T9, Regulació génica dels eucariotes (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 2º curso
Asignatura Expressió i replicació génica
Año del apunte 2014
Páginas 34
Fecha de subida 10/04/2015 (Actualizado: 10/04/2015)
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TEMA 9 Regulació génica dels eucariotes Posibles niveles de regulación de la expresión génica La regulación de la expresión génica es más compleja en eucariotas.
→ El ADN está empaquetado con proteínas formando la cromatina.
→ La transcripción se produce en el núcleo y la traducción en el citoplasma.
→ Los transcritos son procesados antes de ser transportados al citoplasma.
→ La mayoría de eucariotas son organismos pluricelulares con expresión génica diferencial en cada tipo celular.
→ El número de genes es mayor.
REGULACIÓN EN EUCARIOTAS: TRANSCRIPCIÓN → Control de la transcripción elementos CIS y TRANS → Control en CIS •Promotores secuencias de ADN de 200 pb a 5' del inicio de la transcripción.
*Promotor mínimo: región comprendida entre la caja TATA (-25-30) y el inicio de la transcripción. Determina una transcripción basal *Elementos proximales: Secuencias localizadas entre la caja TATA y -200 pb (o más lejos) y determinan una transcripción eficiente y regulada. Estructura modular. La localización y organización de estos módulos es variable.
•Elementos que actúan con independencia de la distancia: *Intensificadores (enhancers) *Silenciadores Intensificadores y silenciadores: → Pueden localizarse a 5’ o 3’ del gen, o incluso dentro del mismo.
→ Puede invertirse su orientación sin cambiar su efecto.
→ Al moverlos a otra posición del genoma afectan a la expresión de los genes adyacentes.
→ Tienen una estructura modular, con diferentes secuencias cortas de ADN.
→ Regulan la expresión génica específica tisular y temporal.
Muchos genes de eucariotas tiene más sitios de unión reguladores y están controlados por más proteínas que los procariontes.
En estos sitios de unión se agrupan unidades llamadas amplificadores y a un amplificador dado se unen los reguladores que tienen a su cargo la activación del gen en un momento y un lugar dado.
•Como reguladores muy lejos del promotor: acción a distancia el DNA interpuesto sobresale en la forma de un asa para permitir la interacción entre proteínas.
•Dicha activación a distancia: otro problema •Si se une un amplificador, puede haber varios genes al alcance del activador, pero un amplificador dado regula solo un gen Entre amplificadores y promotores hay aisladores o elementos limitantes., que bloquean la activación del promotor por los activadores unidos al amplificador.
Elementos que actúan en TRANS: son proteínas reguladoras que se unen a secuencias de reconocimiento específicas del ADN.
→ Factores de transcripción basales o generales: se unen al promotor mínimo para iniciar la transcripción.
→ Factores de transcripción: proteínas que se pueden unir a secuencias del promotor, activadores y silenciadores afectando a la transcripción.
•El análisis de las proteínas que interaccionan con el DNA ha demostrado la existencia de ciertos motivos estructurales.
- Motivo Hélice-giro-hélice: proteínas homeodominio: caracterizadas por un dominio de 60 aa (homeodominio) que se une a ciertas regiones del DNA. El homeodominio está codificado por una secuencia homeobox. Éste se pliega en 3 hélices α, las últimas 2 se pliegan en : hélice-asa-hélice, característica de los factores de transcripción que se unen al DNA en el surco mayor de la doble hélice. La tercera hélice es la de reconocimiento, donde el aa toma contacto con las bases del DNA (motivo conservado TAAT) El Zn cumple un papel estructural indispensable para la integridad del dominio de fijación al DNA. El DNA es reconocido por una hélice α que se inserta en el surco mayor. Algunas proteínas contienen dos o más dominios de dedos de zinc. Cada dedo inserta una hélice α, con lo que se va extendiendo la zona de reconocimiento del DNA.
- Motivo cremallera de leucina: combina superficies de dimerización y de unión al DNA en una sola unidad estructural. Dos hélices α largas forman como una pinza en el DNA, con cada una insertada en el surco mayor separada por media vuelta.
La dimerización está mediada por una región dentro de estas hélices: forman un segmento corto de hélice superenrollada, donde las dos hélices se mantienen juntas por interacciones hidrofóbicas entre residuos de leucina (u otros aa hidrófobos). Las proteínas con este dominio forman, con frecuencia, heterodímeros.
- Motivo hélice-bucle-hélice.
También una región en hélice α extendida en cada uno de los monómeros se inserta en el surco mayor del DNA. La superficie de dimerización está formada por dos regiones helicoidales: la primera es parte de la misma hélice que interviene en el reconocimiento del DNA, y la otra es más corta. Las dos hélices están separadas por un bucle flexible que les permite acercarse mucho.
Remodelación de la cromatina.
→ Remodelación de la cromatina: cambios en la organización de la cromatina.
→ Para la transcripción de un gen es necesario una estructura de la cromatina abierta (la ARN polimerasa y los activadores deben unirse al ADN) EPIGENÉTICA ¿Qué es la Epigenética? •El estudio de los cambios de expresión de los genes y del fenotipo asociado, que son heredables - durante la mitosis y también en la meiosis, pero que NO implican cambios en la secuencia del DNA.
•Pueden ser permanentes o no.
•Los cambios epigenéticos pueden ser iniciados por factores ambientales, pero permanecen en la célula cuando desaparece el estímulo, pueden ser transmitidos a través de la división celular (por mitosis, a células hijas) (por meiosis, a la siguiente generación).
