Si el 1r surt afectat i el 2n normal, l’oòcit està afectat. Només s’usa en països on la llei prohibeix fer anàlisi d’embrions.
HLA matching Es vel un transplantament a un nen que té leucemia. Fem un germà que tingui HLA idèntic al germà. S’usa sang del cordó umbilical per obtenir precursors hematopoyètics. ¼ dels embrions que tinguem seran histocompatibles.
15 Noelia Carrión 2n parcial TR Si la malaltia és hereditaria, volem tenir embrions sans i histocompatibles (¾ x ¼ = 3/16).
Predisposició Es fan estudis de prevenció de malalties severes. P.e alzheimer precoç, càncer de còlon, càncer de mama i tiroides. Es fa quan hi ha una probabilitat elevada o quasi certesa de desenv la malaltia. No susceptibles a TX curatius.
De totes les parelles que es van sotmetre a diagnòstic genètic preimplantacional només un 55% eren infèrtils.
3.MICROINJECCIÓ D’ESPERMÀTIDES – ELSI/ROSI/ROSNI S’aplica en casos extrems de no producció d’Z. Aquestes tècniques es basen el microinjectar espermàtides, la cel n precursora. Poden injectar espermàtides elongades (comencen a tenir cua)  ELSI. Es disgrega el tx testicular i es busquen espermatides elongades. Si no es troben, injectem les rodones  ROSI (round). Bon microscopi, experiència i marcadors morfològics com veure un començament molt inicial de cua, depressió al cap quan comença a formar-se l’acrosoma. ROSNI  s’usa en casos esporàdics. Es microinjecta el nucli de l‘espermàtide rodona.
T.embaràs ROSI = <3%. T. Fecundació ELSI = 50% i T gestació = 30%.
4.MADURACIÓ OOCITÀRIA IN VITRO (MIV) El 1r naixement de donant va ser al 91, el 1r naixement del pacient va ver al 94 i el 1r naixement a Espanya va ser al 2006.
Tenim 2 opcions: - Oòcits de fol·licles antrals Recuperem oòcits de fol·licles que tenen antre, venen sense estimulació de la dona (o poca de FSH).
Es va fent el seguiment ecogràfic de la pacient i es valora la mida de l’endometri i del fol·licle. Fols que tinguin 8 – 12 mm són antrals, llavors s’administra hCG (10.000UI) 36h post hCG es fa la punció fol·licular Molts d’aquests oòcits estan en VG. Es fa un cultiu de 24h. Dp d’això avaluem si veiem un CP, si l’oòcit està madur. Es treballa amb cultius ue aconsegueixin una bona maduració nuclear i cyt.
Es farà ICSI. Si fem FIV tradicionals no hi haurà blocatge de polispèrmia; en oòcits inmadurs els grànuls corticals no estam orientats.
16 Noelia Carrión 2n parcial TR Preparació endometrial abans de la transferència.
Aplicacions: •Pacients de risc o quan no està indicat estimulació ovàrica •També és interessant per poder utilitzar els oòcits immadurs recuperats en les puncions de cicles estimulats Eficiència maduració però baixes taxes d’implantació (10 – 15%) - Oòcits de fol·licles primordials Recerca Es pretén recuperar tx ovàric (els fol·licles són F primordials). Es fa un cultiu de fol·licles i arribem a tenir oòcits madurs i fol·licle antral. Es disgrega el fol antral i recuperem l’oòcit.
Es continua aquest cultiu in vitro fins a obtenir oòcits amb CP.
Aplicacions:  Tractar pacients oncològiques. Congelació. Es tenen resultats pitjors que els anteriors  l’oòcit, al treure-li el fol·licle es reprèn la meiosi molt espontània i ràpida, es dona x dif causes. S’està intentant fer, en aquestes fases de cultiu fol + antre, s’estan posant productes que inhibeixin la maduració. Quan hi hagi bon creixement cyt es treuen. Retrasen la sortida de la meiosi.
Aquests procediments tb tenen interés en animals productius. Cultiven oòcits per fer experiments de clonació, transferència nuclear.
CRIOPRESERVACIÓ DE GÀMETES I EMBRIONS 1.CONSEQÜÈNCIES DE LA DISMINUCIÓ DE LA TEMPERATURA - Efectes sobre l’aigua intracel·lular: formació de cristalls de gel IC (són estructures agressives per a les cell; trenquen estructures, augmenta de vol...), xoc osmòtic i increment de la [ ] IC de soluts (augmenta la [sal] de la cell) - Efectes sobre el metabolisme: disminueix. Hi ha moltes rxons que són Tª dependents. Quan ja està la cel congelada va bé però abans, afecta ala viabilitat - Efectes sobre les mb: quan baixa la Tª es trenquen el dobles enllaços entre PL la mb es torna més rígida, menys fluïda  és més fràgil i es trenca fàcilment. L’estructura de la mb cel tb varia pq la interacció entre els PL, proteïnes de mb...es perd. Hi ha una redistribució de components a 17 Noelia Carrión 2n parcial TR l’atzar. Quan tornem a la Tª de 37º aquesta estructura es pot recuperar (dobles enllaços, cadenes...) però les molèc que s’hagin mogut no tornen al lloc original. Canvi estructura  cavi f(x) - Efectes sobre el citoesquelet: són molt sensibles. Concretament els microtúbuls (es despolimeritzen), filaments d’actina. Es poden tornar a polimeritzar però l’organització canvia.
p.e si congelem un oòcit en metafase II, els microtúbuls es reorganitzaran i pot haver una pèrdua cromosòmica.
2.FACTORS QUE INFLUEIXEN SOBRE LA CONGELACIÓ - Tipus de cell: forma i mida cell, composició de la mb (afecta a la permeabilitat) - Tipus de contenidor: contenidors de volum gran (criotubs de plàstic ~2,5 - 5ml), vol petit (palletes ~20 µL. Puc agafar dif parts deixant una bombolla d’aire entre els dif materials), vol molt petit (al seu extrem tenen una estructura de nansa de col, cullera. Col·loquem una gota de cels).
Avantatges/inconvenients: un contenidor gran costa + de descongelar. Contenidors de poc vol es descongelen molt ràpid. Els petits congelen millor. En f(x) del tipus de cell, nº procés de congelació... triarem el contenidor.
El semen es congela en criotubs i palletes. Embrions es congelen en palletes i criotops i els oòcits en els petits.
- Un crioprotector minimitza l’efecte de la congelació. Tenim 2 tipus, Crioprotectors permeables: molec de baix pes molecular. Travessen les mb plasmàtiques, fan el seu efecte a l’int de la cell. Els més usats són: glicerol, etilenglicol...
