Principles of genetic engineering (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 4º curso
Asignatura Recerca Mèdica Translacional en Oncologia
Año del apunte 2016
Páginas 14
Fecha de subida 22/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Recerca mèdica translacional en Oncologia TEMA 4. PRINCIPLES OF GENETIC ENGINEERING Genetic medicines Modifiquem el genoma viral o armem el virus (es provee el virus amb un altre genoma que té una altra funció).
- Material genètic - Vectors de transferència de gens - Genoma modificat viralment - Virus armats Genetic modifications - Gene adittion: - Knockdown o supressió de gens: si tenim mes copies del gen i el volem suprimir - Gene repair: si nomes hi ha una mutació puntual.
Genetic medicines Genetic mateiral: gens, miRNAs, shRNAs, miRNAesponges també poden haver oligonucleòtids (DNA, ssRNA, dsRNA).
Necessitem vectors delivery que poden ser de virus o no.
46 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene addition. Protein coding genes L’addició de gens es fa amb gens proteics. Es pot adherir tot el gen, o mini gen (només alguns gens i els promotors). Podem substituir diversos exons per un cDNA i al final amb un codó stop.
També podem tenir un altra manera, podem seleccionar un promotor que pot ser d’interès per la cèl·lula a la que volem posar el gen + cDNA + poliA i també es pot afegir splicing acceptor sequence que facilitarà l’expressió del cDNA.
El que es fa es introduir un gen que li proporcionarà a la cèl·lula una funció que ha perdut o una nova funció. Expressió gènica.
Gene addition. miRNA gens Estan sintetitzats com a pri, processats a pre i son transportats al citoplasma i allí fan la funció de reconèixer el mRNA i fer la seva degradació. Si volem expressar el miRNA podem generar pri o pre miRNA i després introduïm la seqüència a un plàsmid o podem utilitzar oligonucleòtids. Als plàsmids necessitem un promotor sempre.
47 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene knockdown or gene supression. Target mRNAs Es pot basar en dos estratègies: - Plasmid based estrategies: shrNAs (siRNA) - Oligonucleotids: ss oligos (antisense DNA oligo) que s’uniran al RNA i desencadena la degradació i també a partir de siRNA que entraran en la via del RNA i allí desencadenarà la degradació.
RNAi: molecular understanding Els oligonucleòtids entren directament al citoplasma.
Generation of effective shRNA 21 nucleòtids homòlegs al RNA que volem knockdown i una seqüència de 6 nucleòtids entre les dues seqüències de 21. La segona seqüència de 21 estarà en la orientació contraria.
Això es clona a un plasmidi amb un promotor. U6P transcriu short RNA. Quan el plasmid es transcrit al citoplasma tindrem un RNA amb una estructura que surt que correspon als 6 nucleòtids.
Això es el que la cèl·lula entén com un mRNA i el que fa es processar-lo.
48 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene Knockdown or gene supression. Target mRNAs Els RNA són modificats amb metilacions o grups que afecten l’estabilitat.
49 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene knockdown or gene supression. Target mRNAs Gene Knockdown or gene supression. Target miRNAs Utilitzem ssRNA oligonucleòtids.
Els oligonucleòtids s’uniran al miRNA.
Anti-miRNA oligonucleòtids (AMOs) -> antagomirs. ssRNA against specific microRNAs.
La inhibició de l’activitat del micro-RNA amb oligos anti-miRNAs complemetament complementaris al pri-miRNA, pre-miRNA o miRNA madur.
50 Recerca mèdica translacional en Oncologia Antagomirs Poden ser modificats per grups metils o tenir la estructura LNA que es molt freqüent i s’ha vist que els oligonucleòtids que tenen aquest a estructura no son captats pel TLR (toll-like receptors). Les modificacions LNA bloquegen el reconeixement a través dels receptors Tolllike.
Gene knockdown or gene supression: Target miRNAs. Plasmid-base : sponges Sponges són plàsmids fet per enginyeria que poden tenir un transgen (reporter) i s’hi introdueixen seqüències que reconeixeran específicament miRNA. Tenim moltes copies d’això i el miRNA produït s’unirà a la seqüència i serà seqüenciat i no actuarà a la diana endògena.