• ¿Qué es un “Efecto Epigenético? Se da un efecto epigenético cuando dos organismos, o dos células, con la misma secuencia de DNA, presentan fenotipos diferentes •¿A que se deben los “Efectos Epigenéticos? Los principales mecanismos epigenéticos son modificaciones químicas que afectan/cambian la estructura de la cromatina y consecuentemente la transcripción/expresión de genes: 1. metilación de citosinas en dinucleótidos CpG (mamíferos) (normalmente asociado a silenciamiento de expresión) 2. modificaciones químicas de los aminoácidos de las histonas de los nucleosomas (hay modificaciones de histonas asociadas a silenciamiento y otras asociadas a activación) 3. variantes alélicas de las histonas de los nucleosomas.
4. proteínas que se asocian y remodelan la estructura de la cromatina.
5. RNAs no codificantes que se asocian a DNA o a transcritos nacientes Metilación del DNA •5-metilcitosina, del dinucleótido 5’CpG3’ (citosina+fosfato+guanina). La adición es catalizada por una familia de enzimas, las DNA metiltransferasas (DNMTs).
•Recientemente: la metilación también puede ocurrir en no-CpG, predominantemente metilación en CpA en óvulos, en cerebro adulto y en células madre, pero con una frecuencia mucho menos que las CpG.
•La metilación de citosinas normalmente marca represiva, inhibe el inicio de la transcripción: •Previniendo la unión de factores de transcripción.
•Reclutando proteínas de unión a metilos (MBPs).
•Generando en ambiente represivo en la cromatina.
El patrón de metilación se establece durante el desarrollo embrionario y se mantiene en las divisiones celulares. Este mantenimiento permite que un marcador epigenético del genoma sea estable a través de múltiples divisiones celulares: constituye una forma de memoria celular.
DNA metiltransferasas (DNMTs) Las Dnmt1s mantienen la metilación del DNA en CpGs por complementación en zonas hemimetiladas (solo una cadena de DNA) DNMT3B: en estados tempranos del embrión y es la principal enzima responsable de la adquisición de DNA-metil durante la implantación DNMT3A: responsable de establecer el patrón de metilación en los gametos maduros y, también está implicada en el control epigenético de las células madre somáticas postnatales Islas CpG (CGI) y el patrón de metilación del DNA •DNA mamíferos: 70% metilado en regiones CpG de tejidos somáticos.
•No hay preferencias de metilación, todas las secuencias tienen el mismo grado de metilación del dinucleótico CpG, excepto en las islas CpG. Secuencias ricas en CG que NO se encuentran metiladas en las células germinales pero SI en todos los tejidos somáticos.
•Sobre la mitad de CGIs contienen TSS (transcription start sites), ya que coinciden con promotores de genes.
•La otra mitad están dentro o entre unidades de transcripción, conocidas como “huérfanos” CGIs, ya que su significado es incierto Muchos promotoes CGI huérfanos con activos de manera tejido-específica, sugiriendo que son severamente regulados.
•Estas “islas” son excepciones de la metilación global de las CpGs que prevalece en la mayoría de los genomas de mamíferos.
•Además, aproximadamente el 60% de los genes humanos tienen islas CpG en sus promotores (no están metiladas, promotor activo, genes activos).
La “firma” de las CGIs en la cromatina A) Las CGIs normalmente existen en un estado no-metilado, permisivo de la transcripción. Ellas están marcadas por la acetilación de histonas (H3/H4Ac) y la H3K4me3, dirigida por la Cfp1, mostrando un depleción H3K36me2 dependiente de Kdm2a. La unión constitutiva de la RNA PolII contribuye al estado permisivo.
B) La metilación del DNA está asociada con un silenciamiento estable de los promotores CGIs.
Puede ser mediado por las proteínas MBD, que reclutan correpresores asociados a la actividad HDAC; o puede ser debido a una inhibición directa del factor de transcripción de unión al DNA metilado.
Regulación de la expresión génica por la metilación del DNA.
•Los estudios del efecto de la metilación natural del DNA se realizaron gracias al uso de 5azacitidina, inhibía la metilación en células in vivo.
•5-azacitidina es un análogo de nucleótido que se incorpora en la DNA sustituyendo a la citosina, “saca” a las DNA metiltransferasas de la circulación y previene de futuras metilaciones.
• ¿Cómo interfiere la metilación en la expresión? •Mejor posibilidad: la presencia de grupos metilo interfiere con la unión de factores de transcripción que activan la transcripción de un determinado gen.
• Además, hay factores de transcripción que reconocen secuencias ricas en GC que contienen el dinucleótido CpG: son incapaces de unirse al DNA cuando éste está metilado.
Atracción de las proteínas de unión a CpG-metilo •El segundo modo de silenciamiento es opuesto al primero, ya que envuelve proteínas atraídas por las CpG metiladas, no repelidas.
• Se han observado complejos específicos para DNA metilado (MeCPs) en una gran variedad de células de mamíferos. Además, se descubrieron la familia de proteínas de unión a las CpG metiladas, la familia MBD (metilation binding domain) Metilación del DNA, Mutación e Inestabilidad Cromosomal.
•La C se deamina espontáneamente a U (uracil). Esta mutación la reconocen las uracil-DNAglicosidasas que restablecen la C.