Avantatges: - Afavoreixen que la cell es deshidrati (redueixen la formació de gel, augmenten la viscositat), Estabilitzen mb: les molec queden intercalades Punt de congelació + baix que l’H2O Disminueixen el punt eutèctic: es congela a Tª + baixa  tenim [sals] que s’assoleixen a Tª + baixes. BUSCAR PUNT EUTECTIC Rormació del intracel a Tª + baixa + solvent Inconvenient: toxicitat cel·lular Crioprotectors no permeables: alt PM, no travessen les mb. Efecte indirecte sobre la cell -> afavoreixen la deshidratació cel. Redueixen el xoc osmòtic durant les descongelació (l’H2O no entrarà massa ràpid x trencar la cell). Tenim sacarosa, glucosa, lactosa, midó, prots (llet desnatada) El que s’utilitza es una combinació de crioprotectors permerables i no.
- Protocols i taxes de refredament 18 Noelia Carrión 2n parcial TR Les T de refredament han de ser molt suaus  protocols lents. Fem un refredament molt controlat fins a -60º o Tª inferiors. Dp a N líquid.
Protocols ràpids  controlen la disminució de la Tª fins arribar a -30 / -40. Dp ho posen en N líquid.
Protocols ultra-ràpids: vitrificació. Immersió directa en N líquid. -196º S’ha de trobar l’equilibri: Bona deshidratació cel·lular però no tant lenta com per deshidratar excessivament. A 30º la conductivitat hidráulica és 1,05; a 12º és de 0,26. Si volem que es continui deshidratant ho tindrem + temps a 12º (¿?) Temps en temperatures especialment crítiques (+15ºC a -15ºC)  encara tenen activitat metab Temps curt d’exposició al crioprotector en temperatures crítiques - Protocols descongelació: Hem de triar les taxes d’escalfament. Depenen dels protocols de congelació, tipus cel·lular, contenidors… Dilució i eliminació crioprotector: dependrà de la permeabilitat del crioprotector. Afegim crioprotectors no permeables al medi de descongelació (ajuden a una rehidratació més controlada), en un sol pas/per passos...
Trobar equilibri: Bona hidratació cel·lular però no molt ràpida per no induir recristalització aigua. Una entrada massa rápida, els cristalls de gel que queden dins formaran més cristalls  Boom Bona hidratació cel·lular però evitant el xoc osmòtic Temps en temperatures especialment crítiques (+15ºC a -15ºC) 3.CRIOPRESERVACIÓ D’ESPERMATOZOIDES Com que tenen poc cyt és fàcil deshidratar-los.
Les mostres de semen tenen risc d’estar infectades x això posem AABB.
A -80º sublima Efectes de la congelació: 19 Noelia Carrión 2n parcial TR Lesions directes: pèrdua viabilitat, pèrdua motilitat, capacitació prematura (per una FIV no passa res però per una inseminació artificial no arribaran al oviducte), permeabilitat de la membrana alterada, disrupció membrana acrosòmica (ra espontànea...) Lesions latents: disminució potencial fértil Viabilitat post-congelació: Tsupervivència ~50% en humans  limitació si són mostres de pacients infèrtils 4.CRIOPRESERVACIÓ D’OÒCITS L’única manera es per congelació ultra-ràpida (vitrificació). Els de conservació lenta danyaven el fus.
-Exposició a [crioprotector] molt elevades deshidratació molt ràpida i molt CP intracel·lular (dins la cell; el cyt será molt viscós sense quasi H2O) -Immersió directa en N2 líquid (-15.000ºC/min). Citosol: sòlid vitri degut a la gran viscositat del crioprotector. No hi ha gel.
Consideracions: S’usen volums petits (20µl), contenidors petits (cryotips), la majoria oberts durant el procés. Molta rapidesa de manipulació per minimitzar toxicitat del crioprotector a Tª ambient.
Agafem 2-3 òcòtis en 2-3µL.
Lesions: Lisi cel·lular. No es lisen però hi ha pèrdua viabilitat. En altres veiem canvis cyt.
Canvis estr zona pel·lúcida (enduriment, trencament...) Fem ICSI per tenir taxes ~80% 5.CRIOPRESERVACIÓ D’EMBRIONS Dos tipus de protocols: congelació lenta / vitrificació (similars als vistos en oòcits) En funció de l’estadi en que congeli, característiques del embrió, mare... ens condiciona els resultats.
Si congelem en zigot, es pot lisar i ens quedem sense embrió. En estadi 2 cells si una es lisa queda un altre i encara tenim possibilitats de tenir un embrió. El mateix que amb 4-8... Però com més cells tenim hem d’ajustar els temps de congelació. Si congelem a mòrula, és + difícil que els 20 Noelia Carrión 2n parcial TR crioprotectors arribin a les cells. Congelar a blastòcit és lo més difícil pq la cavitat blastocèl·lica està plena de líquid. Actualment, els blastocists es congelen x vitrificació; els altres podem escollir.
Protocols de congelació lenta Hem de tenir uns sistemes que congelin suaument: congeladors biològics programables. Hi ha una càmera on s’injecta LN, col·loquem les palletes i mitjançant un ordinador programem la Tª, temps...
Un punt crític que té aquest protocol és el risc de sobre-refredament; podem arribar a Tª + baixes de la Tª de congelació i el contingut de la mostra no es congeli. Quan arriba la Tº crítica es forma gel i hi ha un calor latent de solidificació i passem d’una mostra de -15 a -1 però torna a baixar de cop pq està envoltada de LN. Solució: induïm nosaltres la formació de gel, sembrem amb gel (iceseeding); es fa tocant la mostra amb una pinça congelada (manual o automàticament). Ho fem a -7º i només s’escalfarà fins a -2º.
En una mateixa palleta tenim la só on tenim els embrions i la só que usem per descongelar.
1r baixem la Tª a -2º/min. Quan arriba a -7 es manté durant 10 min i fem el seeding.
Baixem -0.3º/min durant 2’ fins arribar a -30º. Baixem -35º/min fins arribar als -150º Vitrificació Só amb [ ] elevades de criop permeable i no permeable.
Es col·loca l’embrió en una só d’equilibri ([crioP] moderada). Ho canviem a un altre pouet amb [crioP] elevada.
Podem treballar amb varis embrions. Dona bon rendiment en blastocit i en embrions que han passat per una biòpsia deixant-los arribar fins a blastocit i vitrificar (no congelarem amb un forat a la ZP).
Lesions: Lisi cel·lular. Repercussió per l’embrió dependrà de l’estadi embrionari (PN, cèl·lules, blastocist) i protocol congelació Pèrdua viabilitat Viabilitat post-descongelació: Ratolí: 80-90% dels embrions congelats es recuperen i es divideixen en cultiu “in vitro” Humà: ~65% dels embrions es recuperen i divideixen en cultiu “in vitro” Taxes embaràs en humans: ~33% 21 Noelia Carrión 2n parcial TR 6.CRIOPRESERVACIÓ DE TEIXIT OVÀRIC Hi ha centres amb bancs de teixit ovàric Es pretén una preservació de la fertilitat en pacients oncològiques o amb altres tractaments gonadotòxics quan està contraindicat l’obtenció d’oòcits. No podem fer superovulació.
