TEMA 4 – TÈCNIQUES CITOGENÈTIQUES MOLECULARS (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 01/04/2016
Descargas 8

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular TEMA 4 – MOLECULARS Alba Ibáñez Galera TÈCNIQUES CITOGENÈTIQUES Les tècniques citogenètiques moleculars permeten localitzar les mostres per observar de les cèl·lules o teixit on es troben localitzades les proteïnes o DNA i fas un estudi in situ de l'estructura. A més, permet quantificant-los. Igual que amb el blotting es fan servir sondes per a detectar el DNA i mRNA i anticossos específics per a les proteïnes. Es van desenvolupar a partir de les primeres tècniques d'hibridacions in situ. La més utilitzada d'aquestes és la FISH: hibridació in situ fluorescent.
Avantatges de la tècnica FISH: - - Respecte a les ISH: o Rapidesa: detecció més ràpida que les ISH no fluorescents o Seguretat: menys perillós que l’ús d’isòtops radioactius o Versatilitat: permet d’utilitzar varies sondes diferents en una única anàlisi (anàlisi múltiple). Pots utilitzar diferents sondes per detectar diferent mRNA i detectes cadascun d’ells en funció de les sondes fluorescents específiques per a cadascun.
Respecte a les tècniques citogenètiques: o Sensibilitat: més sensible que les tècniques citogenètiques clàssiques, major resolució.
o Anàlisi de mutacions cromosòmiques en cèl·lules interfàsiques: les tècniques citogenètiques clàssiques precisen analitzar cèl·lules en divisió, en metafase.
Exemple: tenim diferents mRNA que s'estan expressant a l'embrió de Drosophila. I a més pots observar la distribució del RNA, la radioactiva no ho pots fer perquè no és permanent. És més econòmica, més ràpida i la sensibilitat és força elevada, de manera que no necessites la radioactiva per detectar determinades quantitats.
Els fluorocroms tenen un espectre d’emissió i de recepció, de manera que en funció de l'espectre d'emissió tenim diferents longituds d'ones i disposem de múltiples combinacions en el mercat i de fluorocroms.
A simple vista no es detecta i necessitem determinats aparells.
Amb microscopi de fluorescència podem determinar amb filtres la longitud d'ona que emetem i la que reps, de manera que pots observar diferents longituds d'ones. De manera que pots seleccionar en funció dels teus criteris.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Desenvolupament de la tècnica FISH - Mostra: predesnaturalització, desnaturalització i fixació.
Sonda: marcat, fragmentació i desnaturalització Hibridació: renaturalització i rentats.
Detecció: incubacions, rentats, contratinció i antifade.
Observació.
En el fons tenim el mateix esquema, a la mostra tenim àcids nucleics que s'han de desnaturalitzar per trencar les estructures per facilitar la hibridació, i la sonda també s'ha de desnaturalitzar per passar a la hibridació. Però ara mantenim l'estructura cel·lular, però abans es fa una pre-desnaturalitzar amb un tractament del teixit de les cèl·lules, que es sol tractar amb RNAases que no interfereixen en les sondes competint amb el DNA, quan és aquest el que s’analitza. De manera que també es tracta amb proteïnasa k per facilitar que la sonda penetri. Pot ser que no trobem senyal si la sonda no penetra a la cèl·lula, de manera que no trobem senyal en el teixit cel·lular. Després de desnaturalitzar es fixa. S'ha de treballar amb agents desnaturalitzant per baixar al màxim la Tm per a que amb una temperatura suau pugui desnaturalitzar-se el DNA La sonda ha d’estar marcada i fragmentada, però moltes vegades es fragmenta més per sonicació per facilitar que puguin penetrar perquè treballem amb sondes grans. De manera que s'obtenen seqüències més petites que puguin ser complementàries amb altres regions més fàcilment.
S'hibrida baixant les condicions de severitat, es fan els rentats per eliminar la sonda no hibridada per fer la detecció.
Es poden detectar de manera directa o indirecta amb anticossos. Es pot fer una contratinció o antifade. El microscopi de fluorescència es fa a les fosques, si hi ha senyal fluorescent ho veurem.
Contratinció Per tal de posar de manifest els nuclis o els cromosomes objecte del nostre anàlisi per FISH, cal realitzar una contratinció.
Si mirem una sonda centromèrica del que sigui. Però no podem veure les cèl·lules, En canvi la contratinció permet observa el nucli no la cèl·lula. De manera que al fer la contratinció queda marcat per gonatropidi emeten una senyal vermella en tot el nucli, i tindrem la sonda marcada amb dues senyals en una cèl·lula i una en l'altre.
A més, es poden utilitzar més d'una tinció. Exemple: de telòmers i cromosomes.