51 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene repair a nivell de DNA: genome editing A nivell de DNA també es diu genome editing. Es produeix en l’àrea d’interès una doble cadena en el DNA i la cèl·lula activa el seu mecanisme de reparació. Això portarà a un efecte de KO.
També es pot activar una recombinació homologa (gene correction) en el lloc de la mutació.
Si fem el mateix però no en la zona d’interès sinó en un intró el que farem es una addició específica.
El primer pas es produir la doble cadena (DSB), tenen una especifica seqüència que reconeix el lloc del genoma on el volem posar, això son els dits de zinc nucleases.
Zinc finger nucleases Ajuden a la producció de DSB. Tenen l’habilitat d’unir-se a específics elements del DNA i aquests dominis (zinc fingir) es fusionen a una subunitat que té activitat nucleasa que es el Fok1.
Quan els dos dominis de la nucleasa s’ajunten , s’activa l’activitat de la nucleases.
52 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene repair. TALEN nucleases Prové de les bactèries. Son trasncriptonal activity like efector nucleomes. Enlloc del dit de zinc tenim una cua TALE que estan basades en unes certes característiques i reconeixen una base especifica.
Gene Repair. CRISPR-Cas9 Està basat en una propietat dels bacteris, l’adaptació del sistema immune. En alguns bacteris quan són infectats tenen un sistema immune que fa que s’elimini el DNA introduint seqüències al DNA com un CRISPR (moltes repeticions). Quan això s’expressa tenim les proteïnes Cas i també tenim el crispr RNA en les cèl·lules i quan s’infecten les crispr poden reconèixer les seqüències unint-se i s’activa la seva degradació.
53 Recerca mèdica translacional en Oncologia Vector System Components: - Expressió de Cas9 que té l’activitat nuclear - Cripsr RNA que tenen dos dominis: un que s’uneix a la proteïna Cas9 i un altre que serà específic per la seqüència diana i ser aproximadament de 20 nucleòtids. Es genera un constructe on tindrem un promotor, una diana (seqüència Cas)) i una seqüència que reconeix.
- La seqüència PAM, quan utilitzem Cas9 del Streptococcus pyogenes és la NGG. Quan es troba NGG tres nucleòtids després la Cas produeix el sistema.
RNA-guided DNA endonuclease 54 Recerca mèdica translacional en Oncologia RNA-guided DNA endonucleases: CRISPR/Cas System Genome Editing 55 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene Repair at he RNA level En un gen tenim diverses mutacions, una possibilitat se fer un sistema que farà un trans-splicing al teu cDNA i enlloc de processar les mutacions es processa el que tu has afegit i per tant serà un híbrid.
Exon skipping Es aplicable a la distròfia muscular de Duchenne. HI ha una mutació truncant que no s’splice bé i tenim una proteïna truncada que provoca una malaltia. Per una proteïna es produeix dos malalties: la distròfia muscular de Duchenne i la distrofia de Becker on la mutació afecta el lloc d’splicing i dona lloc a una proteïna mutant que te una semi-efectivitat. El que s0intenta es transformar el Duchenne a Becker.
56 Recerca mèdica translacional en Oncologia Delivery vectors - Virals: retrovirus (gammaretrovirus, lentivirus), adenovirus associats o adenovirus - No virals: nanopartícules No virals: nanopartícules Són els que es coneixen com nanopartícules. Va des de liposomes fins a polímers catiònics...
57 Recerca mèdica translacional en Oncologia Viral vectors Enveloped: - Retrovirus: gamma retrovirus o oncoretorvirus - Lentivirus: derivats del virus del VIH.
Aquests dos s’integren al genoma, la diferència es que els retrovirus necessiten que les cèl·lules es divideixin per integrar-ho al nucli i el lentivirus poden entrar les cèl·lules encara que no es divideixen.
NON-enveloped: - AAV - Adenovirus Els dos deriven del transgen i estan al nucli però no s’integren al genoma.
Gammaretrovirus LTR seqüència: necessària per la integració Té gag+pol+env 58 Recerca mèdica translacional en Oncologia Lentivirus Retrovirus life cycle AAV Diferents serotipus que reconeixen diferents receptors.
Transportat pels microtúbuls al nucli.
Viroterapia Un virus que tingui capacitat lítica nomes en les cèl·lules canceroses.
59 ...

Comprar Previsualizar