•Pero si se deamina la 5-mC se forma T (timina). El problema reside en que la T es una base natural del DNA, por lo que interfiere en la reparación eficiente de la lesión. Como resultado, la T puede persistir en la replicación del DNA y pasar a la progenia como una mutación CT.
•Mutaciones de este tipo parece que son las principales causas de múltiples enfermedades humanas, ya que 1/3 de las mutaciones son en CpGs, por lo que ya no estarán metiladas, el gen será activo (excepto islas CpG, que de normal no están metiladas).
Modificaciones de la cromatina y su mecanismo de acción •Cromatina: DNA+histonas+otras proteínas en el núcleo de las células eucariotas constituyendo el cromosoma. Unidad básica nucleosoma. Entre cada nucleosoma hay un DNA libre, espaciador, que garantiza la flexibilidad de la cromatina. 2 formas de cromatina.
•Heterocromatina: forma muy compactada del DNA, asociada con regiones genómicas silenciadas transcripcionalmente.
•Eucromatina: forma poco compactada del DNA, con regiones genómicas activas transcripcionalmente.
•El término “remodelación de la cromatina” comprende una gran variedad de modificaciones en la estructura de la cromatina, pero puede ser definida como un cambio discernible entre los contactos DNA-histonas. El mecanismo está regulado por procesos epigenéticos: modificaciones covalentes de histonas, metilación del DNA, ncRNAs (miRNAs) y el grupo de proteínas Polycomb.
•Las histonas sufren diferentes modificaciones pos-transcripcionales (HPTMs) Principales modificaciones de histonas Acetilación y deacetilación.
•Se han identificado enzimas de acetilación de histonas (histonas acetiltransferasas, HAT) y, enzimas de des-acetilación de histonas (histonas deacetilasas, HDAC).
•Las HATs se clasifican en 2 clases, basadas en su localización funcional: •HATs tipo A: activas en el núcleo.
•HATs tipo B: activas en el citoplasma. Su función es modificar las histonas sintetizadas de novo antes de su ensamblaje.
•Las HDACs se dividen en 4 clases principales, basado en su homología de secuencia y el patrón de expresión: •Clase I, II y IV deacetilasas dependientes de Zinc.
•Clase III también conocidas como sirtuinas, son deacetilasas dependientes de NAD.
Activadores de unión al DNA reclutan HATs para acetilar las histonas, mientras que los represores reclutan HDACs. Estos cambios producen alteraciones en el nucleosoma, que activan o inhiben la expresión de genes, respectivamente.
•Las HAT pueden acetilar residuos de lisina (K) de las 4 histonas, pero diferentes enzimas tienen afinidad por sustratos diferentes aunque raramente 1 enzima solo tiene 1 “target”.
•Modelos que muestran como las HPTMs afectan a la cromatina: –Modelo 1: HPTMs podrían, de alguna manera, alterar la estructura de la cromatina, como por ejemplo cambios de carga. La neutralización de lisinas cargadas positivamente por la acetilación reduce la fuerza de unión de las histonas con el DNA, con ello se “abren” zonas de unión al DNA.
Además, la acetilación puede descompactar el nucleosoma, consistente con el rol de “abrir” la cromatina para la activación genética.
–Modelo 2: HPTMs podrían inhibir la unión de factores a la cromatina –Modelo 3: HPTMs podrían crear zonas de unión para una proteína en particular.
Fosforilación •Se ha descrito que el incremento en la expresión de genes está correlacionado con la fosforilación de la H3.
•Además, la H3S10 (residuo 10 de la serina de la H3) es una importante zona de fosforilación para la transcripción (desde levaduras hasta humanos). Hay identificadas muchas kinasas que tienen como diana la H3S10, como las Hsk1/2 y las Rsk2 en mamíferos.
•El mecanismo por el cual las histonas se fosforilan no está claro.
•Por otro lado, hay evidencias que soportan los 3 modelos de HPTMs: – – – Modelo 1: las histonas fosforiladas alteran la compactación de la cromatina.
Modelo 2: las proteínas de unión a cromatina pueden ser desplazadas por fosforilación.
Modelo 3: hay una proteína adaptadora que reconoce y se une histonas fosforiladas de promotores de genes inducibles.
Metilación •La metilación (lisinas y argininas) puede regular la transcripción de forma positiva o negativa, dependiendo de la posición del residuo entre las histonas.
•Además, puede haber más de 1 metilación en un residuo: – Lisinas: me1, me2 o me3 – Argininas: me1 o me2 •Hay, por lo menos, 24 regiones identificadas para metilación en lisinas y argininas de la H3, H4, H2A y H2B.
•Esta potente combinación puede ser necesaria para permitir la compleja regulación y el proceso dinámico de la transcripción, el cual requiere eventos secuenciales y específicos.
•Identificación de histonas metiltransferasas (HMTs) y histonas-lisina-metiltransferasas (HKMTs) y sus regiones de modificación de histonas están bien definidas.
Ubiquitinación/de-ubiquitinación •Acetilación, fosforilación y metilación: se añaden pequeños grupos químicos.
•Ubiquitinación (Ub): polipéptidos largos, que pueden incrementar 2/3 el tamaño de la histona.
•La Ub, como la metilación, puede activar o reprimir la transcripción.
– H2A es monoUb, reprime la transcripción, catalizada por el grupo Policomb Mbi1/Rinc1A.
– H2B es monoUb, activa la transcripción. Permite la metilación H3K4. Estos eventos se mantienen conservados desde las levaduras hasta los humanos.
•No se conocen proteínas de unión a histonas Ub.