Antifade L’antifade (antimorteidors) evita que s'apagui la llum. La fluorescència dura molt poc, és un senyal que s'anirà perdent, en excitar un fluorocrom tenim que es va esmorteint fins que s'apaga, en canvi l’antifade fa que duri més temps la senyal fluorescent, fa més lent aquest procés.
Tipus de sondes Es poden utilitzar diferents tipus de sondes en funció del que es vol detectar: - Específiques de regió Pac-telomèriques (detecten tots els telòmers) i telomèriques de seqüències úniques.
Pericentromèriques (hibriden en un cert cromosoma) i pancentromèriques (hibriden a tots els centròmers).
Cromosòmiques: detecten cromosomes específics o només a un braç.
Genòmiques: hibriden a tot el genoma, a tots els cromosomes de la cèl·lula.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Sondes centromèriques En les sondes centromèriques que detecten un cromosoma en concret sí que observem el nombre de sondes d'un cromosoma interfàsic per saber la presència d’un cromosoma. De manera que en funció del nombre de senyals podem veure dos cromosomes (diferents) disòmics.
En funció de la senyal trobem disòmics, monosòmics o trisòmics, per tant sobretot s'utilitza en el diagnòstic d’alteracions cromosòmiques numèriques (aneuploïdies).
Si tots els nuclis tenen un senyal tenim una monosomia, però també per a que passi en tots els nuclis és improbable i es senyal que només hi ha una regió centromèrica.
Sonda centromèrica del cromosoma X Si s'utilitza el FISH per determinar el sexe d'una persona té un problema si només utilitzem el X (pot ser monosomia del X o home si només observem un senyal de l’X.
Per tant, sempre que s'analitzen cromosomes sexuals s'han d'analitzar el cromosoma Xi el Y. De manera que en els nuclis interfàsics podem trobar només un senyal o potser els dos en d'altres XY.
Diagnòstic prenatal d’aneuploïdies - La tècnica FISH permet detectar aneuploïdies en cèl·lules que no estan en divisió (nuclis interfàsics) L’anàlisi cromosòmica prenatal convencional pot durar de 8 a 14 dies Ens permet diagnosticar les aneuploïdies en 2-3 dies a partir de cèl·lules amniòtiques no cultivades El diagnòstic prenatal al líquid amniòtic amb cèl·lules i sèrum permet diferents tipus d'anàlisis. El citogenètic per trobar si tenen alteracions cromosòmiques utilitzem el cariotipador, de manera que podem detectar 3 cromosomes 21. Però, les cèl·lules amniòtiques no es divideixen, s'han d'estimular la seva divisió, però a vegades no creixen, es necessiten uns 15 dies per poder emetre un diagnòstic, de manera que si falla per a que s'estimulin i creixin s'han de tornar a demanar una mostra i allargar el període per donar el diagnòstic.
Com que en FISH es pot utilitzar qualsevol tipus de cèl·lules perquè no s'han de fer créixer, es poden analitzar les possibles aneuploïdies en el nucli i als pocs dies tenim que es poden obtenir els resultats. Per tant, s'han d'utilitzar una sèrie de sondes en total (5) sobretot en dones en que tenen una edat avançada. Però si sabem que la dona té algun antecedent en que hi ha una malaltia familiar.
Amb una trisomia del 21 avortaria o del cromosoma 4, de manera que analitzes els pocs que saps que pot presentar.
Exemple: trisomia 21 Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Aneuploïdies cromosomes 13, 18, 21 i X Normalment es treballen amb determinades sondes, on es fan servir 5 sondes, en vermell el 21, en verd el 13 i per altra banda el verd per al X, en blau el 18, i en vermell el Y, però com que no hi és, és una noia amb 3 cromosomes 21.
De manera que s'analitza en bona part el diagnòstic de dones amb el risc d'aneuploïdies. I és ràpid i fiable.
Sondes pantelomèriques Les sondes pantelomèriques serveixen per determinar la grandària relativa que tenen els telòmers. La llargada dels telòmers es manté a les cèl·lules embrionàries i de la línia germinal. Les altres perden activitat telomeràsica i es van escurçant els seus telòmers, la qual cosa està relacionada amb algunes patologies.
Exemple: Telomere (FITC-green) and centromere (TAMRA-red) probes Counterstained with TOTO-3 (blue) Colon biopsies. A. Young donor showing equal telomere and centromere staining intensities in both the epithelial and stromal cells. B. Older donor showing telomere staining intensity is reduced in the epithelial cells compared with the stromal cells in this same section. No significant difference in centromere and DNA staining intensities is seen between the different cell types.
