Tema 4 Cromatografía Líquida (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 21
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 4 Cromatografía líquida (LC) Existen diversas técnicas para estudiar las proteínas. Por un lado, tenemos las técnicas espectroscópicas (que ya hemos ido comentando) que analizan las propiedades fundamentales de la proteína (espectrofotometría, espectrofluorescencia, dicroísmo circular, RMN, …). Por otro lado, encontramos técnicas que permiten separar proteínas que se encuentran juntas en una misma solución, como la cromatografía, la electroforesis y la espectrometría de masas.
Como ya se ha dicho, cromatografía permite separar compuestos (por ejemplo, de una muestra clínica).
Se utiliza para el análisis de proteínas, de metabolitos, … por lo que constituye una ayuda analítica.
También es empleada de forma preparativa para purificar proteínas.
Principios básicos de la cromatografía Se trata de una técnica para separar compuestos en base a su movilidad a través de una fase estacionaria. Los compuestos se encuentran disueltos y son movidos mediantes una fase móvil. Debe existir un contacto entre las dos fases, la fija (estacionaria) y la móvil. Las moléculas de la muestra (analitos) se separan en función de cómo interaccionen con la fase estacionaria.
Existen varios tipos de cromatografía: - En papel - se trata de la cromatografía más simple y primitiva. La fase estacionaria es un papel de filtro y la fase móvil es el solvente que arrastra los analitos (componentes de interés de la muestra). La muestra (pequeñas gotas de la solución) se deposita en un extremo del papel de filtro. El disolvente (fase móvil) hace ascender la muestra por capilaridad.
- En capa fina (thin layer cromatography) Esta capa fina o thin layer es una placa de silicio (sílice o dióxido de silicio) muy polar, que constituye la fase estacionaria. Normalmente, el solvente es apolar - la fase móvil es un solvente orgánico que arrastra por capilaridad. Los compuestos son desplazados por la placa de silicio en función de su polaridad: los más polares quedan en la parte inferior de la placa ya que se enganchan a ella (quedan retenidos y no se desplazan), mientras que los apolares se desplazan hacia la parte superior de la placa.
1 Cromatografía líquida - Cromatografía de gases (GC) Este tipo de cromatografía se emplea para separar y analizar compuestos volátiles. La fase estacionaria es una columna por la cual va pasando la fase móvil, que es un gas. El gas arrastra los analitos por la columna y, en función de cómo interaccionen con ella, saldrán antes o después. Al final de la columna hay un detector que registra las sustancias que van saliendo.
No puede emplearse con proteínas, ya que ni proteínas ni péptidos no son volátiles.
- Cromatografía líquida La fase móvil es un solvente y la fase estacionaria es una columna.
Los analitos avanzan impulsados por el solvente por la columna y, en función de la interacción de los analitos con ésta, tardarán más o menos tiempo en salir - las sustancias que tengan un mayor grado de interacción con la columna serán las últimas en salir (y pueden necesitar para ello un cambio en las condiciones).
La fase estacionaria está organizada en forma de partículas esféricas: perlas o beads, que favorecen el flujo de la fase móvil a través de ellas. Hay diferentes tipos de beads que ofrecen distintos tipos de interacción (hay veces que, por ejemplo, solo la superficie interacciona con la partícula).
Componentes básicos de la cromatografía en fase líquida - Columna (fase estacionaria), compuesta, como ya se ha dicho, por las beads o partículas.
- Solvente (fase móvil) - Bomba: impulsa la fase móvil hacia la columna. Puede ser más o menos sofisticada ya que puede emplearse desde una jeringa, una bomba o hasta la gravedad.
- Detector: se encuentra al final de la columna. Permite conocer el orden en el que salen de ésta los diferentes analitos, ya que los va detectando a medida que salen. Puede ser un escpectrofotómetro (que detecte la absorbancia), un detector de fluorescencia, un detector de masas, un detector electroquímico 2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV (que da señal siempre que pase una molécula que se puede reducir a un potencial redox concreto), … o incluso puede no haber detector.
La señal que genera el detector se envía a un ordenador que elabora un cromatograma: se trata de una gráfica en la que aparecen, en función del tiempo, las señales captadas por el detector (cada sustancia que sale de la columna da un pico).
En función del tipo de bomba, del tamaño de las beads (tipo de columna), de la presión con la que trabajemos y del flujo, encontramos diferentes tipos de cromatografía líquida.
La FLPC -Fast Performance liquid cromatography- se realiza a baja presión (cercan a la atmosférica), con flujos relativamente elevados. Las partículas de la columna son relativamente grandes (generalmente se trabaja a 90µm). No tienen una gran resolución, pero permiten trabajar con grandes cantidades de muestra ya que se usan flujos altos.