Regulación post-transcripcional •Procesamiento alternativo del ARNm: permite generardiferentes productos a partir de un único gen. Muy frecuente (30-60% de los genes humanos) •Edición del ARNm → Splicing Alternativo → Poliadenilación Alternativa •Estabilidad del ARNm •MicroRNAs y siRNA •Regulación traduccional y postraduccional RNAi y mi(cro)RNA Silenciamiento de expresión génica por siRNA (small interfering o silencing RNA): el fenómeno de RNA interference (RNAi) o interferencia (en la expresión génica) por dsRNA de origen externo a la célula.
El Premio Nobel en Medicina del año 2006: recayó en los profesores Andrew Z. Fire (Stanford University) y Craig C. Mello (University of Massachussets), por el descubrimiento inicial y estudio posterior del fenómeno denominado RNA interference (RNAi): RNAs de doble cadena (dsRNA) introducidos en células y organismos, suprimen la expresión de genes que tienen homología en su secuencia con una de las hebras del dsRNA introducido (la hebra "antisense", que es complementaria a la secuencia del mRNA del gen).
Su trabajo inicial (publicado en 1998) sobre el fenómeno de RNA interference: Inyectaron RNA correspondiente al gen unc-22, que codifica para una proteína de los filamentos musculares, en las gónadas del nematodo C. elegans. Las mutaciones en unc-22 hacen que los gusanos tengan movimientos convulsivos.
Fire y Mello inyectaron dsRNA y ssRNA antisentido correspondiente al gen mex-3 en las gónadas de C. elegans. El mRNA de mex-3 es abundante tanto en las gónadas como en los embriones de C. elegans. El ssRNA antisentido tenia un efecto muy moderado sobre la abundancia del mRNA de mex-3 endógeno, mientras que el dsRNA provocaba que desaparición completa del mRNA de mex-3.
•El dsRNA inyectado actúa catalíticamente o bien es amplificado, y no actúa mediante una reacción estequiométrica.
•El efecto interferente del dsRNA inyectado se extiende entre células y tejidos, e incluso a la descendencia.
•Fire y Mello predijeron que el mecanismo de RNAi podría ser un mecanismo natural, no solo una respuesta de organismos a dsRNA inyectados artificialmente; los organismos podrían utilizar dsRNA producido por las propias células para efectuar silenciamiento génico de manera fisiológica.
Se ha demostrado posteriormente la existencia de genes miR, que codifican para mi(cro)RNAs, los cuales silencian la expresión de otros genes del mismo organismo El mecanismo básico de silenciamiento (epigenético) génico por RNAi es el mismo en plantas, hongos y animales: •RNAi = RNA interference (RNA interferente o interferencia por RNA): –Moléculas largas de RNA de doble cadena, cuando son introducidas en la célula (por microinyección, transfección, o por virus), inhiben la expresión del gen homólogo endógeno de la célula (gen diana). No se detecta proteína del gen inactivado, ni tampoco mRNA.
•El mecanismo básico implica –1º: procesamiento del dsRNA introducido en el citoplasma de la célula por Dicer, una RNAasa de tipo III, que corta el dsRNA largo en trozos más cortos de 21-25 nts, de los cuales 19-23 están apareados, y en cada extremo 3' de las dos cadenas hay 2 nts que sobresalen, protuberantes. Estos dsRNA cortos generados por Dicer se llaman siRNAs.
–2º: Una de las dos cadenas del siRNA, la cadena guía del siRNA (antisentido o complementaria al gen inactivado), es transferida de Dicer a RISC: RNA-induced silencing complex. Este complejo proteico: mRNA-siRNA. RISC corta entonces el mRNA en dos trozos, en la zona que está apareada con el RNA corto. Los dos fragmentos de mRNA generados son degradados posteriormente por RNasas, al no estar protegidos sus extremos por la estructura de capucha y la cola de poliA.
Significado funcional del RNAi.
1. Protege contra infecciones víricas, de virus de dsRNA, y de la forma replicativa en forma de dsRNA de virus de ssRNA y virus de DNA. Este mecanismo funciona en plantas, gusanos y moscas.
2. Da estabilidad al genoma manteniendo "silenciados" (inmóviles) los transposones.
Mutaciones en los componentes de la maquinaria de RNAi hacen que los transposones se movilicen con mucha más frecuencia.
3. Se cree que el silenciamiento por RNA es un mecanismo de defensa de la integridad del genoma, ya que cerca del 50% del genoma consiste en elementos virales y transposones que han invadido el genoma en el curso de la evolución.
4. Mecanismos similares al de RNAi reprimen expresión de genes endógenos inhibiendo la síntesis ribosomal de proteínas. También los mi(cro)RNA.
5. RNAi es una herramienta experimental para estudiar la función génica y el RNAi podría usarse en terapia génica.
Los complejos Dicer y RISC son esenciales para… 1. La destrucción de RNAs virales invasores.
2. La eliminación de transcritos provenientes de transposones (elementos móviles del DNA integrados en el genoma, DNA) y de DNA repetitivo.
3. El silenciamiento de la expresión génica a nivel post-transcripcional, provocado por los miRNA.
4. El bloqueo de la expresión génica a nivel de transcripción de DNA a mRNA (ver más adelante).
5. La maquinaria de RNAi también es utilizada cuando siRNA se introduce en las células experimentalmente para inhibir la actividad de genes específicos; A partir de los siRNA introducidos la célula puede producir nuevos dsRNA mediante una RNA polimerasa; éstos dsRNA son procesados nuevamente por Dicer para producir siRNA.
