4 - Mitosi (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura citogenetica
Año del apunte 2014
Páginas 21
Fecha de subida 03/11/2014 (Actualizado: 04/09/2015)
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

CITOGENÈTICA PARCIAL 1 BLOC III: Mecanismes de divisió cel·lular en eucariotes superiors TEMA 4 – Divisió cel·lular mitótica EL CICLE CEL·LULAR 1/10/14 En la majoria de les cèl·lules eucariotes, el cicle cel·lular es divideix en 4fases: G1, S, G2 i M.
El procés inclou una fase S de replicació del DNA i una fase M que comprèn una divisió del nucli (cariocinesi) seguida d’una divisió citoplasmàtica (citocinesi).
ESDEVENIMENTS CROMOSÒMICS DE LA FASE S REPLICACIÓ DEL DNA I REPRODUCCIÓ CROMATÍDICA Replicació – no només del DNA, sinó de la cromatina sencera (DNA + histones). Implica que un cromosoma amb una cromàtide passi a tenir-ne dues – implica la reproducció cromatínica.
En el cicle cromosòmic mai existeix una unitat citogenètica funcional formada per DNA monocatenari. La cromàtide és la unitat citogenètica indivisible del cromosoma.
39 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 INTERCANVI DE CROMÀTIDES GERMANES (SCE) L’intercanvi de cromàtides té relació amb els processos de replicació del DNA basats en els trencaments de doble cadena que es produeixen per acció de topoisomerases i helicases.
En la imatge observem una forca de replicació. Per evitar tensions, existeixen enzims com les topoisomerases i helicases que trenquen la molècula per evitar entortolligaments fent que tota la forqueta pugui avançar. Aquests trencaments (regulats) produeixen l'intercanvi de cromàtides germanes.
La reorganització de regions homòlogues de cromàtide no comporta un canvi en el manteniment de la polaritat, estructura i morfologia cromosòmica, ni afecten la viabilitat cel·lular.
Les topoisomerases, a aquest nivell, provoquen trencaments que seran reparats correctament (es reuniran els extrems). Però de manera aleatòria es produeixen intercanvis – els extrems s'intercanvien i formen monocadenes híbrides.
40 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Les conseqüències són nul·les – la seqüència de nucleòtids és la mateixa, són reorganitzacions de regions homòlogues, mantenen l’estructura i no afecten la viabilitat.
2/10/14 Aquest fenomen a priori no té interès. Però en mirar-ho al microscopi (observació citològica) la cosa canvia. Preparem un cultiu i fem que hi hagi dues fases S.
Utilitzant mètodes de tinció especials basats en la 5-BrdU i les diferències en el grau de tinció de les cromàtides al medi on s’està duent a terme la replicació (el 5 bromo desoxiuridina és un anàleg de la timina), al final del procés (1a ronda), les cadenes de nova síntesi presentaran l’anàleg. Els resultat són: Al final del procés en aquesta 1a ronda, tenim les cromàtides representades com una “línia contínua i discontínua” (una correspon a la que té timina i l’altre conté l’anàleg, que són híbrides).
Si una d’aquestes cèl·lules la sotmetem a una segona ronda de replicació, també en excés de 5BrdU, les cadenes la incorporaran i totes seran discontinues. Al final del procés es generaran dues cromàtides que, quant a la presència/absència de cadenes amb 5BrdU, presentaran diferències.
Per sobre la línia vermella, les dues monocadenes estan formades per l’anàleg. Per tant tot això serà un segment de cromàtide bisubstituït – tot estarà format per monocadenes amb 5BrdU. Per sota, tindrem una monocadena amb timina i una amb 5BrdU, i ho anomenem cromàtide monosubstituïda.