Se usa por ejemplo, como cromatografía preparativa antes de purificar proteínas.
Cuando reducimos el tamaño de la partícula, ganamos resolución (podemos separar analitos con menor diferencia en tamaño - hay más superficie de fase estacionaria respecto al volumen de fase móvil) pero oponemos más resistencia al paso del líquido (quedan menos huecos vacíos en la columna) - es necesario que la bomba envíe la fase móvil con una mayor presión.
3 Cromatografía líquida HPLC -High Performance Liquid Cromatography- el tamaño de las partículas es menor, por lo que es necesaria una mayor presión. Normalmente, respecto a la FPLC se reducen los flujos y se aumenta la presión. Los flujos se reducen ya que, una de las formas de aumentar la presión es disminuyendo el tamaño de la columna.
UPLC -Ultra Performance Liquid Cromatography. Para desarrollar este tipo de cromatografía, se logró reducir aún más el tamaño de la partícula. Fue necesaria una presión mucho más elevada para hacer pasar el líquido a través de la columna.
nanoLC La última evolución de la técnica consistió en trabajar con flujos mucho más bajos (como sustitución a trabajar con altas presiones) para poder emplear partículas muy pequeñas.
En la siguiente imagen podemos ver los distintos aparatos utilizados para los tipos de cromatografía.
Cada aparato está diseñado para soportar las distintas presiones a las que se someten las nuestros. Los que soportan alta presión son metálicos y más compactos.
Como ya se ha comentado, existe una relación inversamente proporcional entre tamaño de partícula y resolución de la columna: cuanto más disminuya el diámetro de la partícula, mayor resolución obtendremos. En una resolución mayor, obtenemos los picos del cromatograma más estrechos: esto quiere decir que tenemos una mayor capacidad de separar sustancias (hemos podido separar sustancias que presentan pequeñas diferencias en cuanto al tamaño).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV A medida que disminuimos el diámetro de la partícula, aumenta la relación superficie-volumen. Los analitos interaccionan con la superficie de la fase estacionaria, por lo que, cuanto mayor sea la relación superficie/volumen de la partícula, podrá haber un mayor grado de interacción (es mayor la superficie con la que los analitos pueden interactuar).
El diagrama de Van Deemter o Van Deemter plot muestra la relación entre la resolución y el flujo que pasa a través de columna. En realidad se representa el inverso de la resolución - plate height.
Podemos ver que hay un flujo en el cual la resolución es óptima, pero al aumentar o disminuir el flujo disminuye la resolución.
Cuando más pequeñas son las partículas se disminuye el efecto Van Deemter , por lo que podemos trabajar con flujos más elevados sin perder resolución.
Con los años, se han ido desarrollando columnas y sistemas de cromatografía que permiten trabajar con partículas de tamaños cada vez menores. Las tecnologías que se aplican han ido mejorando y permiten aumentar la resolución.
En la siguiente imagen podemos comprobar cómo un tamaño de partícula menor permite realizar la misma separación en menos tiempo.
La primera cromatografía ha empleado partículas de 3,5µm y ha tardado 20 minutos en realizar la separación. El segundo tipo emplea partículas de 2,5µm y tarda 10 minutos (en obtener el mismo cromatograma que en la primera cromatografía). La última cromatografía, realizada con UPLC, emplea partículas de 1,7µm y tan tolo tarda 2,1 minutos en obtener la misma separación.
En un laboratorio que procese muchas muestras al día, como un laboratorio analítico, el ahorro de tiempo es muy relevante (además de suponer también un ahorro de dinero).
5 Cromatografía líquida Además de menos tiempo para la misma separación, también se ha conseguido obtener el mismo resultado con una menor cantidad de muestra.
Aparte del tamaño de la partícula, el diámetro de la columna es otro elemento muy importante a tener en cuenta. En UPLC y HPLC hay varios diámetros estándar de columna (diámetro de 4,6mm, 2mm, 9mm, 0,5 mm).
Se considera que, cuando se disminuye a la mitad el diámetro de la columna se multiplica por cuatro la sensibilidad - por tanto, se necesitaría cuatro veces más muestra o reducir a la mitad el diámetro de la columna para obtener la misma sensibilidad. Así es como se ha conseguido obtener el mismo resultado con una menor cantidad de muestra.
Algunos parámetros de la cromatografía líquida Resolución Cuanta más resolución tenga la columna, más analitos tiene capacidad de separar. Se define como la distancia entre los puntos máximos de los picos comparada con la media de la anchura de las bases de los picos.
