2.Técnicas de estudio (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 4º curso
Asignatura Virologia
Profesor D.C.
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 22/10/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 2. TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA VIROLOGÍA BIOSEGURIDAD. Para que se produzca un accidente biológico: - Hospedador susceptible - Agente infeccioso - Concentración suficiente: cada patógeno tiene una carga mínima - Ruta de transmisión à lo que se controla en el laboratorio: corta la ruta 4 niveles de bioseguridad. - Nivel I. Barreras de seguridad para que haya una mínima exposición hacia el medio ambiente, así como al resto de personal. Cuando se trabaja con microorganismos que no provocan enfermedad en humanos sanos. Los requerimientos son los básicos, es decir, como los laboratorios de la universidad. - Nivel II. Agentes que suponen un riesgo moderado para personal y medio ambiente. Requerimientos básicos + campanas de seguridad (diferentes niveles) + autoclave. - Nivel III. Microorganismos que pueden ser letales. Obligatorio una doble puerta. Presión negativa: el aire siempre circula hacia el interior. Renovación completa del aire 10 veces/h + filtros HEPA. Campanas II o III o Nivel III+ à mascarilla con un respirador independiente. - Nivel IV. Organismos sin posibilidad de tratamiento. Duchas de esterilización, sistema eléctrico y tal visible, equipo de respiración independiente, tiempo de trabajo limitado. Campanas de bioseguridad. Están diseñadas para crear ambiente de trabajo libre de contaminación, así como para proteger al manipulador. - Tipo I. Protegen al investigador. Los cultivos no están casi protegidos porque el aire entra directamente del exterior. Son opcionales. - Tipo II. Protegen tanto al individuo manipulador como a los cultivos. El aire que circula dentro de la campana ha sido filtrado à ambiente estéril - Tipo III. Máxima seguridad, la campana está cerrada herméticamente. Se trabaja a través de unos guantes. Puerta en el lateral que da acceso al interior de la campana para meter y sacar material. Lista de microorganismos. - Select agents: microorganismos que están dentro de la lista de guerra biológica - Grupo de riesgo: a quien afecta - NIH: otro organismo que pone otra categorización Cultivo de virus. Directamente trabajamos con su hospedador (vegetales, bacterias, mamíferos…). En paralelo se suele trabajar con cultivos celulares. La línea celular depende del tipo de virus, pero suele ser epiteliales. A veces no se pueden recrear artificialmente las condiciones de forma tan fiable que consigamos la infección vírica à cultivos en: - Huevos de pollo fecundados. También pueden servir para medir la capacidad patogénica o Virus de la gripe en líquido amniótico o alantoides o Virus del Herpes Simple en saco vitelino o membrana corioalantoidea o Adenovirus Aviar en alantoides - Animales de experimentación o Pero hay selección natural de mutantes: el virus inoculado puede ser seleccionado por la presión selectiva del sistema inmunitario del individuo à el virus que luego obtienes no es el mismo que el que inoculas! § Útil para estudios de patogénesis, pero poco a poco se están sustituyendo por los cultivos celulares PRODUCCIÓN VÍRICA. Inoculación del hospedador. El nº de ufp dependen de características propias del virus y de la célula que infecta. Luego hay que purificar y concentrar las partículas víricas para obtener una suspensión vírica libre de contaminantes. Las técnicas de purificación y concentración dependerán del tipo de virus: - Extracelulares o Centrifugación a alta velocidad o Precipitación con PEG o Insolubilización con sulfato de amonio o Filtración - Intracelulares o Homogeneización mecánica o Ultrasonidos o Ciclos congelación-descongelación Técnicas de purificación/fraccionamiento: - Centrifugación en gradiente de densidad (sacarosa, glicerol) - Cromatografía - Electroforesis Valoración de la producción de virus - Hemaglutinación - Microscopía electrónica - Determinación de ácidos nucleicos - Técnicas inmunológicas o Inmunofluorescencia o Inhibición de hemaglutinación o ELISA - Densidad óptica - Unidades Formadoras de Placa à bacteriófagos VALORACIÓN DE CULTIVOS. Cuantificación indirecta de las partículas víricas presentes en la suspensión obtenida. Las técnicas vienen dadas por las capacidades infectivas. - Determinación de ácidos nucleicos, la más novedosa ahora Hemoaglutinación, sólo los virus que son hemoaglutinantes, como el de la gripe. Establecen uniones especificas con la superficie, por lo que una partícula vírica puede entrar en contacto con varios eritrocitos y generar una red. Formación de botón vs pocillo completo coloreado. Si se genera la red, observamos coloración en todo el pocillo. En la columna de la izquierda hay diluciones seriadas en las que podemos ver a qué concentración de eritrocitos se da el fenómeno de la hemoaglutinación. Titulación: dilución a la que vemos el resultado, se establece un valor de referencia que nos titula el nº de partículas víricas que tenemos respecto al fenómeno de hemoaglutinación. Unidad formadora de placa (UFP). Placas de bacterias sembradas al 100% à Adición de suspensiones víricas a diferentes concentraciones à Resultado: placas de lisis. Al cuantificarlas, encontraremos el valor de UFP referente a cada concentración. Las propiedades biológicas de los virus pueden ser valoradas por otros métodos: Lesiones foliares. Sometemos hojas al stock y contamos las lesiones. Lesiones en la membrana corioalantoidea. Lesiones en membranas de huevos fecundados sometidos a la suspensión. Efecto citopático en cultivos celulares. Método también diagnóstico de algunas enfermedades de origen vírico. Añadimos suspensión vírica a cultivo celular y observamos ciertas alteraciones a nivel microscópico, que dependen del tipo celular. - Sincitis: fusión celular - En neuronas se acumulan las proteínas víricas formando cuerpos de inclusión en núcleo o citoplasma à cuerpos de Negri - Proliferación de membrana plasmática o nuclear - Formación de vacuolas - En células en cultivo se observa pérdida de adhesión - Roturas cromosómicas VALORACIÓN DE CULTIVOS. Métodos semicuantitativos Dilución límite. Aplicación de diluciones seriadas de la suspensión vírica à valoramos si se observa el efecto o no (animal muere o no muere) - Dosis infectiva 50: dilución que provoca efecto citopático en el 50% del cultivo - Dosis letal 50: dilución que mata el 50% de los organismos MORFOLOGÍA DE VIRUS. Debido a su tamaño (20nm-200nm), para observarlos es necesario un microscopio electrónico à LR de TEM: 50-75 A Límite de resolución: menor distancia entre dos puntos que nos permite verlos como dos puntos independientes Técnicas morfológicas. Microscopía electrónica de transmisión, pero las imágenes obtenidas son poco resolutivas. Como alternativa tenemos la difracción de rayos x, posible porque las partículas víricas son cristalizables. ...

Comprar Previsualizar