41 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Aquesta situació es pot observar citològicament si agafem aquestes cèl·lules, les tenyim amb Giemsa i observem els cromosomes. La imatge que dóna és la següent: Cromosomes arlequinats En funció de si les cromàtides són monosubstituïdes o bisubstituïdes, es tenyiran diferent – les blanques són les monosubstituïdes i les negres les bisubstituïdes. Les cromàtides que tenen un segment de cada, és on s’han produït diversos intercanvis.
És a dir, quan no es dóna intercanvi, s’observen cromosomes amb les dues cromàtides iguals.
Quan es dóna l’intercanvi, hi ha un segment implicat que canvia de color.
Per què és important? Això permet observar i quantificar en cèl·lules metafàsiques un esdeveniment molecular que va passar fa 2 fases. A més, hi ha malalties en què els pacients generen una gran quantitat d’intercanvis desequilibrats – síndrome de Bloom, etc. – basades en mutacions en proteïnes que estan implicades en aquest fenomen d’intercanvi de cromàtides germanes (helicases i topoisomerases). En aquest context, davant d’un quadre clínic, una de les proves diagnòstiques és fer un anàlisi del nombre d’intercanvi de cromàtides germanes.
Foto: síndrome de Bloom. El nombre de cromosomes està alterat i el nombre d’intercanvis de cromàtides germanes és elevadíssim.
42 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 ESDEVENIMENTS CROMOSÒMICS DE LA FASE M FASES DE LA MITOSI Cicle de cohesió i condensació de cromosomes.
43 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CANVIS EN LA MORFOLOGIA I ESTRUCTURA DELS CROMOSOMES PAPER DE LES CONDENSINES Com es condensen els cromosomes? La condensació dels cromosomes (mitòtics) és responsabilitat de les condensines – complexes multiproteics formats per SMC (II i IV) amb 2 dominis funcionals, un domini frontissa i un ATPasa en cada extrem, on s’uneixen proteïnes reguladores que tanquen l’anell (regulen la condensina).
44 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Formen part de l’esquelet del cromosoma i permeten una alta organització de la cromatina en el cromosoma metafàsic assolint (amb models desconeguts) aquest grau màxim de condensació.
Qui regula les condensines? MPF – complex proteic regulat per ciclina i CDK. És un factor promotor de la mitosi (activitat kinasa). A mesura que la cèl·lula avança al llarg de la fase M fins al grau de condensació màxim, MPF comença a ser funcional.
EX – Cromosoma 22 humà: Nucleòtids: 48x106 Estirat: 15 mm Interfàsic: 0,015 mm (x1.000) Condensat: 2mm (x10.000) Imatges del màxim nivell de condensació A – Micrografia electrònica d’un nucli interfàsic lisat.
B – Micrografia electrònica d’escaneig d’un cromosoma mitòtic.
45 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 PAPER DE LES COHESINES Com es produeix la cohesió entre cromàtides germanes? Depèn de les cohesines – complexes proteics molt similars a les condensines formats per proteïnes SMC (aquí seran la SMC III i la SMC I). Aquestes dues fan el mateix – formen una V i també tenen els mateixos dos dominis.
Les molècules que tanquen l’anell també són les kleisines. Aquestes varien en funció de l’espècie. En la imatge tenim la Rad21. Regulant l’activitat de les kleisines trobem proteïnes accessòries com ara la SA1/2.
Les condensines estructuren molècules de DNA – aquesta activitat d’organització de la fibra sempre la fan amb segments de DNA d’una única molècula.
Les cohesines el que fan és unir segments de DNA de molècules diferents (de cromàtides diferents) – cohesionen cromàtides germanes, segments de cromatina de dues molècules diferents. Aquesta és la principal diferència amb les condensines.
Taula: nom de les diferents proteïnes en funció de l’espècie.