Protocols de congelació i descongelació específics: Diferents tipus cel.lulars en el tx, gruix del teixit, exposició llarga al crioprotector per arribar al màxim de cèl·lules… Si volem trasplantar, el tx ha de tornar a ser funcional.
Si volem fer cultiu in vitro, hem de poder recuperar oòcits viables Usualment es congela el teixit en fragments petits i prims (strips) (1.5 cm x 0,5 cm i 2 mm gruix) Podem agafar un troç o tot l’ovari. Es guarden en criotubs.
Es poden fer trasplantaments orthotopics (al peduncle ovàric, on estava)  aconseguim que la dona recuperi la seva ciclicitat i aconseguir embarassos normals.
Transpl heterotopics (el tx ovàric es trasplanten a altres llocs del cos que estiguin sans). Tenim 2 opcions, una es que aquest transpl es faci a la propia dona (autograf) i l’altre (no es fa) en un altre sp d’animal (xenograft). En aquests casos recuperem oòcits madurs i es fa una FIV. Normalment es trasplanten subcutani en el avantbraç o subclavis (sota l’aixella). Es deixa que aquest tx recuperi la seva funcionalitat. Donaran fol·licles, es punxa per agafar un oòcit i es fa una FIV.
El probl dels ortotopics es que tenim un risc de que l’ovari reintrodueixi cels canceroses al tx on s’ha trasplantat.
7.CRIOPRESERVACIÓ TEIXIT TESTICULAR/ESPERMATOZOIDES TESTICULARS Previ a un cicle amb TESA/TESE, preservació fertilitat pacients oncològics o amb altres tractaments gonadotòxics, preservació fertilitat quan es preveu aplàsia de cèl·lules germinals en el futur Es pot agafar la biopsia testicular  disgregació tx testicular  congelació de la suspenció cel·lular O, biòpsia testicular  congelació tx testicular 8.GESTIÓ DELS BANCS DE GÀMETES, EMBRIONS I TEIXIT GONADAL Efectes a considerar: 22 Noelia Carrión 2n parcial TR -Efectes criopreservació sobre les cèl·lules -Viabilitat post-descongelació Temps conservació: en LN és il·limitat Possibles riscos: -Risc descongelació accidental: nivell adient de LN -Efecte de les radiacions terrestres. No s’ha demostrat -Risc contaminació creuada de mostres. Es difícil que passi. En pacients que sabem que tenen una càrrega vírica, la mantenim lluny del banc d’embrions.
RISCOS DE TÈCNIQUES DE REPRO ASSISITIDA Hi ha anomalies genètiques que poden ser transmeses i que en un individu que no tingui anomalies per causa de les TRAs el nadó neixi amb anomalia.
1.TRANSMESES Hi ha causes genètiques d’esterilitat/infertilitat masc o femenina - Anomalies gèniques: fibrosi quística, delecions Y, síndrome Kartagener, POF...
Anomalies cromosòmiques: portadors/es de translocacions, inversions... la gametogenesi està compromesa. Formen un % de cromosomes desequilibrats.
TRAs permeten aconseguir gestacions amb gàmetes pròpies a individus que ho tindrien impossible o molt difícil.
Compte amb l’aplicació indiscriminada de TRAs Importància dels estudis genètics en parelles estèrils/infèrtils Importància consell reproductiu 2.EFECTE TRAs Risc relacionat amb embarassos múltiples Hi ha risc per la mare, risc en la gestació, en el part... els nens neixen prematurament (menys pes) Abans de les 37 setmanes es considera prematur.
23 Noelia Carrión 2n parcial TR Reduir la multiplicitat implica que només tinguem 1 embrió. S’està treballant en poder saber quin és el moment ideal per fer la transferència (finestra d’implantació) que pot variar 1-2 dies. S’agafa tx de l’endometri i es fan anàlisi.
Es fan transferències úniques en pacients amb bon pronòstic.
Riscos associats als procediments Si usem FIV convencional, tenim un risc de polispèrmia. La polispèrmia dona poliploïdia, aquestes les podem detectar el cap de 20h (veiem més de 2 pronuclis en l’embrió) Si no les detectéssim, tindriem pèrdues embrionàries (avorts). Hi ha casos de 3n que han nascut però es moren al cap de poc temps. Això ens dona com a conseqüència de que sí hi ha risc de polispermia però com moren, tenim menor eficiència de la tècnica. No repercutim en individus nascuts.
En les aneuploïdies no hi ha increment respecte la població gral. Els casos d’aneuploidia descrits s’han relacionat amb edat materna (igual que en gestacions naturals) no amb FIV.
Si usem FIV – ICSI temin 3 possibles riscos: Introducció de DNA exògen (risc teòric, cap cas reportat). D’origen microbià o humà.
Anomalies cromosòmiques. En embarassos dp de fer fiv-icsi es veu que en algunes sèries, arriben a ser ~1,6% (superior al normal). Aquestes sèries són molt variables; alguns autors descriuen increments, altres no. Els grans reculls de dades donen increments en la incidència; però al començament de l’aplicació de la tècnica s’usaven gàmetes d’individus portadors això explicaria el % elevat. Tb trobem variacions entre els centres (aspectes metodològics) però aquest increment no és tan alt com per recomanar un prenatal. S’han vist anomalies estructurals i numèriques relacionades per l’estrés mecànic de la microinjecció (segregació no equilibrada de cromàtides/ per la pressió que fem al introduir el líquid del Z poden causar trencaments en el DNA).
Defectes d’imprinting. S’han descrit en nens nascuts dp d’ICSI (i FIV però en menys casos). a partir de 2002 sorgeixen treballs que suggereixen un risc d’imprinting. Podrien estar causats per: Defectes dels gàmetes: s’han vist patrons de metilació/acetilació dif en individus infèrtils (Z).
Ús de gàmetes masculins immadurs (MESA, TESE...) Estimulació ovàrica: aconseguim uns oòcits que en condicions normals no seria dominant, haguessin patit atresia. Per tant, forcem als oòcits a ser madurs. Tb passa per utilitzar gàmetes immadurs Composició cultiu in vitro: es consoliden les marques d’imprinting en embrions. La consolidació d’aquestes marques durant el cultiu es veu afectada.
24 Noelia Carrión 2n parcial TR En repro assistida en animals s’ha observat Large Offspring Syndrome (LOS): les característiques fenotípiques recorden a dif síndrome en humans. Només s’ha observat en bovins i ovins per tant, tenen un transfons genètic.
No hi ha evidència suficient per establir una relació entre aquestes síndromes i les TRAs. Hem de seguir recollint dades.
