Tema 17 Inmunohistoquímica (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Patología celular y molecular
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 03/05/2016
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PATOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TEMA 17. Métodos en patología molecular (II) Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica es una técnica de detección de proteínas. Las técnicas (de detección de inmunohistoquímica (IHC) y la inmunofluorescencia (HF). Existen otras técnicas, como el ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Asay), el Western Blot, la inmunoprecipitación o FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting).
proteínas) más empleadas en el diagnóstico son la Estas técnicas tienen en común que la proteína se reconoce mediante anticuerpos  se emplea la reacción antígeno-anticuerpo para el reconocimiento.
INMUNOHISTOQUÍMICA Podemos partir de muestras incluidas en parafina o de muestras congeladas . En el caso de contar con muestras parafinadas: una vez obtenidos los cortes, debemos desparafinar e hidratar, ya que se trata de reacciones que requieren medio acuoso.
Una vez hemos rehidratado las muestras, hay que llevar a cabo el desenmascaramiento antigénico o antigen retrieval. Este paso es necesario ya que las muestras han sufrido un proceso de fijación y deshidratación muy agresivo y han sido sometidas a altas temperaturas  las proteínas que quedaban sueltas se han unido entre ellas gracias al proceso de fijación, es decir, los epítopos que deben ser reconocidos por anticuerpos están unidos entre sí.
Se emplea un protocolo de desenmascaramiento con el fin de liberar los epítopos.
*En muestras congeladas este paso no es necesario, ya que las fijaciones son mucho más ligeras.
Por otro lado, hay que bloquear las uniones inespecíficas - uniones antígeno-anticuerpo que no son perfectas: algún anticuerpo podría unirse con algún antígeno de la muestra de manera inespecífica.
El bloqueo se lleva a cabo mediante grandes cantidades de proteína, que bloquean estos antígenos.
También es necesario bloquear enzimas endógenas que nos pueden engañar en la detección.
Además, muchas veces, cuando el antígeno es intracelular, es necesario permeabilizar la muestra con detergentes como el tritón.
1 Patología molecular y celular Existen muchos protocolos para la inmunohistoquímica. Se emplean en diagnóstico aquellos que están más optimizados y automatizados en el tiempo.
El primer paso consiste en poner sobre la muestra el anticuerpo primario. El anticuerpo primario detecta al antígeno y se une a él (en caso de que en la muestra se encuentre dicho antígeno).
Después debe limpiarse el exceso de anticuerpo, para que, en caso de que no haya antígeno en la muestra, no nos dé positivo el análisis.
Después se añade un anticuerpo secundario, que reconocerá al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario está acoplado a algo que permita su detección - se emplean reacciones enzimáticas cuyos productos tengan color. La enzima más empleada es la peroxidasa pero también se emplea frecuentemente la fosfatasa.
Se pone el sustrato en el tejido y, si se produce la reacción (es decir, si había antígeno en la muestra) da un producto coloreado (normalmente marrón) que permite localizar el antígeno.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Se trata de un sistema de detección muy simple.
Si la proteína que buscamos está en muy baja concentración, se necesitan sistemas de amplificación: - Conjugación del anticuerpo secundario con BIOTINA . La biotina es reconocida por otra molécula, estreptoverdina, que está conjugada con la enzima. La estreptoverdina tiene capacidad de unirse a más moléculas de enzima (que el anticuerpo secundario), por lo que se originará una cantidad de mayor de producto.
*Este sistema consta de tres pasos.
- Sistema de polímeros: se conjuga el anticuerpo secundario con un polímero que tiene asociados cientos de moléculas de la enzima.
Se produce mucha amplificación de la señal - la amplificación es directamente proporcional al precio.
INMUNOFLUORESCENCIA Mediante esta técnica, la proteína se detecta gracias a un fluorocromo. Cabe recordar que un fluorocromo es una molécula excitada a una longitud de onda determinada que emite a una longitud de onda distinta.
 Existen dos variantes: la directa y la indirecta.
Directa: el anticuerpo primario está directamente conjugado con un fluorocromo, que al ser excitado con la longitud de onda adecuada, emite fluorescencia.
Indirecta: el anticuerpo primario es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva incorporado un fluorocromo. La inmunofluorescencia indirecta es mucho más sensible que la directa.
3 Patología molecular y celular Hay muchos fluorocromos con longitudes de onda de excitación y emisión muy diferentes.
La inmunofluorescencia permite hacer marcajes dobles, ya que es posibles conjugar distintos fluorocromos a distintos anticuerpos  detección de 2, 3, 4 antígenos en la misma muestra.
En la inmunofluorescencia indirecta se cambia la especie en la que se ha producido el anticuerpo primario para poder detectar más de un antígeno a la vez. Sin cambiar la especie no se vería ninguna diferencia.
INMUNOHISTOQUÍMICA EN DIAGNÓSTICO Identificación del tipo celular en tejidos: Se emplea para diferenciar entre linfocitos B (antiCD20) y linfocitos T (antiCD3).
Identificación de procesos celulares Como por ejemplo, la proliferación.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Detección de la alteración en la expresión de proteínas (a grandes niveles) Ni la inmunohistoquímica ni la inmunofluorescencia son técnicas cuantificables - inducen a errores y podrían falsear resultados - pueden detectarse presencia y ausencia. Hay que tener cuidado al cuantificar si una muestra tiene más proteína que otra por ejemplo.
DETECCIÓN DE PATOLOGÍAS Mediante la inmunohistoquímica pueden detectarse patologías de forma prematura, bien sean infecciosas o no. En las patologías infecciosas se observan los efectos citopáticos de los agentes infecciosos (como citomegalovirus) - así, es posible detectar la infección antes de que aparezcan los primeros síntomas.
También es útil para el diagnóstico diferencial, por ejemplo, para diferenciar entre un cáncer de próstata invasivo y no invasivo.
5 Patología molecular y celular Se emplean estas técnicas de detección de proteínas tanto para la detección como para la identificación de tumores.
Existen paneles de inmunohistoquímica que ayudan a diferenciar los tumores - se hacen algoritmos aplicando combinaciones de antígenos hasta llegar a identificar el tumor.
Una manera masiva de hacer inmunohistoquímica es el Tissue Microarray. Se concentran las diferentes muestras en un solo bloque de parafina.
La desventaja de esta técnica es la escasa representatividad de la muestra (es demasiado pequeña).
6 ...