46 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Com realitzen les cohesines aquesta funció? En la imatge veiem un cromosoma en etapa G1 – és l’etapa on es carreguen els complexes de cohesines. Totes les molècules del complex s’ajunten i s’ubiquen. Així, quan produeixen en al fase S la replicació cromatídica, a mesura que es dóna a terme la replicació, les dues cromàtides germanes ja estan encerclades per l’anell de cohesines (a mesura que es van sintetitzant). A la fase de G2 tenim cromosomes de 2 cromàtides on aquestes 2 cromàtides ja estan encerclades per l’anell – ja estan cohesionades. Si el sistema es donés un cop s’ha donat la replicació (a posteriori), seria molt més difícil ja que les dues molècules de DNA no estarien al mateix domini – es garanteix la cohesivitat de les dues cromàtides.
En la següent imatge, ho veiem però mah complicao – veiem com es carreguen a sobre el cromosoma els complexes de cohesines. Com veiem, a G1 no està carregat del tot – hi ha SMC i kleisines però encara queden moltes subunitats reguladores – encara NO són funcionals. Les altres subunitats es van carregant a mida que avança el procés.
47 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 De que depèn la cohesivitat de cromàtides germanes? Bàsicament, de cohesines – però la cohesivitat també depèn de la unió/solapament de les cromàtides germanes com a conseqüència de la col·lisió i de la relació entre les dues forquilles de replicació durant la fase S. Quan arriben a un lloc determinat, es produeix un cert grau d’entortolligament entre cromàtides germanes que després les topoisomerases arreglaran (concretament, la II). Però aquest entortolligament produeix un cert grau d’unió entre cromàtides germanes que també participa en aquesta cohesivitat (és un efecte minoritari).
En la transició G1-S—G2 es garanteix la cohesivitat entre cromàtides germanes.
En la transició G2 – Fase M, es dóna l’activació MPF, que té, entre d’altres dianes, les condensines, que no han estat encara actives – és quan s’inicia la condensació. En el moment en que es trenca l’embolcall nuclear, els microtúbuls poden accedir als cromosomes (capturarlos).
UNIÓ DELS MICROTÚBULS AL CINETOCOR Un cop es forma el fus i el citoesquelet mitòtic, es dóna la unió de microtúbuls als cinetocors (concretament, als cinetocors externs).
48 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Microtúbuls units a la capa externa del cinetocor.
49 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 CONCEPTES CLAU – Sobre la unió dels microtúbuls al cinetocor Teories sobre com els MT interaccionen amb el cinetocor: A) Les interaccions inicials es produeixen per un sistema de recerca i captura (pescador que llença i recull – els microtúbuls van creixent polimeritzant i despolimeritzant, i en el moment que capturen un cinetocor s’estabilitzen i queden units).
B) Gradient de RanGTP – molècula sintetitzada en tots els centròmers. Aquesta molècula potencia la formació de microtúbuls. Es proposa que no són els microtúbuls que provenen del centríol els que capten els cromosomes, sinó que els que són generats per aquest gradient al cromosoma van a buscar el centrosoma – el gradient afavoreix la nucleació.
C) Derivació de b), es basa en que es forma des del mateix cinetocor però no depèn del gradient de RanGTP, funciona independentment – els cinetocors tenen la facultat de formar microtúbuls que posteriorment s’uneixen al fus mitòtic.
No són excloents.
Teories sobre com els microtúbuls s’uneixen al cinetocor: A) Els microtúbuls de la part terminal (al costat del cinetocor) formen un anell rígid de proteïna DAM1 que estreny el microtúbuls i l’estabilitza. Posteriorment, una altra proteïna, Ndc80, uneix el microtúbul a la part externa del cinetocor.
B) Exactament igual però sense cap anell de DAM1 – Ndc80 és qui uneix el microtúbuls ella sola.
C) La unió entre microtúbuls cinetocors es realitza a partir de protofilaments – línies de color blau.
50 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 D) La unió entre microtúbuls i cinetocor es produeix per la participació bàsicament de proteïnes motores, com ara CENP-E, dineïnes, que formen part del cinetocor.
Missatge – dinàmica cromosòmica guay, unió microtúbuls – cinetocor caca.