Criopreservació: afecten a les cèls i donen mort cel·lular. Menor eficiència de la tècnica. No demostrada cap repercussió en individus nascuts. ***en la preservació d’oòcits usem vitrificació*** DGP: hi ha resultats discrepants. Hi ha grups que tenen sèries de bessons univitel·lins (un embrió que té una obertura a la ZP del tamany que es fa en una biòpsia, quan l’embrió vol fer attching es queda a mig sortir. Veiem a vegades que en les contraccions que fa l’embrió per sortir es parteix i en queden 2; podriem tenir bessons). En ratolins no s’observa. On s’observa són grups que no fan servir làser si no enzims per foradar la ZP. L’altre risc es que em DGP només escollim un embrió.
Errors diagnòstics: 28 casos/40000 cicles. Cap error diagnòstic reportat des de 2010.
Mix ups: error al triar els gàmetes, s’agafa Z d’un altre. A més de l’aspecte ètic, podria tenir conseqüències en quan a “risc genètic” en funció del genotip dels progenitors. De 1972 a 2011 s’han descrit 39 casos (cap al nostre país). S’estima que pot haver error en el 0.04% de cicles (cal tenir en compte que no s’acostuma a demanar diagnòstic de paternitat en TRAs) 66% deguts a errors en la codificació mostra seminal, 44% deguts a errors d’identificació embrions. Figura del “Controler” o “doble check”millors tècniques d’identificació. L’embrioleg dicta el que va fent i hi ha un altre que comprova la feina. Eines per una millor traçabilitat El prenatal es fa en pocs casos. Les dades només reflexen una part de la població.
Les TRAs no comporten riscos afegits a la població excepte els d’imprinting, que s’estan estudiant.
Riscos genètics TRAs Les anomalies poden incrementar però el risc d’un embaràs a terme amb una anomalia genètica e baix. En det circumstàncies, el risc pot ser més elevat  mesures preventives (Dx prenatal) Usuàries La majoria d’estudis no descriuen cap relació entre els tractaments hormonals i l’aparició de tumors d’ovari o úter.
Les anomalies genètiques es poden veure incrementades amb determinades TRAs, però el risc d’un embaràs a terme amb una anomalia genètica es baix En determinades circumstàncies, el risc pot ser més elevat ⇒ recomanació de mesures preventives (Diagnòstic prenatal) Compte amb l’aplicació indiscriminada de TRAs! 25 Noelia Carrión 2n parcial TR Importància dels estudis genètics en parelles estèrils/infèrtils Importància consell reproductiu pre i post REPRODUCCIÓ EN ANIMALS AUTOAPRENENTATGE TRAs EN ANIMALS 1.CICLES REPRODUCTIUS Tema anterior 2.INSEMINACIÓ ARTFICIAL En països desenv >70% de les vaques lleteres s’obtenen per IA Aplicacions: - Incrementar productivitat de mascles valuosos (1 mostra de semen pot donar 500 dosis) Obtenir descendència sense transportar animals (producció, zoos...) Augmentar variabilitat genètica en pobl reduïdes Protecció de femelles valuoses. P.e cavalls són molt agressius quan monten a la femella. Hi ha risc a que li trenquin les potes o l’esquena a la femella.
Obtenció de mostres de semen: Hem d’agafar mascles que siguin sexualment madurs. Si treballem amb mascles que tinguin repro estacional s’han d’agafar durant la temporada reproductiva.
Mètodes: - Electroejaculació: s’usa en animals de zoo, bovins. Apliquen polsos elèctrics molt lleus en pròstata i vesícules seminals x provocar erecció i ejaculació Massatge manuals: en gossos Vagina artificial: toros, bocs, cavalls... és un sistema que enganya a l’animal. Tb es fa que quan el mascle vagi a muntar a la femella s’aparti i se li fiqui la vagina artificial (en toros). En cavalls es fabrica un cavall i quan el mascle vagi a muntar-la se li fica la V artificial 26 Noelia Carrión 2n parcial TR El volum de la mostra varia segons sp. 5-6 ml en cavalls. 12ml en toros, 30 en porcs... la [Z] tb és variable.
Conservació del semen: es fa un anàlisi de la mostra i es preparen les dosis adequades i es congelen posteriorment. No totes les mostres poden ser congelades (porc); hi ha sp que quan es recull la mostra s’ha de repartir les dosis i usar-les en fresc. Hi ha altres sp que dona + bon resultat si refrigerem (4º). Hi ha animals que la congelació va bé i es poden emmagatzemar en bancs de semen (p.e en bovins). El temps màxim d’emmagatzematge depen de la tècnica de conservació.
Les dosis s’ajusten i es poden usar en dif tipus de IA depèn de la sp: inseminació en cèrvix/ inseminació intrauterina.
En alguns casos fem IA en cicles naturals, s detecta el estre de la femella i al cap d’uns dies farem IA. Un altre opció és estimular a les femelles hormonalment i fer la IA quan pertoqui (cicles d’estimulació). Segons l’sp fem un timing d’inseminació o un altre.
Taxes de gestació: 60 – 90%.
3.SUPEROVULACIÓ I OBTENCIÓ D’EMBRIONS Aplicacions: - - Incrementar la productivitat de les femelles valuoses Establiment de bancs d’embrions congelats Obtenir elevats nº d’embrions x recerca “ “ “ x projectes biotecnològics “ “ “ x controls de qualitat. Abans de començar els cicles habituals en el lab, es miren els cultius d’embrions; si creixen bé les condicions de cultiu seran correctes Magatzem d’animals modificats genèticament Estratègia habitual: superovulació amb tractaments hormonals + creuament amb mascle o IA Hi ha dif protocols.
Com s’administren les hormones? Injeccions. La progesterona, en el cas d’ovelles es va disminuint la dosi. Es fa una ~esponja, s’impregna en una só de progesterona i s’introdueix en la femella de manera que es vagi alliberant.
Recuperació d’embrions Rentat uterí. Anestèsia + epidural; s’introdueix un catèter flexible que està unit en un medi de rentat (só salina). El medi entrarà a l’úter, rebufarem i tornarà a sortir. Tindrem un col·lector estèril.
No han d’estar implantats, calcular bé el timing. Hi ha sp més petites en el que cal cirurgia. En altres casos, com en soques de lab o animals molt petits hem de sacrificar els animals i recuperar els embrions.
27 Noelia Carrión 2n parcial TR Es pot repetir varies vegades. No podem forçar a la femella superovulant-la; de mitjana obtenim dif nº d’embrions: 10 en vaca, 15 en ovella, 50 en porc. La tornarem a superovular al cap d’un temps pq no els hem tret tots. Aquests embrions es poden transferir en fresc o congelar-los.