Tenim dues biòpsies de colon d’un donant jove i de un donant major. En el jove hi ha molta més senyal telomérica (fluorescència verda) que no en la persona major, al qual se li han escurçat els telòmers de les cèl·lules epitelials del colon. Llavors, açò ens indica que l’escurçament està associat a l’edat.
Hi ha malalties hereditàries relacionades amb les mutacions en el gen de la telomerasa o el gen de la Diskerina, la qual s’ajunta amb la telomerasa per allargar els telòmers. Cada vegada que en una generació s’escurcen els telòmers, les malalties són més greus.
Aquestes persones tenen greus problemes de salut: forta anèmia, cèl·lules sanguínies immadures, poca quantitat de cèl·lules sanguínies...
Exemple: foto dels nuclis de les cèl·lules d’un donant. Com mesurem el telòmers? Amb les sondes pantelomèrica. El que farem serà observar la quantitat de senyal a cèl·lules interfàsiques o mesurar la grandària dels telòmers de manera individual en metafase.
Llavors, no només ho fem general, sinó també de manera individual. Açò es fa amb FISH quantitativa (Q-FISH): ens dóna la intensitat del senyal i obtenim informació de cadascun dels telòmers.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Per Southern també podem madurar la grandària de cadascun: observem unes bandes que corresponen a telòmers, dels de grans a més petits. A mesura que l’individu es major, la grandària mitjana va disminuint. Southern és més barat i mes ràpid i senzill, però no es tan guai.
Sondes de regió específica Les podem usar tant en interfase o en metafase. Podem obtenir diferents resolucions: - Tinció de bandes en cromosomes metafàsics (>5Mb) FISH en cromosomes metafàsics (>1Mb) FISH en cromosomes interfàsics (20kb-1Mb) FISH en DNA estès (5kb-700kb)(1-2kb) La FISH és una tècnica d’elevada resolució que permet detectar anomalies submicroscòpiques inclòs en els nuclis de cèl·lules interfàsiques. A la dreta tenim una taula on es relacionen petitetes delecions/duplicacions amb certes malalties, les quals es poden diagnosticar per FISH. En citogenètica convencional ens movem al límit i és difícil diagnosticar-les.
Síndrome de Williams – Deleció 7q11.23 La síndrome de Williams es deu a una petita deleció que no és observable en un cariotip estàndard però, que es pot detectar per FISH. La deleció inclou al gen de la elastina que codifica una proteïna que contribueix a l’elasticitat dels vasos sanguinis.
Síndrome de DiGeorge Aquesta malaltia està causada per una petita deleció del braç llarg del cromosoma 22.
Aquestes persones tenen afectat el sistema immunitari i poc desenvolupades la glàndula paratiroidea i la melsa.
Trencament 17cen-p53 que origina la pèrdua del p53 També ens pot interessar detectar una deleció de un gen que es troba en certa regió genòmica, com el p53. Si hi ha una deleció sols hi hauria una senyal, però igualment necessitem un control, del qual deuríem veure dues senyals.
Carcinoma de mama – Amplificació de l’oncogen HER2/NEU (cromosoma 17) Veurem múltiples senyals corresponents a l’amplificació de l’oncogen HER-2.
Leucèmia mieloide crònica – Cromosoma Philadelphia El cromosoma Philadelphia es genera a causa d’una translocació entre els cromosomes 9 i 22. Si veiem les dues senyals estaran juntes, és que tenim aquest cromosoma.
Limfoma de Burkitt Translocació entre el cromosoma 8 i 14.
Tandem labeling Hibridem dues sondes en dues regions contigües o en tàndem. Podem detectar així no-disjuncions, trencaments entre les regions on hibriden les dues sondes o trencaments en la regió on hibrida una de les sondes.
Exemple: trencament en 1q12. Pot generar càncer de mama, d’endometri o de coll uterí.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Sondes cromosòmiques Les utilitzarem per fer el pintat cromosòmic. Utilitzem dues sondes marcades de diferents colors. Podem detectar translocacions reciproques (es molt mes fàcil detectar-ho així que per tinció de bandes).
Pintat de braços cromosòmics Podem detectar: inversions pericentromèriques, translocacions i dicèntrics.
Exemple: un cromosoma presenta una translocació i una inversió pericentromèrica i l’altre una fusió que dona lloc a un cromosoma dicèntric.
Aquests dos cromosomes tenen els braços marcats de colors diferents.
FISH múltiple Podem detectar el canvi de un cromosoma amb qualsevol altre cromosoma. Si utilitzem dos cromosomes, detectarem canvis d’aquests dos cromosomes amb qualsevol altre. A més cromosomes analitzem, més reordenacions podrem detectar.