El que ens interessa és com s’han d’unir els microtúbuls perquè la segregació de cromàtides germanes sigui l’adequada. El cinetocor no pot triar a quin pol s’uneix.
TIPUS D’ORIENTACIONS 08/10/14 Aquesta unió entre microtúbuls i cinetocor no té direccionalitat. Com a conseqüència, en un parell de cinetocors germans els microtúbuls poden estar units amb diferents orientacions. Les possibilitats que tenim són: a. Unió sintèlica – els MT s’uneixen als dos cinetocors.
b. Unió merotèlica – els MT s’uneixen indistintament a qualsevol dels dos cinetocors germans.
c. Unió monotèlica – només s’uneixen fibres del fus a un dels dos cinetocors.
d. Unió amfitèlica – els MT d’un costat s’uneixen al cinetocor de la dreta, mentre que els que provenen de l’esquerra s’uneixen als MT de l’esquerra.
51 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 D’aquests 4 tipus d’orientacions, quina és compatible amb la segregació de cromàtides germanes? L’amfitèlica. Quina és compatible amb la segregació de cromosomes homòlegs a la meiosi I? La sintèlica. Molecularment, s’ha seleccionat aquesta per efectivitat. La monotèlica també serviria però en menor eficiència en la separació. La disposició de la monotèlica xoca amb les proteïnes que regulen aquestes unions. És a dir, el motiu són les càrregues proteiques de les quals encara no hem parlat.
SEGREGACIÓ AMFITÈLICA DE LES CROMÀTIDES GERMANES Aurora B La segregació de les cromàtides germanes es basa principalment en la participació de la proteïna quinasa Aurora B. El que fa aquesta proteïna és desfer les unions en qualsevol tipus d’unió MT – cinetocor. Reconeix unions sintèliques, monotèliques i merotèliques. Només quan s’assoleix una unió amfitèlica bipolar amb equilibri de forces per part dels dos pols, l’Aurora quinasa s’inactiva i les unions s’estabilitzen.
Quines forces possibiliten que deixi d’actuar? La seva pèrdua d’activitat és una conseqüència de la tensió centromèrica – quan la força exercida pels dos extrems és equivalent és quan s’inactiva l’Aurora. No hi ha un model definitiu. El més aproximat és el que s’explica a continuació.
52 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Aspectes importants: L’Aurora B fosforila (és una quinasa). És una proteïna que forma part del cinetocor intern. Fosforila diferents substrats. Els principals són: - - Ndc80 – és una de les proteïnes encarregades d’unir els microtúbuls al cinetocor. Quan estan fosforilades, perden la seva funcionalitat (canvi conformacional).
mDia3 – també uneix els microtúbuls al cinetocor.
CENP-E – és una proteïna motora que també uneix microtúbuls al cinetocor.
Totes aquestes són les proteïnes diana implicades en la unió entre el MT i el cinetocor.
Quan un MT no està unit al cinetocor (B), l’Aurora, que està a la cara interna del cinetocor i té accés a aquestes proteïnes, les fosforila, per tant no poden estabilitzar la unió d’un MT.
Quan el MT està unit incorrectament (A), el mateix.
Però quan es dóna la unió entre un cinetocor i un MT, com passa en (C), CENP-E s’uneix al MT i això atrau a la regió d’unió fosfatases (fan una funció contrària a Aurora), per tant aquestes fosfatases desfosforilen els substrats fosforilats per Aurora B. D’aquesta manera, aquestes unions s’estabilitzen. Però Aurora B continua sent activa i malgrat hi hagi fosfatases ella pot seguir fosforilant, i la unió s’anirà desfent (lluita entre fosfatasa i kinasa). En quin moment deixa d’actuar? Quan hi ha equilibri de forces – els MT fan la mateixa força d’un costat i de l’altre i això es tradueix a que l’Aurora B se separa físicament de la regió centromèrica perquè estem separant les dues cromàtides. Aurora B s’allunya llavors de les proteïnes que estabilitzen les unions, que són les seves dianes. Per tant guanya la fosfatasa i els substrats queden desfosforilats i queden estabilitzats com veiem en (D).