4.OBTENCIÓ D’OÒCITS Aplicacions: -obtenir elevats nombres d’oòcits per recerca -obtenir elevats nombres d’oòcits per projectes biotecnològics -obtenir elevats nombres d’oòcits per aplicar procediments de FIV -incrementar la productivitat de les femelles valuoses Estratègia habitual: Superovulació amb tractaments hormonals (= als d’obtenir embrions però en comptes de fer IA quan acabem amb l’administració hormonal fem intervenció per recuperar els òocits) Oòcits pre-ovulatoris → fol·licles (LOPU/OPU: laparoscopic ovum pick-up). Ovum pick-up (punció transvaginal ecoguiada): Localitzar x ultrasons on està l’ovari i fer una punció per recollir oòcits.
LOPU: A l’animal se li introdueix un estri de laparoscopia, visualitzem l’interior de la regió abdominal de la femella; es punxa l’ovari i aspiren.
Oòcits ovulats (poc freqüent) → per tamany o característiques anatòmiques de l’animal no es poden punxar els ovaris. Els agafem de l’oviducte (requereix cirurgia o sacrificar l’animal en casos d’animals de laboratori com els ratolins) La coloració + fosca dels oòcits es degut a que estan plens de vesícules lipídiques (mat de reserva) 5.FECUNDACIÓ IN VITRO (convencional i ICSI) Aplicacions: -incrementar la productivitat de mascles i femelles valuosos -obtenir descendència d’animals amb problemes fertilitat (espècies o varietats determinades, certes soques animals experimentació, animals en perill extinció, ...) -obtenir elevats nombres d’embrions en estadis concrets de desenvolupament recerca/biotecnología per Estratègia habitual: Superovulació amb tractaments hormonals 28 Noelia Carrión 2n parcial TR Obtenció mostra espermatozoides (ejaculat, epidídim caudal) Procediment FIV o FIV-ICSI S’ha de tenir un protocols per soques d’animals de lab (guió pràctiques) Rentat i selecció dels espermatozoides ejaculats Rentat: centrifugació en medi isotònic. Eliminem plasma seminal per eliminar les substàncies decapacitants.
Selecció: -swim-up -centrifugació en gradients de densitat de percoll -filtració en llana de vidre: té molta càrrega estàtica, 1r es possa medi de cultiu dp el semen i recullen el que hagi passat.
Capacitació dels Z in vitro Ens els Z d’epididim s’usen capacitats, si no ho estan no fecundaran. Tenim dif procediments de capacitació. És important la Tª amb la que treballem (38-39º) i la duració de la capacitació. En porc, es capaciten durant 4h, en bovins calen >6h. Posem productes en el medi que faciliten la capacitació som heparina o ignòfor de Ca++ en bovins, sèrum d’ovella en zel en ovelles...
Tinc una mostra de Z capacitada (de l’epididim caudal!), els posem en un medi juntament amb els oòcits. Podem usar un grup d’oòcits i Z i cultivar-los junts. És ! ajustar la [Z] a cada sp per obtenir taxes de fecundació òptimes. La Tª és crítica en aquest procés.
Tenen una ZP molt densa i gruixuda. En alguns casos d’ICSI es fa prèviament un forat en la ZP per fer entrar l’agulla. No cal vigilar on està el CP (foto DIAPO 15), l’aspecte físic de l’oòcit... En oòcits molt foscos, difícils de manipular, es col·loquen en un eppendorf i es dona un pols de centrifuga per a que les vesícules caiguin en un costat del cyt.
6.CULTIU IN VITRO D’EMBRIONS Aplicació: -assolir estadi desenv desitjat per congelar o transferir Sistemes de cultiu in vitro: Co-cultius amb cèl·lules somàtiques (cúmulus, granulosa, fibroblasts...). Es fan monocapes de cells, donen un suport pq quan possem els embrions i el medi a sobre, creixin millor.
Cultius en medis definits, complexes o seqüencials.
29 Noelia Carrión 2n parcial TR Problemes derivats del cultiu in vitro: -Bloqueig dels embrions -Large offspring syndrome (LOS). Es relaciona amb: cultiu in vitro períodes llargs, [O2] elevada durant el cultiu, medis de cultiu complexes (sèrum), co-cultiu amb cels somàtiques  no observat en ratolins porcs...(es fan cultius curts o sense serum). Actualment s’han millorant els sist de cultiu Aplicacions: - Obtenir descendència a partir d’embrions produïts o manipulats in vitro - Incrementar la descendència de femelles valuoses (producció) - Obtenir descendència de femelles que no poden mantenir la gestació (avorten, canibalisme, eugues corredores...) - Obtenir descendència d’sp protegides fent transferències interespecífiques (en bòvids, petits felins en perill d’extinció...) Darrera d’això hi ha una vessant productiva i econòmica. Hi ha llocs que venen embrions. Això estalvia traslladar animals.
Ex protocol: en alguns casos fem transferència en fresc (si estan propers): 7.TRANSFERÈNCIA D’EMBRIONS Tenim femelles sincronitzades. Al dia 6 -7 estan receptives. Agafem els embrions i els transferim a les altres vedelles.
Taxes gestació >70% Els embrions es transfereixen en morula i blastocist. En vaques se’n posen 1 o 2, en porcs 20 – 40.
La transferència és intrauterina. Per a que les femelles estiguin sincronitzades se li fan tractaments hormonals o es posen les femelles totes juntes i al cap d’un temps s’acaben sincronitzant.
En altres casos transferim embrions congelats: Per obtenir descendència d’sp protegides: NODIAPO. Col·loquem embrions d’una sp en una altra (transferència interespecífica). Al 60’s – 70’s s’usava per transportar embrions quan era dificil congelar-los. En conilles es lligaven els oviductes i en aquest segmnt es feia transferència d’embrions bovins o de cabrids. L’oviducte de la conilla ens servia per donar-li als embrions un ambient uterí. A partir d’aquí es van donar altres aplicacions com l conservació d’sp en perill extinció. En ZOO’s quan es mor un animal es congelen els òrgans, tb es superovulen les femelles, s’inseminen i recuperen embrions. Que fem amb aquests embrions? Potser arriba un moment en que ja no hi hagi femelles perque s’han mort o que sigui perillós gestar-la. El que es fa es agafar una sp propera i transferir-li els embrions de l’altra. P.ex: transf d’embrions de bissons a vaques, 30 Noelia Carrión 2n parcial TR embrions de Zebu a vaques, Capra pyrenaica a cabra domestica... En la majoria de casos hem d’aplicar immunoterapia per immunosuprimir a la receptora. Les transferència entre animals de dif gènere no ha donat resultats. En altres casos es fan transferències mixtes: es transfereixen embrions de ruc i cavall. Les femelles podien portar dos tipus d’embrions. Tb s’ha usat en petits felins (Lince  gatas).