En la siguiente gráfica tenemos dos picos, que se corresponden con dos analitos - a partir de los datos (altura y anchura de los picos) puede calcularse la resolución aplicando la fórmula que se muestra en la gráfica.
Si el valor de R es 1, podemos llegar a considerar que el grado de pureza de cada pico es del 98% (en el pico A hay un 98% de A y un 2% de B, mientras que en el pico B hay un 98% de B y un 2% de A).
Si la resolución supera el 1,5, podemos considerar que la pureza es del 100%.
Hay que tener especial cuidado ya que un mismo pico puede tener dos compuestos que co-eluyen.
La resolución depende de otros dos parámetros: la eficiencia y la selectividad.
Eficiencia: habilidad de la columna para eluir picos estrechos y simétricos.
Selectividad: grado de separación entre los picos.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Cuando los compuestos A y B presentan picos muy separados podemos decir que la columna es muy selectiva ya que ha podido separar muy bien los compuestos.
Si los picos son estrechos, la columna tiene alta eficiencia.
Concepto de Platos teóricos Se trata de una forma de medir la resolución de la columna, es decir, para decir si la columna es buena o mala. Cuantos más platos teóricos tenga la columna, mayor resolución.
Se consideró que la columna estaba dividida en compartimentos (platos teóricos) - cada compartimento es el mínimo necesario para que se produzca un equilibrio entre el metabolito/analito unido a la fase estacionaria y el metabolito libre (no es importante conocer esta definición). En realidad no se produce este fenómeno, pero el término de plato teórico se adoptó como una medida de la resolución - se utiliza para comparar la resolución de diferentes columnas.
Capacidad Se trata de la cantidad de sustancia que la columna puede unir. Es un parámetro que depende de la columna y de la sustancia en concreto.
A la hora de cargar la columna es mejor no llegar al límite de su capacidad. En todo caso, si la capacidad se supera, llegamos a la saturación de las partículas - la columna no separará bien (habrá moléculas que, independientemente de sus características y su capacidad de unión a la columna no podrán unirse por estar ésta saturada).
Además, cuando se considera el flujo al que está operando la columna obtenemos el parámetro de capacidad dinámica, que estudia cómo varía la capacidad en función del flujo.
7 Cromatografía líquida Factor de capacidad o factor de retención (Factor K del analito) Indica la proporción de soluto entre la fase móvil y estacionaria dentro del sistema cromatográfico (en condiciones isocráticas). Puede ser utilizado para comparar el comportamiento de un compuesto en dos sistemas cromatográficos diferentes.
No es necesario conocer el significado de este parámetro, basta con saber que es diferente de la capacidad.
Capacidad de picos (peak capacity) Es otra manera de medir la resolución de la columna. Se define como la cantidad de picos que pueden separarse en un cromatograma (entre el punto muerto y el último pico). Está relacionado con los platos teóricos, pero se calcula de diferente manera.
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Gel filtración (Gel permeation cromatography) Este tipo de cromatografía separa los compuestos en función del tamaño. Los granos o beads están formados por algún soporte de tipo poroso que deja poros de distinto tamaño a través de los cuales avanzan los analitos que se mueven por la columna.
Primero salen las moléculas grandes (de mayor peso molecular), ya que las pequeñas quedan retenidas por los recovecos que dejan las beads en la columna y tardan más en salir.
Una característica de las columnas de gel filtración es que tienen un rango de exclusión o un rango de fraccionamiento - se trata del rango de pesos moleculares que pueden discriminar (es decir, rango de pesos moleculares a lo lardo del cual podemos separar).
Si por ejemplo tenemos una columna con un rango de exclusión de 10000 a 75000 Daltons, todas las moléculas más grandes de 75000 pasarán por fuera de las partículas. Por otro lado, el tamaño de poro más pequeño de nuestra columna permite el paso de moléculas menores de 10000 Daltons, por lo que las moléculas más pequeñas pasarán por todos los agujeros.
El volumen vacío de la columna es aquel volumen en el que salen todas las moléculas mayores del máximo del rango de exclusión, en este caso, mayores de 75000. Es decir, es el volumen que queda fuera de las partículas o beads.
El volumen total es todo el volumen de la columna. Las moléculas menores del mínimo del rango de exclusión (en este caso las menores de 10000D) saldrán juntas como parte del volumen total.
Por último tenemos el volumen de fraccionamiento, que es el volumen que queda en el interior de las beads.
En la imagen podemos ver que, as moléculas más grandes no entran por los poros, por lo que salen antes de la columna (salen con el volumen vacío, que son los huecos que quedan en as partículas).
Las moléculas de tamaño medio (amarillas y rojas) que entran dentro del rango de exclusión, se quedan atrapadas en los poros (aunque no en los poros de menor tamaño). Las moléculas de tamaño intermedio son las que realmente se separan.