53 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 SEPARASA Si acceptem la unió amfitèlica, quines forces generen la segregació de cromàtides germanes? Tenim les cohesines que uneixen a través de l’anell tancat amb kleisines (en la foto, scc1 perquè és llevat).
Procés de segregació – en el moment en que els cromosomes estan en unió amfitèlica bipolar alineats en la placa metafàsica, s’activa el factor promotor de l’anafase, APC, que té diferents substrats. Un d’ells és la securina (xaperona). Quan actua sobre la securina, s’allibera la separasa (proteasa Cysteine, forma activa) i aquesta actua sobre les cohesines i es produeix la segregació de les cromàtides germanes. Concretament, la separasa actua sobre les kleisines obrint l’anell de cohesines, de manera que els cinetocors ja no tenen cap força que els mantingui units i es dóna la segregació.
PUNT DE CONTROL DEL SAC La segregació s’ha de donar de forma sincrònica (tots alhora). Per què? Forma part d’un mecanisme de control. En aquells cromosomes en que no hi ha una unió amfitèlica bipolar amb equilibri de forces, la regió cinetocòrica el que fa és secretar/expulsar un complex format per 3 proteïnes que són mad2, bup3 i bupr1.
Si reprenem l’estructura del cinetocor, recordem que teníem una xarxa de proteïnes que formaven el cinetocor intern, proteïnes que catalitzaven la 54 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 unió amb els MT (Ndc80) i també hi havia components del punt de control (components SAC).
Aquests últims són principalment els que acabem d’esmentar, mad2, bup3 i bupr1, que surten quan un cinetocor no té una unió amfitèlica.
Aquestes proteïnes formen el complex MCC que inactiva selectivament una ciclina, concretament la ciclina cdc20. El cicle cel·lular es regula a través de kinases dependents de ciclines. APC és una fosfatasa que es regula a través de la ciclina cdc20. Per tant, si APC no està unida a cdc20, no és actiu, no pot actuar contra la securina i no pot alliberar la separasa. Si la unió no és amfitèlica, s’allibera aquest complex MCC perquè les proteïnes s’uneixen a cdc20 i s’impedeix així l’activació d’APC i la cèl·lula queda bloquejada a metafase – manera de controlar la segregació.
Què passa quan tots els cinetocors presenten ja una unió amfitèlica bipolar? En el moment en que l’últim cinetocor s’orienta correctament ja no hi ha MCC en el citoplasma de les cèl·lules, i l’absència d’aquest complex MCC allibera ciclines cdc20, de manera que es poden unir a APC i això el que produeix és l’activació d’aquest complex, s’activa APC. APC té vàries dianes. Una és la securina, que actua fent que la separasa s’alliberi, actuï sobre les cohesines i es produeixi la segregació de les cromàtides germanes.
Ara bé, APC té una segona diana en aquest context (té moltes més) – també actua sobre la Ciclina B que està unida a la Quinasa Cdk1. Aquest complex s’anomena Complex MPF – factor promotor de l’anafase, per tant l’acció que té és inactivar també la Quinasa Cdk1 que forma part de MPF i això permet que la cèl·lula surti de la metafase i continuï el seu cicle cel·lular.
55 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Qui és el desencadenant de tot això? La segregació anafàsica s’activa només si hi ha segregació amfitèlica bipolar amb equilibri de forces, ja que si això no té lloc, s’alliberen factors inhibidors.
Total, que l’orientació és essencial.
La desfosforilació de les condensines fa que aquestes s’inactivin i que al final de l’anafase, gràcies a la inactivació d’aquestes per part de APC, es pugui tornar a començar el cicle.