La formación de RISC a partir de un RNA dúplex pequeño tipo siRNA. (Drosophyla melanogaster, en otros organismos los componentes son similares).
Amplificación del proceso RNAi por RNA pol dependiente de RNA (RdRps) Muchos virus de RNA producen una RNA dependent RNA polymerase, RdRP, para replicar sus propios genomas. Muchos eucariotas también tienen una RdRP que participa en el proceso de iRNA hace que el proceso de RNAi se auto-amplifique: RdRps usa una cadena sencilla de siRNA como "primer y como molde un mRNA diana entero, o bien dsRNA desenrollado (por una RNA helicasa), para forma nuevos dsRNA llamados dsRNA secundarios son procesados a su vez por DICER siRNAs secundarios.
Los siRNAs secundarios pueden guiar el complejo RISC: (1) al mismo mRNA que los siRNAs primarios; (2) a un mRNA que proviene del mismo gen diana primario, pero que contiene distintos exones (splicing alternativo) (3) a mRNA de genes que no son diana de los siRNAs primarios, con homología de secuencia con el gen diana primario en regiones situadas en 5' de la zona diana de los siRNAs primarios; puede por tanto silenciarse la expresión de genes que comparten dominios estructurales, secuencias de DNA homólogas, en sus zona 5'.
A) En la fase inicial del RNAi, unas pocas moléculas del dsRNA es procesado para formar siRNA (flecha amarilla) que en vez de estar unido a RISC, es utilizado como "primer" de RdRP (RNAdependent RNA polymerase).
B) La reacción de la RdRP convierte los mRNA diana en nuevos dsRNAs (nueva generación de dsRNA), que son procesados de nuevo para producir nuevos siRNAs (siRNAs secundarios), estableciéndose un ciclo auto-sostenido de mantenimiento de RNAi (flechas rojas).
C) La replicación del dsRNA original y del dsRNA sintetizado de nuevo por la RdRP aún amplificaría más la potencia de RNAi, ya que tanto la cadena sense como la antisense de dsRNA inicial pueden ser utilizadas como molde para la RdRP, y las dos hebras de los siRNAs secundarios pueden ser utilizados como "primer". Sin embargo, la relevancia de esta vía (flechas grises), no ha sido establecida in vivo.
Modelo de silenciamiento de familias de genes y de variantes de splicing de un gen, por un solo dsRNA original.
RNAi transitivo por siRNA secundarios.
A)Los siRNAS secundarios generados por la RdRP pueden inactivar la expresión de otros genes diferentes al gen diana primario, siempre que tengan una región homóloga con la región en 5' de las dianas de los siRNAs primarios en el gen diana primario.
B) También pueden anularse la expresión de mRNAs del mismo gen diana primario, pero con exones alternativos en 5' del exón diana primario.
Otro diagrama representando el proceso de auto amplificación de RNAi mediado por RdRP y sus efectos (A)Las lineas negras: proceso clásico de degradación del RNAi y las amarillas la via sintética.
(B)Silenciación RNA transitiva. Cuando hay un mRNA intermediario AB u otro mRNA que contenga una región áltamente homóloga al gen B, la reacción de RNAi que tiene como diana el gen B también silenciara el A.
Entrada y dispersión del dsRNA en las células: efecto sistémico del RNAi.
•Las moléculas de dsRNA primario que causan el efecto RNAi en C. elegans pueden inyectarse en las células; en el espacio intersticial entre células; en el intestino, como comida; pueden ser producidos por bacterias transgénicas que son comidas por C. elegans. En gusanos parásitos de plantas, pueden generarse plantas transgénicas que expresen el dsRNA, y provocar efecto RNAi en los gusanos que comen las plantas. El silenciamiento génico por efecto RNAi producido por dsRNA que está en el exterior del animal se llama RNAi ambiental (environmental RNAi).
•El efecto RNAi del dsRNA se propaga entre células y en la descendencia. Un mecanismo: transportadores de membrana plasmática, que permiten la entrada del dsRNA a la célula y el paso del dsRNA de una célula a otra, llamados SID. (Se han demostrado en plantas y en C.
elegans, pero no en Drosophila, ni en humanos).
–SID-1, es responsable de la difusión de RNAi entre células. SID-2 es responsable de la absorción de dsRNA en el intestino de C. elegans –Otras proteínas de la familia SID están presentes en mamíferos, y se postula que están implicadas en la propagación del efecto RNAi entre células, pero su funcionalidad no se ha demostrado todavía.
Cell autonomous, systemic and environmental RNA interference (RNAi).
Silenciamiento de expresión génica por mi(cro)RNA: supresión de la expresión génica por pequeños dsRNA producidos por la célula a partir de genes miR.
•Los miRNAs son moléculas de RNA de cadena sencilla cortas (20-22 nucleótidos) con una secuencia complementaria (antisense) a la de uno o varios mRNA, y cuya traducción pueden inhibir; funcionan como reguladores negativos (represores) de la expresión génica en organismos eucariotas.
•Estos RNAs están áltamente conservados entre especies.