Las moléculas de menor tamaño (negras) entran por todos los poros, por lo que se quedan atrapadas más tiempo  son las últimas en salir de la columna.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Para hacer cromatografía de gel filtración necesitamos dos componentes, que pueden adquirirse por separado: la columna y la resina, que son las beads (si se compra todo montado cuesta más dinero).
Podemos encontrar distintos tipos de resina, que se diferencian en el tamaño de las beads (diámtero) y en el rango de exclusión.
Por ejemplo, como podemos ver en la imagen, para separar péptidos hace falta un rango de exclusión bajo.
También podemos encontrar diferencias respecto a la composición. Por lo general, las beads están hechas de agarosa. A veces no conocemos su composición, tan solo un nombre que le dan los fabricantes: la sefarosa (Sefarose) es muy común.
Aplicaciones de la cromatografía de gel filtración - Separación de proteínas Resulta útil por ejemplo, a la hora de purificar proteínas.
- Calcular el peso molecular de una proteína o de un complejo molecular en condiciones nativas El Western Blot es una técnica que permite calcular muy bien el peso molecular de las proteínas. El principal problema es que se trata de una electroforesis desnaturalizante, por lo que no podemos conocer el peso molecular de complejos proteicos.
En cambio, las condiciones en las que se realiza la cromatografía de gel filtración son más suaves y con esta técnica podemos conocer el peso molecular de la proteína según cómo se mueva por la columna.
También podemos saber si nuestra proteína se encuentra formando dímeros, oligómeros, … esto ocurre cuando la proteína se comporta como si tuviera un peso molecular mayor del que realmente tiene. Para saber que esto ocurre, debemos conocer el peso molecular de la proteína en cuestión.
La relación entre el volumen en el que sale la proteína y su peso molecular es una relación logarítmica.
- Eliminar compuestos de bajo peso molecular Esta aplicación de la cromatografía del gel filtración se presenta como una alternativa a la diálisis. La diálisis se emplea para separar compuestos grandes de pequeños (como por ejemplo, para separar proteínas de sal), pero se trata de un proceso pasivo, por lo que es muy lento.
La cromatografía permite obtener el mismo resultado de forma mucho más rápido.
9 Cromatografía líquida Cromatografía de intercambio iónico (IEX) En esto tipo de cromatografía las moléculas son separadas en función de su carga. Tenemos una matriz (fase estacionaria) que puede estar cargada positiva o negativamente, con la que interaccionan los analitos en mayor o menor grado en función de su carga. Si las beads están cargadas positivamente, con ellas interaccionarán las moléculas con carga negativa - cuanto mayor sea su carga, más interaccionarán y saldrán más tarde de la columna.
La eliminación de los analitos se consigue variando las condiciones de la fase móvil: Tenemos una fase estacionaria cargada positivamente, a la que se quedan enganchadas las moléculas cargadas negativamente. Para desengancharlas, cambiamos las condiciones, por ejemplo, aumentamos la cantidad de sal de la fase móvil. Las sales tienen carga, por lo que competirán con los analitos por unirse a la fase estacionaria. Si vamos aumentando la cantidad de sales cada vez más, llegará un momento en que todos los analitos se desenganchen de la columna.
En la gráfica podemos ver, representado en rojo, la concentración de NaCl de la fase móvil. Al inicio, empezamos con una concentración de sales baja y la vamos aumentando poco a poco.
En azul vemos la señal que van dejando los diferentes analitos al salir de la columna. Cuando la concentración de NaCl es baja, prácticamente todos los analitos quedan enganchados a la columna. Los analitos van saliendo conforme aumenta la concentración de NaCl.
Al cambio de composición de la fase móvil se le llama gradiente.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Normalmente, la cromatografía de intercambio iónico requiere de varios pasos: - Fase de equilibrado - consiste en establecer las condiciones de la fase móvil.
- La muestra se pone en la columna.
- Se hace un lavado en las mismas condiciones de fase móvil que en el equilibrado (es decir, aún no se deben variar las condiciones), para que caigan los analitos que no se han enganchado a la fase estacionaria desde el inicio.
- Elución - vamos aumentando la concentración de NaCl de la fase móvil para que vayan saliendo de la columna los metabolitos que se habían quedado enganchados.
- Regeneración - la columna se intenta recuperar para su uso posterior.
Cuando llevamos a cabo este tipo de cromatografía en la que cambiamos la composición de la fase móvil, podemos jugar con la pendiente del gradiente. Las condiciones pueden cambiarse de manera más rápida o más lenta variando así la capacidad de separación de la columna.