Usarem una hibridació in situ fluorescent múltiple. Cada sonda la podem marcar de una manera diferent. Podem obtenir fins a 7 colors diferents amb la combinació de sols 3 cianines diferents; a més no sempre tenim perquè usar les mateixes proporcions. Amb 5 cianines vam poder obtenir 24 colors diferents per detectar els 24 cromosomes humans. Els software d’anàlisi els distingeix i ens els marca d’un color diferents perquè es pugui diferenciar a ull humà.
D’aquesta manera es poden analitzar tots els cromosomes del genoma de una persona. D’aquesta manera es pot der una anàlisi complexa del genoma humà.
Distingim dues variants: - - M-FISH: Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization, desenvolupada per la Yale University. Consisteix en l’obtenció de cinc imatges digitals per separat per cada una de les cianines, que un software combina donant una imatge composta amb pseudocolors en funció de la composició dels fluorocroms. Cada cromosoma es veurà en unes imatges digitals o en unes altres; en funció d’açò, sabent com hem marcat cada cromosoma, sabrem quin és cadascun.
SKY: Spectral Karyotyping, desenvolupada per la National Center for Human Genome Research. Consisteix en l’obtenció d’una imatge digital composta que un interferòmetre analitza les longitud d’ona de cada pixel i assigna a cada cromosoma un pseudocolor.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Hibridació Genòmica Comparativa (CGH) En la segona part del tema parlarem del CGH. En aquesta tècnica trenquem les molècules de DNA per comparar genomes de diferents tipus cel·lulars (exemple: teixit normal i tumoral) o de diferents organismes. El DNA que aïllem el marquem per nick translation, cada teixit amb una cianina diferent: verd i vermell, DNA mostra i de referència respectivament.
La CGH no és una hibridació in situ normal, ja que destruïm la mostra. Llavors, perdem la localització de les seqüències.
Simplement detectarem la diferència entre les dues mostres. A l’hora de que les sondes competeixin, esperem que hibridi la mateixa quantitat de sonda en una mostra i en una altra, encara que de colors diferents. Però, si hi ha un desequilibri, detectaríem una diferència quantitativa entre el teixit tumoral i el normal.
- Monosomia: doble senyal en un teixit sobre l’altre Trisomia: tres còpies vs dos.
Amplificacions: més senyal de la zona amplificada en un teixit que en un altre.
Llavors és útil per: - Detecció d’aneuploïdies, pèrdues o amplificacions en tumors Detecció d’aneuploïdies en avortaments espontanis (en teixits que no solen créixer) No útil per a detectar reordenacions equilibrades ni poliploïdies. En una translocació reciproca no detectarem res, ja que pensem que la ubicació l’hem perduda; i en un poliploïdia tampoc, ja que l’anàlisi es fa en quantitats equimolars de DNA.
Patró de colors: - Verd: guanys.
Vermell: pèrdues.
Blau: seqüències repetitives. Les seqüències repetides no solen marcar-se per ninguna sonda, llavors queden marcades en blau (tinció control).
Groc: igual quantitat de sonda en els dos teixits.
FISH vs CGH - - CGH: o No necessites cap metafase, es pot treballar amb qualsevol fase cel·lular. En teixit tumoral costa molt trobar una metafase de bona qualitat.
o La mostra a analitzar es desestructura i s’utilitza com a sonda o es preparacions desnaturalitzades i fixades en el suport sòlid ens permeten d’analitzar la mostra FISH (M-FISH o SKY): o Necessites metafases.
o La mostra a analitzar es desnaturalitza i es fixa en el suport sòlid o Les sondes permeten l’anàlisi de la mostra estructurada (in situ) Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera PRINS (PRimed IN Situ labeling) La mostra a analitzar es prepara com a la FISH però l’anàlisi de la mostra és diferent: - Marcatge in situ Elongació amb la polimerasa de DNA Taq Nucleòtids marcats Encebador específic (annealing) Termociclador L’anàlisi no es basa en hibridacions de sondes, sinó en la síntesi in situ de DNA que marcarem. A partir d’encebadors sintetitzarem un DNA que marcarem. Un dels dNTPs estarà marcat amb un fluorocrom. Desnaturalitzem el DNA per facilitar l’annealing dels encebadors. Es sintetitzaran noves cadenes de DNA marcades i el que detectarem serà les cadenes de DNA sintetitzades de novo.
S’utilitza molt per mirar aneuploïdies però, també per mirar altres coses.
Exemples: Limfòcit humà Encebador del cromosoma Y Limfòcit humà Encebador del cromosoma Y Espermatozoide humà Encebador del cromosoma X PRINS multicolor Podem fer una PRINS multicolor per mirar diferents cromosomes a la vegada. En aquesta tècnica empalmem trossos de diferents cromosomes.
...