•Los miRNAs son producidos a partir de RNAs precursores más grandes, los pri-miRNAs, que forman estructuras en tallo y lazo (hairpin). Dos RNases de tipo III, Drosha en el núcleo y Dicer en el citoplasma, cortan secuencialmente ambas cadenas generando un duplex de RNA con ~22 nucleótidos, el pre-miRNA. Este duplex es desenrollado y una de las hebras el miRNA se asocia con el complejo proteico RISC (RNA-induced silencing complex: complejo silenciador inducido por RNA). Los miRNAs de cadena sencilla (single-stranded miRNAs) asociados a RISC actúan de guía: se unen a una molécula de mRNAs mediante complementariedad del RNA guía con secuencias localizadas en la región 3' no traducida (3‘untranslated region, 3‘UTR) de un molécula de mRNA. El mRNA unido a RISC no puede ser traducido por el ribosoma; en algunos casos es degradado (por un mecanismo similar al de los siRNA).
•Un miRNA puede unir al mRNA de distintos genes siempre que tengan homología de secuencia en la zona 3'UTR, produciendo así efectos múltiples / pleiotrópicos en la fisiología celular.
¿Qué son? Biogénesis ¿Cómo regulan la expresión génica? 1. miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target degradación del mRNA = RNAi INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL 2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION) Características: A.Turchinovich, et al. Cell press. 2012: H. Liang, L. et al. WIREs RNA 2012: Genes miRNA y su transcripción Existen tres clases de genes codificadores para miRNAs (genes miR) según su localización en el genoma: –1. Intrónicos en unidades transcripcionales codificantes para proteínas (60% en humanos), en la cadena codificante (con sentido o "sense").
–2. Intrónicos en unidades transcripcionales NO codificantes para proteínas (20%).
–3. Intergénicos Los genes de miRNAs residentes en intrones comparten sus elementos reguladores con sus genes huésped, y son transcritos a la vez que el pre-mRNA del gen huésped, por la RNA Pol II.
Mecanismo para coordinar la expresión de genes codificantes para proteínas y miRNAs.
Para genes miRNA que se transcriben de su propio promotor se ha sugerido que son producidos por RNA Pol II porque: 1. Algunos pri-miRNAs son muy largos, lo que requiere una pol más procesiva que la RNA Pol III.
2. Muchos se expresan diferencialmente, de forma regulada, durante el desarrollo embrionario, típico de transcritos hechos por Pol II y no por Pol III.
3. Transcritos completamente funcionales de miRNA pueden generarse a partir de plásmidos conteniendo una secuencia pri-miRNA bajo el control de RNA Pol II.
4. Pri-miRNAs contienen estructuras CAP y colas POLI(A), típico de transcritos primarios producidos por RNA Pol II.
5. Se ha demostrado la asociación de Pol II con promotores de miR-23a~27a~24-2.
6. Algunos pocos promotores de genes miR comprobados experimentalmente contienen elementos típicos de promotores reconocidos por RNA Pol II.
Los genes miRNA en humanos están localizados en todos los cromosomas menos el Y. El 50% están en "clusters" o agrupaciones y son transcritos como transcritos primarios "policistrónicos" : habitualmente un pri-miRNA contiene 2 o 3 miRNAs; el mayor cluster de genes miR conocido codifica para 7 miRNAs. Los clusters contienen frecuentemente genes miR relacionados en secuencia unos con otros y también pueden contener miR relacionados funcionalmente: sus dianas son genes codificantes para enzimas de la misma vía metabólica.
Maduración postranscripcional de microRNAs Biogénesis de miRNA en animales. El miRNA maduro se representa en rojo El miRNA maduro se representa aquí en azul. Los triángulos amarillos indican lugares de corte de las RNAases Procesamiento Nuclear de los pri-miRNA por Drosha Drosha contiene 2 dominios catalíticos RNase III y 1 de reconocimiento de dsRNA como sustrato (dsRNA-binding domain, dsRBD) en la mitad C-terminal de la proteína. Los genomas de plantas no contienen genes homólogos a Drosha, y en algunas especies de plantas todos los pasos de biogénesis de miRNA son ejecutados aparentemente por proteínas homólogas a Dicer (Dicer-like protein, DCL-1) localizadas en el núcleo. En animales, solo se encuentra una proteína homóloga a Drosha, en todas las especies Drosha es un enzima de la familia de las RNasas tipo III, ribonucleasas específicas para dsRNA.
Las células humanas expresan 3 enzimas de ésta familia: una funciona en el procesamiento de rRNA mit.; las otras dos son Drosha y Dicer, que participan en la maduración de miRNA. Dicer también participa en el procesamiento de rRNA citoplasmático, y genera también los siRNAs.
Drosha rompe los pri-miRNAs generando pre-miRNAs de unos 70 nts con estructura de tallolazo (stem–loop) o hairpin. La base del tallo del pre-miRNA tiene un grupo fosfato en 5' y una protuberancia de 2 nts en el 3' que es necesaria para el transporte del pre-miRNA desde el núcleo a citoplasma por Exportin-5.
Drosha actúa con la proteína que une dsRNA llamada DGCR8 (en gusano C. elegans y en mamíferos). DGCR8 se une a la región central y al dominio RNase III de Drosha formando el complejo microProcessor. Drosha contiene 1 centro procesador y 2 sitios catalíticos, cada uno de los cuales rompe un enlace fosfodiester de una de las cadenas del duplex. DGCR8 une Drosha con el pri-miRNAs. De manera similar, R2D2 permite a Dicer-2 unirse al siRNA.
Exportación de los pre-miRNAs desde el núcleo al citoplasma •La salida del nucleo de todos los "snRNAs", depende de la acción de la Exportin 5 (Exp5). En presencia de Ran-GTP, Exp5 une miRNA.