La carga de las proteínas está condicionada por la naturaleza química de sus aminoácidos - ácidos o básicos. A pesar de ello, una proteína no siempre tendrá la misma carga, ya que ésta dependerá del pH en el que se encuentre.
Tanto grupos ácidos como grupos básicos pueden encontrarse protonados o deprotonados. Los grupos ácidos tendrán carga negativa cuando se encuentren deprotonados (cuando están protonados no tienen carga). En cambio, los grupos básicos tendrán carga positiva cuando se encuentran protonados.
Por tanto, en función de la concentración de protones del medio (pH) encontraremos las proteínas en unas u otras formas.
A pH ácido, encontramos muchos protones en el medio, por lo que tanto aminoácidos básicos como aminoácidos ácidos se encontrarán protonados. Esto implica que la carga neta de la proteína tenderá a ser positiva, ya que los aminoácidos ácidos protonados no tienen carga y los básicos protonados presentan carga positiva.
A pH básico, encontramos una baja concentración de protones en el medio, por lo que los aminoácidos estarán deprotonados. Esto implica una tendencia a la carga neta negativa ya que: los aminoácidos ácidos deprotonados tienen carga negativa y los aa básicos deprotonados no tienen carga.
11 Cromatografía líquida Por tanto, a pH ácido las proteínas tienden a tener carga positiva, mientras que a un pH básico, las proteínas tienen tendencia a tener carga negativa.
Si representamos en una gráfica la carga de la proteína en función del pH, vemos que cada proteína presenta una curva diferente. El punto isoeléctrico es aquel pH al cual la proteína no tiene carga.
Todas las proteínas tienen el mismo tipo de curva pero varía el punto isoeléctrico (es decir, la curva de una proteína está desplazada a lo largo del eje de las X respecto a la curva de otras proteínas).
En principio, como necesitamos separar en función de la carga, debemos asegurarnos de que trabajamos a un pH en el que la proteína tenga carga, por lo que es mejor trabajar lejos del punto isoeléctrico (si la proteína no tiene carga, no se enganchará a la columna).
Los intercambiadores iónicos (fase estacionaria) pueden clasificarse en función de su carga: - Aniónicos - tienen carga positiva por lo que unen aniones.
- Catiónicos - tienen carga negativa y, por tanto, unen cationes.
Por lo que, en función de la naturaleza de las proteínas que queramos separar, habrá que usar unos u otros.
El soporte más común para la fase estacionaria es la agarosa, sobre la cual se enganchan los grupos funcionales que aportan la carga (hay muchos tipos de grupos funcionales).
Normalmente, la agarosa se emplea para beads más grandes. Para emplear partículas más pequeñas hay que buscar otras matrices.
Para eluir, como ya hemos dicho, los más común es aumentar la concentración de sal (para que compita con las moléculas para unirse a las beads), pero hay otras formas. También se puede cambiar el pH de la fase móvil. Como cada proteína tiene un punto isoeléctrico diferente, se irán desenganchando cuando el pH iguale a sus respectivos P.I. Basta con comenzar a un pH al que todas las proteínas que queramos separar tengan carga e ir cambiando el pH para que las proteínas se vayan eluyendo.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Este tipo de cromatografía, variante de la cromatografía de intercambio iónico, es conocida como cromatoenfoque o cromatofocusing.
Esta técnica presenta un problema: muchas proteínas tienen poca solubilidad en su punto isoeléctrico ya que, el hecho de no tener carga neta hace que sean menos polares. Por tanto, las proteínas pueden precipitar. Es por esto por lo que el cromatoenfoque apenas se usa y, si se utiliza es para cosas muy concretas, con grandes cambios de pH, como la purificación de inmunoglobulinas.
Otra variante de la cromatografía de intercambio iónico se hace empleando como fase estacionaria la hidroxiapatita. Se trata de un material cristalino compuesto por calcio, fosfato e hidroxilo (Ca10(PO4)6(OH)2). En una mezcla de grupos con diferente carga: el calcio tiene carga positiva y el fosfato tiene carga negativa (la carga del grupo hidroxilo no es relevante). Por tanto, tenemos un intercambiador con los dos tipos de carga.
Los grupos ácidos de las proteínas interaccionarán con el calcio y los grupos básicos interaccionarán con el fosfato. Como cada proteína tiene diferente composición en lo que respecta a la carga (aunque todas tienen zonas con carga positiva y zonas con carga negativa), cada proteína interaccionará de manera diferente con la hidroxiapatita debido a su conformación en 3D y a la distribución de las cargas.
Para eluir, se incremente la concentración de NaPO4 en el solvente.
Por lo general, este método se emplea cuando no se encuentra otra forma de separar dos proteínas.
Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) La interacción entre la fase estacionaria y los analitos se hace a través de grupos hidrofóbicos mediante interacciones hidrofóbicas.
Al contrario que en la cromatografía de intercambio iónico, la unión de los analitos a la columna se acostumbra a hacer a una elevada concentración de sal y la elución se produce cuando disminuimos esta concentración.
13 Cromatografía líquida Esta cromatografía se basa en el fenómeno del efecto "salting-in" (o efecto caotrópico) y del efecto "salting-out" de las sales.
Normalmente, en la superficie de la proteína acostumbran a predominar los grupos polares, aunque, en algún punto suelen aparecer algunas cadenas hidrofóbicas.
Cuando la proteína (o cualquier otro analito) está en solución, el agua solvata la estructura. Es decir, las moléculas de agua se situarán en torno a las zonas polares, formando una cubierta de agua alrededor de la proteína que evita que los grupos hidrofóbicos interaccionen con los grupos hidrofóbicos de otras proteínas vecinas.
Por otro lado, cuando tenemos la proteína en solución, tenemos interacciones polares entre las moléculas.
Si añadimos sales a la solución, éstas afectan a estas interacciones. En primer lugar, las sales secuestran las moléculas de agua, por lo que parte del agua que envuelve a la proteína se va a solvatar a la sal. Así, el agua que solvata las proteínas queda limitada y pueden producirse interacciones hidrofóbicas con las proteínas vecinas. Por lo que, al aumentar la concentración de sal en la fase móvil, se produce el efecto conocido como "salting-out".
Por otro lado, tenemos el efecto caotrópico o "salting-in" que consiste en que las sales se colocan en medio de las interacciones polares (fuerzas de Van der Waals, puentes de H, …) que se han formando entre las proteínas, rompiéndolas.
Cualquier sal que utilicemos provoca los dos efectos.
Estos fenómenos se aplican en la cromatografía: - Cuando hablamos de cromatografía de intercambio iónico, los analitos interaccionan con la fase estacionaria mediante interacciones polares. Estas interacciones se rompen al incrementar la concentración de sal, gracias al efecto caotrópico.
- En el caso de la cromatografía de interacción hidrofóbica, comenzamos con una elevada concentración de sal, que, gracias al efecto salting-out, favorece que los grupos hidrofóbicos interaccionen con los grupos hidrofóbicos de la fase estacionaria. Al disminuir la concentración de sal, el agua solvata las proteínas (o los analitos) que se van despegando.
Cuanta más superficie hidrofóbica tenga la proteína, necesitará una concentración mayor de sal para que desengancharse de la columna, por lo que tardará más tiempo en salir (la cromatografía de interacción hidrofóbica separa en función de la hidrofobicidad de la superficie).
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Todas las sales tienen este doble efecto cuando las ponemos en solución aunque hay sales a las que "se les da mejor" el efecto salting-in y sales a las que "se les da mejor" el efecto salting-out. Hofmeister clasificó los iones en función de su efecto salting-in y de su efecto salting-out (series de Hofmeister).
En función de la técnica que se quiera hacer, se emplearán unos iones u otros.
En la cromatografía hidrofóbica buscamos el efecto salting-out y suele emplearse el sulfato de amonio.
Cromatografía de fase reversa (RPC) Se trata de un tipo de cromatografía que también separa en función de la hidrofobicidad.
La fase estacionaria tiene cadenas hidrocarbonatadas de mayor o menor longitud. Por otro lado, en la fase móvil jugamos con solventes orgánicos (como acetonitrilo, metanol, etanol).
15 Cromatografía líquida Partimos de una condición basal en la que la concentración de solvente es baja, a la cual los analitos, péptidos o proteínas interaccionan con la fase estacionaria. Vamos aumentando poco a poco la concentración de solvente de la fase móvil; como se trata de un solvente de naturaleza apolar (orgánico), provocará un desplazamiento por competición de los analitos que estaban enganchados a la fase estacionaria.
Por tanto, se establece lo que llamamos un gradiente de solvente. A medida que añadimos más solvente, vamos eluyendo los analitos: conforme más hidrofóbicos sean éstos, más solvente necesitarán para ser desplazados, por lo que saldrán más tarde de la columna.
En las siguientes gráficas puede verse cómo van saliendo los analitos conforme avanza la cromatografía: Podemos comprobar que, tras el primer lavado, caen de la columna todos los analitos que no se han enganchado (no hidrofóbicos).
La cromatografía de fase reversa es la técnica analítica por excelencia ya que permite obtener la máxima resolución, sobre todo cuando se combina con HPLC (es la técnica que mejor encaja con la HPLC) y también con UPLC y nanoLC. Se trata de la técnica que más se utiliza para análisis de metabolitos y en proteómica.