8.MADURACIÓ OOCITÀRIA IN VITRO Aplicacions: - Obtenir descendència de femelles valuoses sense necessitat d’estimulació hormonal - Obtenir descendència de femelles valuoses que no es poden reproduir o moren - Obtenir descendència de femelles valuoses prepúbers i reduir intervals generacionals - Obtenir elevats nombres d’oòcits per recerca/biotecnologia. **En escorxadors els regalen.
Obtenció d’oòcits: En teixit ovàric d’animals sacrificats fem disgregació. Disgreguem el teixit ovàric per alliberar oòcits que estaran immadurs en VG.
Podem fer una aspiració fol·licular en animals vius: OPU, LOPU. No la estimulem i recuperem fol·licles immadurs.
Volem oòcits que ja hagin iniciat el creixement. Per que madurin de manera eficient, hem de fixarnos en el tamany fol·licular (vaca: 2 -4 mm, porc: 5 mm, cabra: 3 mm). Hi ha sp en que a l’hora de madurar es posen oòcits nus però hi ha oòcits que maduren millor quan es cultiven amb cummulus (COCs).
Procediments: La majoria de procediments de maduració a partir d’oòcits relativament petits requereixen un procés de premaduració. La VG es trenca fàcilment però aquí ens interessa que l’oòcit creixi mantenint-se en VG i quan hagi fet el creixement adient que surti. El que es fa es recuperar els oòcits immadurs, es mantenen en un medi amb inhibidors de la maduració (hipoxantina: inh fosfodiesterasa AMPc, Roscovitina: inh MPF)  evitem que l’oòcit surti de VG. A les 24h els passem en un medi de maduració (medi base, gonadotropines, estradiol...). dp es fa fecundacions in vitro per transferir-los. El temps de maduració depen de l’sp.
Condicions de cultiu: co-cultius de maduració amb cells fol·liculars o microgostes (segons sp). 37, 38, 39º L’eficiencia depèn de la sp.
31 Noelia Carrión 2n parcial TR Problemes observats: sobremaduració: els grànuls corticals migren separant-se de la mb plasmàtica.
blastocits més petits és degut a cavitació temprana. Si caviten a final de dia 3 vol dir que han fet menys cicles cel·lulars, cells més petites...la massa cel interna serà més petita i no s’implantarà bé.
La ICSI millora els resultats. La premaduració dels oòcits en medis amb hipoxantina o roscovitina tb millora els resultats.
Tb s’està provant la transferència de citoplasma. Si tenim un oòcit que sospitem que té un cyt no competent, podem posar-li cyt d’un madur. D’un oòcit madur s’aspira tot el seu contingut citoplasmàtic i el reinjectem a 10 – 12 oòcits immadurs. S’ha provat en humans, bons resultats (malalties mt...) 9.SELECCIÓ DE Z Aplicacions: inseminació artificial amb l’objectiu de seleccionar el sexe de la descendència (citometria). Enriquim aquestes poblacions.
10.SELECCIÓ PREIMPLANTACIONAL D’EMBRIONS Podem deixar embrions qu arribin a 6, 8 cells, blastocit... obtinguts in vitro o in vivo... Fem biopsies.
Fem diagnòstic d’aquestes cells per sexar i augmentar la producció de llet, carn... Hi ha cases comercials que venen embrions sexats de pedigrins determinats que venen de fecundació in vitro.
Augmenta en nª de fec in vitro CLONATGE 1.CLONATGE: MULTIPLICACIÓ D’EMBRIONS Obtenció d’embrions idèntics. 2 estratègies: Aïllament de blastòmers: Són cells embrionaries que donen tot un embrió. Es tranfereixen quan estan a l’estadi de blastocist.
No tots arriben a blastocists, perque un embrió acabi compactant, és important uns bons contactes entre cells. Quan en aquest procediment els mantenim en cultius aïllats, sense ZP, algunes cells poden donar cells ordenades en cadena  probl de compactació.
Els reintroduim en una ZP.
Per a que el procediment sigui eficient, hem de fer mitjos embrions. Si volem partir un embrió en més d’una meitat, baixa l’eficiència. Si agafem un embrió de 8 cells, el separem en dos de 4. Si 32 Noelia Carrión 2n parcial TR agafem un de 16, el separem en 8 i 8. Tb es poden fer quarts d’embrió, p.e d’un embrió de 4 cells aïllar 1, 1, 1 i 1. No dona suficient rendiment perquè compacten segons les divisions que han fet, se’ns farà cells compactades amb 2 cells...
A l’any 1999 es va clonar un primat (Tetra). Agafem un embrió de 8 cells, es treu la ZP, s’obtenen blastomers. Agafem parelles de blastomers i es fiquen en ZP buides  van fer 4 embrions. Es van deixar en cultiu, es deixen fins a mòrula i es transfereix.
S’ha aconseguit obtenir embrions de ratolí, ovella, bovids, cabra, porc, cavalls, primats...
 Eficiència molt baixa Partició embrions: Va bé si els embrions són grossos. No eliminem la ZP, partim l’embrió per la meitat. Tenim un blastocist, localitzem la ICM i amb un bisturí es parteix per ~meitat. Tenim dos mitjos blastocists.
 Eficiència molt baixa Aquests embrions són clons entre ells però no clons d’un adult.
Tenen components nuclears i citoplasmàtics idèntics Aplicacions: En animals, recerca i producció animal (+/-) En humans està legalment prohibit 2.CLONATGE: TRANFERÈNCIA NUCLEAR John Gurdon va començar a desenvolupar la SNT (somatic nuclear transfer). Tenia una varietat de granota alvina, la creuava amb un mascle albí. Recuperava els ous i els anucleava, destruïa el nucli amb radiacions UV. Lo que li quedava li reintroduia un nucli de l’intestí d’un altre granota wild type.
La cel es reprogramava i acabava donant un wild type.
Els anys 90 van fer aquest procediment en ovelles. Naixement de la ovella Dolly  1r mamífer clonat. Van usar SNT. Van partir d’oòcits en estadi de metafase II, treiem els cromosomes per anuclear; els components citoplasmàtics són els que reprogramen la cel. Ens quedem amb un contenidor (cyt). Tenim un cultiu amb cells somàtiques, amb una pipeta aspirem una cell del cultiu i injectem aquesta cell en l’espai perivitelí de l’oòcit anucleat. Es poden transferir cells sompatiques senceres o només el nucli (transferències carioplastes) Requereix sistemes de micromanipulació. Tenyim la cromatina per localitzar-la (llum UV).
Aquest nucli s’ha d’incorporar al cyt de l’oòcit. S’utilitzen polsos elèctric que promouen la fusió de mb. Quan tenim la cel/nucli a l’espai perivitelí la sometem a petits polsos, la mb plasmàtica de l’oòcit i la de la cell es fusionen i el contingut de la cel/nucli somàtica s’incorpora a l’oòcit.