•Ran es una GTPasa que une Exportin 5 cuando ésta está unida a GTP (pero no si Exp5 está unida a GDP) formando un heterotrímero con pre-miRNAs en el núcleo. Exp5 también protege el pre-miRNA de la acción de las exonucleasas. Así, mutaciones o perdida de función de Exp5 resultan en retención de pre-miRNAs en el núcleo y su degradación.
Procesamiento de pre-miRNAs por Dicer en el citoplasma Los pre-miRNAs transportados al citoplasma son cortados por Dicer dando dúplex miRNAs de 20-bp. Las Dicer contienen un dominio ATPasa/RNA helicasa, un dominio PAZ, un dominio DUF283, dos dominios catalíticos tipo RNase III (RIIIa and RIIIb) y un dominio C-terminal de unión a dsRNA (dsRBD).
Además de los pre-miRNAs, los enzimas Dicer procesan también dsRNA a siRNAs y tienen por tanto un papel esencial en el funcionamiento del mecanismo de interferencia de RNA en general.
Dicer es un monómero y tiene un centro de procesamiento (rompe enlaces fosfodiester), por dimerización de los 2 dominios RNAasa III. Cada uno corta una cadena del dúplex, generando productos con protuberancias en 3' de 2 nt. El dominio PAZ reconoce extremos protuberantes 3' de los pre-miRNAs.
El homólogo de Dicer en Drosophila, Dcr-2, requiere además una helicasa para procesar el dsRNA. Se requiere consumo de ATP para la actividad de Dcr-2 de Drosophila y de Dicer de C.
elegans in vitro. En contraste, Dicer humana no requiere ATP. Drosophila expresa dos Dicers, Dcr-1 y Dcr-2, con roles muy distintos en las células. Dcr-1 funciona en la maquinaria de miRNA, mientras que Dcr-2 funciona en la maquinaria RNAi, en ambos casos para cortar dsRNA y para el ensamblaje de RISC Al igual que Drosha, Dicer se asocia con una proteína con dominio de unión a dsRNA. Dcr-2 heterodimeriza con R2D2. Los vertebrados y los nematodos expresan solo una Dicer que funciona en las dos vías: la de miRNA y la de RNAi. Por tanto, deben existir proteínas adicionales que interactúan con Dicer y modulan la especificidad (miRNA ó RNAi) de Dicer.
En C. elegans, una proteína similar a R2D2, la proteína RDE-4 forma un complejo con Dicer, RDE-1 y con otras proteínas y es esencial para el funcionamiento de RNAi pero no para el funcionamiento de miRNA. Las proteínas Dicer también interactúan con proteínas Argonauta.
Parece que los cofactores de Dicer no son requeridos para las reacciones de corte de dsRNA sino para la estabilidad de los miRNAs y para el ensamblaje de RISC.
Mecanismos de acción de los miRNAs: El complejo silenciador inducido por RNA (RISC) y sus funciones Tras el corte de miRNAs por Dicer la vía de silenciamiento de expresión génica por miRNA es muy similar bioquímicamente a la vía de silenciamiento por siRNA en animales.
Dcr-2 se une al extremo menos estable del duplex, cerca del extremo 5′ de la cadena guía. Igualmente Dcr-1 reconoce el extremo menos estable del duplex miRNA:miRNA* y queda unido al extremo 5’ del miRNA Modelo simplificado del procesamiento y funciones de los miRNAs (izquierda) y siRNAs (derecha) La biogénesis de miRNA se muestra a la izquierda y la biogénesis de siRNA se muestra a la derecha.
•La vía RNAi comienza con un RNA largo de doble cadena que puede introducirse en la célula por inyección o por transfección. El RNA de doble cadena puede también ser endógeno. Cada dsRNA es cortado por Dicer en muchos siRNAs de ~22 nt. Algunos de ellos son incorporados como ssRNAs en el complejo RISC. RISC identifica sus dianas mediante la complementariedad perfecta o casi perfecta entre el siRNA y el mRNA diana. En el último paso de la vía de silenciamiento por RNAi, la actividad endonucleasa de RISC corta el mRNA diana.
•En contraste, los miRNAs hacen que el complejo RISC reduzca la expresión génica reprimiendo la traducción del mRNA diana a proteína en los ribosomas, y no lo dirigen a degradación (la abundancia de mRNA diana no baja con los miRNA, solo la abundancia de la proteína). Esto sucede cuando no tienen complementariedad total con el mRNA diana. Cuando tienen una complementariedad perfecta con el mRNA diana, el miRNA hace que el complejo RISC formado corte el mRNA, lo degrade, al igual que sucede con el siRNA, en que se da una complementariedad total entre siRNA y mRNA diana. Sin embargo, en general, los miRNAs no son 100% complementarios a sus mRNA diana y provocan silenciamiento de expresión génica por represión de la traducción, y no por degradación endonucleolítica del mRNA.
¿Cómo se selecciona la cadena de los dúplex miRNA y de siRNA resultantes del corte por Dicer que es incorporada al complejo RISC? El dúplex de RNA es desenrollado por una helicasa, y una de las cadenas, conocida como miRNA* es degradada, mientras que la otra cadena de RNA, la guía, es incorporada al complejo RISC. La cadena que se incorpora a RISC es la cadena cuyo extremo 5' está menos apareado en el dúplex de RNA original.
La zona de complementariedad de miRNA (asociado con RISC) reside en la parte 3‘ UTR de los mRNAs diana. Los microRNAs pueden también pueden unirse a zonas en la región 5‘UTR.