DURADA DE LA MITOSI 13/10/14 L’índex mitòtic és el nombre de cèl·lules en qualsevol fase mitòtica respecte la població total analitzada (%).
L’índex de fase és el nombre de cèl·lules en una determinada fase mitòtica respecte la població total de cèl·lules mitòtiques (%).
En al taula veiem que profase i telofase són les fases més llargues, mentre que metafase i anafase són més curts. Els dos primers duren més perquè hi ha una reestructuració de la cromatina (implica una activació i desactivació de condensines), mentre que els altres dos són processos on la cromatina no està protegida per l’embolcall nuclear i per evitar l’exposició del genoma a situacions que el puguin malmetre duren menys temps.
DIVISIONS MITÒTIQUES NO CONVENCIONALS 56 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 El cicle cel·lular, en determinats moments, pateix modificacions que s’escapen de la norma general i que per diversos motius tenen rellevància.
Variacions en la replicació i en el repartiment del material hereditari: situacions observades in vivo.
- - Endoreduplicació – dues o més rondes de replicació consecutives sense que això vagi acoblat a fase M. Quan repliquem un genoma diploide n vegades sense separar cromàtides. És freqüent i s’observen cromosomes politènics en teixits com la glàndula salivar de Drosophila.
Haplocromosomes – és el fenomen oposat, tenim situacions en que es produeixen dues fases M consecutives sense que hi hagi una fase S de replicació. Estem dient que hi ha cromosomes amb una sola cromàtide. La presència d’aquest fenomen porta implícita la formació d’anomalies – quan sotmets aquests cromosomes a fase M, no hi ha possibilitat de repartiment equilibrat de cromosomes i això dóna lloc a anomalies o fins i tot a trencament transversal enlloc de vertical.
Variacions que afecten els estadis mitòtics: situacions observades in vitro.
- - - C-mitosi – quan tractem les cèl·lules amb drogues que afecten la polimerització dels microtúbuls com ara la colxicina. Aquestes drogues fan que les cèl·lules quedin bloquejades en metafase. L’observació citològica dels cromosomes bloquejats és com la de la imatge.
Les imatges són de cromosomes bloquejats, per tant difereixen bastant del que observaríem en una metafase in vivo.
Fus multipolar – quan tractem les cèl·lules amb drogues que afecten la formació del fus mitòtic com ara la carbetamida. Aquestes drogues fan que els centríols es dupliquin més duna vegada i acabem amb més d’un punt de nucleació amb la conseqüència d’un repartiment desequilibrat dels cromosomes. S’utilitza quan vols veure l’efecte de les aneuploïdies sobre la viabilitat cel·lular.
A – mitosi – quan tractem les cèl·lules en condicions de manca d’oxigen (anòxia). Es donen efectes sobre el fus i errors en la segregació.
57 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 Variacions en la citocinesi: - - Cariocinesi sense citocinesi – el resultat és la producció de cèl·lules polinucleades. Aquest procés és un procés natural, el veiem per exemple en cèl·lules musculars. També pot ser un efecte induït; per exemple, si tractes cèl·lules vegetals amb cafeïna, es veu afectada la formació del fragmoplast.
Citocinesi sense cariocinesi – el resultat és una bipartició de la cèl·lula, donen lloc a cèl·lules amb anomalies.
En la següent imatge observem altres tipus de variacions menys habituals: a) Jamás hubo embolcall nuclear però no se perquè.
b) L’embolcall nuclear només es trenca per on entren els microtúbuls del centrosoma.
c) Mitosi interna, tancada – en el cas dels llevats la mitosi té lloc íntegrament al nucli.
d)Altres espècies formen només microtúbuls cinetocòrics i presenten un fus mitòtics molt senzill.
e) Altres espècies fan ponts citoplasmàtics i capturen els microtúbuls a través dels porus nuclears. No hi ha fragmentació del nucli.
f) Formació d’un únic pont.
58 CITOGENÈTICA PARCIAL 1 59 ...