33 Noelia Carrión 2n parcial TR Els polsos elèctric tenen 2 funcions: fusió de mb + estimul per activació de l’oòcit (~fecundació).
L’oòcit funciona com si hagués estat fecundat.
DIAPO 10 Dp de la inducció de la fusió fem un cultiu in vitro i transferència d’embrions a mares adoptives Ovella Dolly: hem de tenir un animal donador (tx donador), ovelles a les que pugui superovular (per obtenir els oòcits, per anuclear).
Hem de tenir femelles receptives per fer-li transferència l’únic que no serà idèntic són els mitocondris.
S’han clonat camelles, gats, ratolins, conills...
Eficiència: En vadelles, l’1,7% d’oòcits reconstruïts seran eficients. L’eficiència per embrió que transfereixo és de 11,5%.
Són taxes baixes d’eficiència.
HMC (Handmade cloning): Tb consisteix en la transferència de nuclis de cells somàtiques però s’intentaevitar eprar l’utillatge de micromanipulació.
Partim d’oòcits. S’elimina la ZP de l’oòcit i sota la lupa localitzen el CP (presuposant que la placa metafàsica està a sota) i amb un bisturí parteixen l’oòcit. Una meitat tindrà cyt i l’altre placa M + CP. Es repeteix amb un altre. En el mig cyt se li fica una gota de fitohematocrinina agafem una cell somàtica d’un cultiu i la posem en contacte amb el mig cyt, ho col·loquem en una cambra de electrofusió.
Causes de la baixa eficiència: - Reprogramació nuclear incomplerta. Els nuclis somàtics es mantenen diferenciats Segons la qualitat de l’oòcit (maduració citoplasmàtica). La transferència nuclear és més eficient si la cel està en fase G0 o G1  sincronitzem els cultius de les cells donadores; i fer transferència de nuclis somàtics en aquest estadi. Si la cel somàtica està en fase S replica DNA; si el col·loquem en un oòcit en M II (MPF manté els nuclis condensats), intenta condensar els cromosomes. Si ho fem en fase G2, dins l’oòcit comença a entrar en divisió, el nucli no es reprograma.
34 Noelia Carrión 2n parcial TR - Manipulació: la reprogramació nuclear és un dels punts clau, no és tan fàcil que s’esborri tota la info del nucli i es torni a reprogramar Activació embrionària: la cel reprogramada dp ha de tornar a funcionar com un embrió normal Problemes dels animals obtinguts per transferència nuclear: - - Elevada mortalitat durant el desenv pre- i post- implantacional i postnatalment: es bloquegen abans de la implantació o moren dp d’aquesta.
Complicacions en el moment del part (LOS: large offspring syndrome): cries de gran pes; molts dels animals clònics són + grans de lo normal. LOS està associada a anomalies d’imprinting.
Alteracions congènites (sospita de reprogramació nuclear incompleta): malformacions Envelliment prematur: no està clar l’anomalia de la longitud telomèrica d’aquests clons.
L’oòcit podria mantenir la llargada dels telòmers! APLICACIONS En animals: - - Recerca bàsica: interessant Multiplicació d’embrions Producció d’animals genèticament modificats (transgènics). Estratègies x fer transgènics: agafar DNA i injectar-lo al pronucli d’un zigot i esperar que s’integri; tenir cells somàtiques en cultiu, quan tinc les cels som transformades agafem els nuclis i fem clonics.
Recuperació animals (clonació intra i interespecífiques): en animals en perill d’extinció. Si no tenim mascles d’una sp és quan es fa intersp. S’usen cels somàtiques d’una sp que es transfereixen a un oòcit d’una altra sp.
En humans: el clonatge reproductiu està legalment prohibit (art 1). “se prohibe la clonació en seres humanos con fines reproductivos”. Podem fer recerca.
- - Obtenció de cells mare embrionàries (clonació terapèutica). Tenim oòcits donants humans, els anucleem. Dins el citoplaste introduïm una cel somàtica i aconseguim tenir un embrió amb contingut genètic = a l’individu de la cel somàtica. Quan arribi a blastocist, el disgreguem i recupero les cells de la ICM. Aquestes cells les fem crèixer un cultiu  cels mare embrionaries. Les CME ens poden donar dif tipus cel·lulars que serien genèticament idèntiques a l’individu donador de la cel somàtica.  teràpia cel·lular.
Algun dia usarem la reproducció per poder reproduir-nos sense fer embrions clònics? Hipòtesi: aplicació transferència nuclear amb finalitats reproductives sense generar individus clonats  35 Noelia Carrión 2n parcial TR CÈL·LULES MARE I REPRODUCCIÓ Cèl·lules mare: cèls no especialitzades q sota condicions fisiològiques o experimentals determinades es poden transformar en cells especialitzades Origen: - embrionaries: derivades de cells de la ICM d’embrions en estadi de blastocist. Tb de blastòmers d’estadis inicials.
- Adultes: cels indiferenciades q es troben entre les cells diferenciades de tx específics (p.e moll os) - Pluripotents induïdes (iPS): derivades a partir de cells somàtiques mitjançant inducció de l’expressió de factors de pluripotència (reprogramació) Potencialitat: - Totipotents: poden donar lloc a tot un organisme i donar tx extra – embrionaris. Blastòmers aïllats - Pluripotents: poden donar lloc a tots els tipus cel·lulars d’un organisme. Cels de la ICM i iPS - Multipotents (unipotents): tan sols poden donar certs tipus cels. Adultes.
1. CÈLLS MARE EMBRIONÀRIES (ESC) ESC ratolí als 80s, ESC humà als 90s Estratègies d’obtenció: - Procediment clàssic: partir de blastocist. En aquest estadi em d’aïllar la ICM, disgregant el blastocist, per microcirurgia, aspiració...Un cop aïllades es fan créixer en suports.
- A partir de blastòmers aïllats: tb obté embrions x fecundació. Per sistemes de biòpsia, aspirem un blastomer i el deixem en cultiu. Aconseguim tenir línies de cells mare. La resta de l’embrió es deixa en cultiu fins que arribi a blastocist. Podria generar cels mare d’aquell embrió que transferim (teràpia al que neix)  no en humans - A partir d’embrions obtinguts x transferència nuclear: li traiem el nucli a l’oòcit, li transferim el nucli d’una somàtica. Deixem que es reprogrami i quan arribi a blastòcit disgreguem la ICM i intentar obtenir cels mare obtingudes x transferència embrionaria  no en humans Punts importants: 36 Noelia Carrión 2n parcial TR Obtenció: Font d’embrions. La majoria de línies s’han obtingut a partir del procediment clàssic (de ICM). Majoria ESC humanes deriven d’embrions donats de cicles de TRAs (Supernumeraris/Criopreservats). P.e recerca en embrions que tenen mutacions.