Complementariedad de secuencia entre lin-4 y 3‘ UTR del mRNA de lin14. lin-4 es parcialmente complementario a 7 sitios diferentes en la zona 3‘ UTR del mensajero de lin-14; la unión de los miRNAs a sus secuencias complementarias reprime la síntesis ribosomal de la proteína LIN-14 Componentes del RISC RISCs (también conocido como miRNPs) son complejos de ribonucleoproteinas que contienen proteínas de la familia Argonauta (Ago) (con un dominio PAZ–Piwi), siRNAs/miRNAs, mRNAs complementarios a miRNA/siRNA y varios factores proteicos accesorios Estructura simplificada de las proteínas de la familia Argonaute (Ago) El numero de proteínas tipo Ago varía entre organismos: desde 1 en S. pombe a 27 en el gusano C. elegans. Otras proteínas que se encuentran frecuentemente en RISC incluyen: la proteína intrónica del gen Vasa (Vasa intronic gene, VIG), la endonucleasa putativa Tudor-SN1 y la proteína que une a RNA dFXR (caracterizada en Drosophila). Estas proteínas y sus ortólogos parecen formar parte de los miRNPs de otros organismos. En células humanas, algunos miRNAs se han encontrado formando parte de un complejo con coeficiente de sedimentación 15S que contiene además helicasas adicionales: Gemin 3 y Gemin 4. Algunas proteínas que unen dsRNA y facilitan la transferencia de miRNAs al complejo RISC. Por ejemplo, RDE-4 en C.elegans y su homólogo en Drosophila, R2D2, tienen probablemente ésta función.
Los mecanismos precisos por las que los diferentes complejos RISC ejercen su función todavía son desconocidos en gran parte. En mamíferos, el corte de mRNAs por RISC depende de que los miRNA hibriden perfectamente con sus mRNA diana. Esto pone en marcha la actividad "cortadora" de la endonucleasa Ago-2. En contraste, la supresión de la traducción es mediada por un hibridación imperfecta entre miRNA y su mRNA diana, y por la proteína Ago-1.
El mecanismo de iRNA también puede utilizarse para inactivar un gen miR.
Un siRNA dirigido contra la región de lazo de un precursor miRNA puede usarse para inactivar un miRNA. Por ejemplo: el miR-125b está sobre-expresado en ciertas células tumorales, y su expresión es necesaria para mantener la proliferación de éstas células. Un siRNA (exógeno) dirigido contra el miRNA-125b (endógeno) hace que miRNA-125b sea degradado y se inhibe la proliferación de las células tumorales. 2 formas de precursores de horquilla predichas para miR-125b.
•En rojo: el miRNA maduro Producido por la célula tumoral, la secuencia miR-125b.
•En verde: las secuencias diana/objetivo de los siRNAs introducidos en la célula MIRTRONES Recientemente se ha descrito un nuevo tipo de genes miR intrónicos que dan lugar a miRNA sin la intervención de DROSHA en el núcleo: son intrones muy cortos que al ser procesados por la maquinaria de splicing, dan lugar directamente a estructuras similares a los premiRNA, llamados mirtrones, que son exportados por Exp-5, procesados por DICER en el citoplasma e incorporados a RISC.
Características esenciales de Mirtrones y Pri-miRNAs •Un transcrito típico de pri-miRNA contiene un pequeño tallo (lower stem), que media el reconocimiento y rotura por Drosha (flechas azules). El pre-miRNA hairpin resultante en escindido luego por Dicer-1 (flechas verdes) dúplex de 22 nt dúplex con 2 nts que sobresalen en el extremo 3’.
•Un locus típico de mirtron le falta el pequeño tallo, pero posee un motivo de nts que median su reconocimiento y escisión por la maquinaria de splicing. Una vez tenemos el mirtron, adopta una estructura de hairpin como la del pre-miRNA, y es escindido por Dicer-1.
Mirtrón comparado con miRNA: •La vía miRNA depende del microprocesador (Pashda+Drosha) en el núcleo. En contraste, la vía mirtrón es independiente del microprocesador: mutaciones en Drosha y Pashda no afectan a la vía mirtrón.
•A partir de la exportación al citoplasma por Exp-5, las dos vías funcionan igual, pero los genes diana son diferentes, y las consecuencias también: – – Un mirtrón pueden suprimir la traducción de mRNAs de otros genes que contengan exones con secuencias homólogas al mirtrón.
También puede anular la expresión de productos de splicing alternativo del mismo gen, en el que el intrón con la secuencia mirtrónica se haya incorporado como exón codificante.
Métodos para generar RNAs que silencian la expresión génica •Hay muchas maneras de poner en marcha el proceso de silenciamiento génico por RNAs .
Puede partirse de RNA sintetizado in vitro, que será inyectado o transfectado en las células , y puede partirse de RNA que se generará in vivo por la propia célula. Los RNAs solo tienen un efecto temporal.
•La segunda estrategia es introducir genes (DNA) que al ser transcritos producirán un dsRNA largo o uno corto con estructura hairpin. Se usan promotores reconocidos por RNA pol II o RNA pol III para dirigir la transcripción del DNA recombinante. Las cadenas "sense" y "anti-sense" son colocadas bajo el control de un solo promotor o bien son colocadas en tándem de tal manera que al ser transcritas los RNA producidos hibriden entre sí, o se forme una estructura de hairpin ...