Al permitir obtener una elevada resolución, en el cromatograma aparecen picos muy estrechos.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Composición de las beads Normalmente se emplean partículas de silicio recubiertas de grupos hidrofóbicos que acostumbran a ser cadenas alifáticas (cadenas de C), que son altamente hidrofóbicas. Pueden tener carga positiva o carga negativa.
Por diversas razones, hay ciertas longitudes de cadenas hidrocarbonatadas que se usan más que otras funcionan mejor. Las más utilizadas son aquellas cadenas de 4, 8 y 18 carbonos (columnas C4, C8 y C18).
Cuanto más larga es la cadena alifática, más hidrofóbica resulta. Por tanto, en función de las moléculas que se quieran separar, se usan unas u otras cadenas.
- Péptidos o moléculas pequeñas  columnas C18.
- Proteínas (moléculas grandes)  columnas C4 o C8.
Podemos encontrar también matrices con beads de poliestireno (de naturaleza hidrofóbica). En este caso, el mismo poliestireno sirve tanto como soporte como grupo funcional hidrofóbico.
Las matrices más comunes son las de silicio.
El soporte de silicio permite hacer beads de menor tamaño (2µm, 3µm e incluso 1,7µm). Es por esto por lo que este tipo de cromatografía va muy bien con alta presión (y funciona tan bien con HPLC, UPLC y nanoLC).
Solventes utilizados En principio se utilizan solventes orgánicos, siendo los más utilizados el metanol, el etanol, el propanol y el acetonitrilo. Los solventes más hidrofóbicos (el más hidrofóbico es el isopropanol) provocan la elución de los compuestos antes que los menos hidrofóbicos (metanol).
El solvente que más se usa para la RPC es el acetonitrilo ya que, como podemos comprobar en la siguiente tabla, es el que menos interfiere en la absorbancia.
17 Cromatografía líquida El problema del acetonitril es que es el solvente más caro (en muchos laboratorios dejó de usarse por este motivo). Como se está consiguiendo, gracias al empleo de beads más pequeños, flujos menores, etc., llevar a cabo la cromatografía con una menor cantidad de solvente cada vez, el uso de este solvente ya no supone un problema económico.
Ion pairing agents o contraiones Se trata de sustancias que se añaden a la fase estacionaria para intentar compensar la carga de los analitos. En la cromatografía de fase reversa nos interesa mantener al mínimo las interacciones polares que pueda haber entre metabolitos y la fase estacionaria.
Todas las proteínas tienen grupos polares y, en función del punto isoeléctrico y de las condiciones en las que hagamos la cromatografía, tendrán más o menos carga y ésta será positiva o negativa.
Por un lado, los contraiones hacen que baje el pH de la solución (hasta 2-3). El pH bajo provoca que protonen los grupos ácidos, haciendo que no presenten carga. Los grupos básicos sí que estarán protonados y, por tanto, presentarán carga positiva.
Por otro lado, los contraiones neutralizan estas cargas positivas que aparecen con el descenso del pH (así como el resto de las cargas positivas que presenten los analitos).
El contraión o agente apareador de iones más común es el ácido trifluoroacético.
Al añadir el trifluoroacético a nuestra solución, provocamos la bajada del pH, haciendo que los grupos ácidos se protonen (no tendrán carga) y que los grupos básicos presenten carga positiva. Además de hacer que baje el pH, este ácido añade cargas negativas a la solución, evitando la formación de interacciones polares.
18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Los contraiones son necesarios ya que, a pesar de que la fase estacionaria es apolar, siempre quedan grupos en la superficie de las beads que son polares. Para evitar la formación de interacciones entre estos grupos y los grupos polares de las proteínas (u otros analitos) se añaden los contraiones, que neutralizan los grupos polares de las proteínas.
El principio de la cromatografía de fase reversa (matriz de fase reversa con cadenas hidrocarbonatadas y elución con un solvente) se puede aplicar a sistemas para limpiar muestras y separar proteínas de sales.
Es decir, no toda la cromatografía se encuentra en columnas.
Un ejemplo de la aplicación de estas técnicas de separación son las ZipTips.
Se trata de puntas de pipeta que llevan resina cromatográfica. Una de las más típicas es la que lleva la resina de la cromatografía de fase reversa que sirve para limpiar pequeñas cantidades de muestra: los péptidos y proteínas quedan enganchados en la resina (que está en el extremo de la punta de la pipeta) - si se limpia con una concentración baja de un solvente orgánico, podemos eliminar los tampones, sales, etc. que contenga nuestra muestra y quedarnos solo con el componente proteico. Si después se aspira acetonitril con la pipeta, las proteínas se soltarán de la resina.