Cultiu: Expansió (passes) amb control estricte per mantenir la pluripotencialitat. Medis de cultiu definits, sense presència xenobiòtics (si són humans no han de tenir presència de sèrum animal)...
Caracterizació pluripotència: Morfologia cel·lular, marcadors pluripotència (Nanog, Sox2, OCT4), perfils expressió gènica, formació teratomes (cells que es fan tumors), formació quimeres (barregem embrions, veiem un embrió amb dif linies cel·lulars ?¿?¿?¿?) Plasticitat: Demostrar capacitat per obtenir diferents tipus cel·lulars.
Diferenciació: Obtenir diferenciació dirigida (no espotània), homogènia, permanent (no reversible).
Hem de demostrar que aquesta dif està dirigida, que és homogenia i que es permanent (no reversible) Les cels mare en cultiu, si no controlem les seves condicions, acaben diferenciant-se elles soles Funcionalitat: Demostrar expressió i fenotip L’eficiència d’establiment de línies de ESC és molt baixa. Encara més quan partim d’embrions que es donen x recerca pq fa molts anys que estan congelats; és baixa pq fa anys, les tècniques de congelació eren menys eficients que ara.
Qüestions de seguretat Mantenir estabilitat genètica de les cels. Assegurar la no introducció de mut lesives Assegurar diferenciació homogènia i permanent (no reversible, si la cel es desdiferencia donarà tumors) Mantenir les línies cel·lulars en estat lliure de patògens (no usar feeder – layers, condicions cultiu, sense contacte amb productes origen animal...) *feeder layers: bases cel·lulars Aplicacions Recerca: bàsica. Models de malalties humanes Futur: teràpia cel·lular Banc i registres Es depositen linies de les cel mare. S’usen per recerca. P.e hPSCreg (human pluripotent stem cell registry. Internacional), CMR [B] (stem cell bank of barcelona), Instituto de salud Carlos III.
Aplicacions 37 Noelia Carrión 2n parcial TR Recerca: bàsica. Models malalties humanes Futur: teràpia cel·lular. I en reproducció?  obtenció d’embrions a partir de ICM. Obtenim gàmetes a partir de ICM (gàmetes artificials). El probl es que les marques d’imprinting s’han d’imposar i esborrar correctament. S’han fet experiments en ratolins que han donat bons resultats.
2. CELLS MARE ADULTES 60s: cèls mare en medul·la òssia (hematopoètiques). Teràpia hematològica Identificades en dif tx: cervell, sang perifèrica, esquelètic, pell, fetge, gonadal (sobretot a testicle)...
Funció biològica: mantenir i reparar tx en els que es troben. Quiescents, s’activen en condicions de dany o compromís Obtenció: Excepte en alguns tx, la majoria són difícils d’aïllar i identificar. Nombre reduït. En àrees específiques.
Caracterizació multipotència: Morfologia cel·lular, marcadors Mantenimient: Dificultats de cultiu i expansió “in vitro”. No es fàcil mantenir cels que estan prediferenciades. En alguns casos no passen per un cultiu, es transplanten directament dp de extreure Plasticitat: Demostrar capacitat per obtenir diferents tipus cel·lulars.
Diferenciació: Obtenir diferenciació dirigida (no espotània), homogènia, permanent (no reversible).
Hematopoètiques: eritròcits, limfòcits B, limfòcits T, neutròfils, basòfils... Mesenquimàtiques: osteòcits, condròcits, adipòcits… Neuronals: neurones, astròcits, oligodendròcits Transdiferenciació: Obtenir tipus cel·lulars diferents del teixit del que deriven (si és que cal, depenent de l’ús que es preveu). Es consideraven amb capacitat de transdiferenciació molt limitada. Però és limitada. P.e a partir de CMA neuronal s’han aconseguit transd en cels sanguinies, músc esquelètic. M òssia en neurones, astròcits, m esquelètic, cardíac i hepàtiques. En el tx adipós hi ha “moltes” cels mare, estudis interessants sobre la seva transdif. S’obtenen de liposuccions Funcionalitat Seguretat Mantenir estabilitat genètica de les cèl·lules. Assegurar la no introducció de mutacions lesives.
Diferenciació homogènia, permanent (no reversible).
Mantenir les línies cel·lulars en estat lliure de patògens (condicions cultiu...) 38 Noelia Carrión 2n parcial TR Memòria epigenètica, origen cel·lular Aplicacions Teràpia cel·lular (precursors hematop., sense transdiferenciar) Recerca: Bàsica Futur: Més opcions de teràpia cel·lular. En reproducció es treballa amb cultiu de tx testicular (espermatogonis  Z) 3. INDUCCIÓ PLURIPOTÈNCIA Induïm la pluripot en cels que ja estan diferenciades. És la mateixa idea que usem quan fem transferència nuclear.
Obtenció: a) Fusió de cels somàtiques amb ESC Poder els components citoplasmàtics de la ES cell poden fer que la cel que està dif és desdiferencii.
Tindrem una cel hibrida amb el contingut genètic de les dos cels. Serà 4n.
b) Exposició de cels somàtiques a extractes cel·lulars d’oòcits/ESC Les cels s’exposaven a extractes citoplasmàtics de cels mare o oòcits. Aconseguien tenir embrionic stem-like cell c) Inducció de l’expressió de factors de pluripotencia en cels somàtiques diferenciades Expressió de FT. iPS (induced pluripotent stem cells) Yamanaka: agafava fibroblasts i feia transfecció amb 4 FT (Oc4, Sox2, Klf4, c-Myc). Quan obtenia cels adultes que expressaven aquests FT, es tornaven pluripotents.
Mateix protocol que ESC: obtenció, cultiu, caracterització, manteniment, plasticitat, diferenciació, funcionalitat Per teràpia, ens agafarien cels meves, diferenciar-les a les que ens interessi i tranferir-les. Idònia.
Tb es tenen registres. No cal tenir embrions portadors de malalties, tenim individus per agafar mostres (hiPSC).
39 Noelia Carrión 2n parcial TR Són iguals les iPS que les ESC? Canvis morfològics: les colonies de les ESC són arrodonides, els bordes són + refringents... tb són diferent a nivell de transcripció, les iPS tenen una certa memòria d’on venen (epigenètica), pot de diferenciació no tan gran en les iPS Seguretat Sistemes de reprogramació segurs. Mantenir estabilitat genètica de les cèl·lules. Assegurar la no introducció de mutacions lesives.
Diferenciació homogènia, permanent (no reversible).
Mantenir les línies cel·lulars en estat lliure de patògens (condicions cultiu...) Memòria epigenètica, origen cel·lular.
Aplicacions Recerca bàsica, teràpia cel, reproducció (potser. FibroblastZ) El punt més !! és que es faci la meiosi com toca Estudis: a partir de fibroblast s’ha originat sperm like i oocyt like 40 ...