En el mercado hay diversos tipos de Zip Tip disponible, con resinas de diferentes características (distintos número de C, …).
Este tipo de cromatografía recibe este nombre porque, antes de su aplicación existía una técnica similar donde se separaban los analitos en función de su hidrofobicidad pero usando una fase estacionaria hidrofílica y una fase móvil con solventes orgánicos. Como de este tipo de cromatografía se evolucionó a un tipo de cromatografía con fase estacionaria hidrofóbica, se le dio este nombre.
Cromatografía de afinidad Se basa en la afinidad de un analito por un compuesto o producto concreto. En la superficie de una resina cromatográfica tenemos algún tipo de compuesto por el cual tendrá afinidad alguna proteína de interés.
Solo las proteínas/analitos que tengan afinidad por este compuesto quedarán adheridas a la columna.
Se trata de la cromatografía más selectiva.
Como podemos ver en el cromatograma, al lavar salen de la columna gran cantidad de compuestos ya que, en principio, la mayoría de los analitos no se unen a la columna. Cuando se hace una cambio en la composición de la fase móvil (buffer) se desengancha la proteína o analito de interés, apareciendo un pico en el cromatograma.
19 Cromatografía líquida Este cambio puede ser un aumento de la concentración de sal, que cortará todas las interacciones polares (efecto caotrópico), un cambio del pH o añadir el propio sustrato que está adherido a la columna para que el compuesto de interés se una y salga de la columna.
Componentes - Matriz - compuesta por beads, fundamentalmente de agarosa. Debe ser química y físicamente interte (es decir, no debe interaccionar con ninguno de los compuestos de la muestra).
- Ligando: se trata del grupo funcional al que se une (reversiblemente) nuestra proteína de interés.
- Brazo espaciador (spacer arm) - es la estructura química que permite unir el ligando a la matriz .
En función del espaciador, el ligando quedará encarado de un forma o de otra y estará más o menos expuesto.
Partimos del ejemplo de una matriz de agarosa que tiene ADP como ligando. Es posible encontrar o fabricar diferentes tipos de matriz agarosa-ADP, que podrán funcionar de diferente manera. La principal diferencia entre los distintos tipos de columnas agarosa-ADP es el brazo espaciador, que puede ser más largo o más corto. Además, también puede variar el punto de enganche del ADP al brazo espaciador.
Puede ocurrir que para una determinada proteína funcione muy bien un tipo de matriz agarosa-ADP pero no otro. Si pasamos un extracto celular por una columna de agarosa-ADP, no todas las proteínas que tengan afinidad por el ADP se engancharán.
Aparte de comprar las columnas, las columnas de afinidad también pueden fabricarse. Para ello serán necesarios grupos que permitan conjugar reactivos y formar enlaces covalentes para enganchar los ligandos a la columna - active coupling groups. Hay determinados grupos funcionales que se usan bastante para ello. Cuando queremos enganchar una proteína a un soporte o a otra proteína, normalmente lo hacemos mediante el grupo amino o mediante el grupo tiol. Los grupos que reaccionan covalentemente con el grupo amino son el NHS-ester (N-hidroxisuccinimida-ester) y el Imidoester.
20 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Si por ejemplo, queremos enganchar algo a una proteína, como un fluoróforo, basta con comprar un fluoróforo que esté enganchado a uno de estos grupos funcionales. Al poner este fluoróforo en contacto con la proteína, éste reacciona con la proteína que quedará enganchada covalentemente con el fluoróforo.
Por otro lado, también tenemos grupos que forman interacciones con el grupo tiol (que se muestran en la imagen).
Este principio (de emplear grupos funcionales que interaccionen con proteínas) también puede emplearse para la fabricación de columnas de afinidad. Podemos usarlo por ejemplo para enganchar un péptido a una matriz de sefarosa - habrá que adquirir algún tipo de matriz que cuente con estos grupos funcionales en su superficie.
También hay disponibles grupos funcionales que nos permitan enganchar azúcares o ácidos nucleicos (ADP) a las columnas.
Actualmente, podemos encontrar y comprar fácilmente resinas con estos grupos funcionales en su superficie. Para construir la columna, bastará con poner en contacto esta resina con el compuesto que se quiera unir y se formará el enlace covalente.
Utilidades de la cromatografía de afinidad En el estudio de proteínas, este tipo de cromatografía presenta fundamentalmente dos utilidades: - Finalidades preparativas: se trata de un procedimiento que se emplea para la purificación de proteínas, ya que se trata de un método muy selectivo.
- Finalidades funcionales: identificación de proteínas o sustancias que interaccionan con un determinado sustrato.
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