TEMA 1. MICROSCOPIA ÒPTICA. (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2014
Páginas 3
Fecha de subida 02/11/2014
Descargas 64
Subido por

Descripción

Apuntes realizados con el docente Lleonard Barrios.

Vista previa del texto

BIOLOGIA CEL·LULAR Tania Mesa González 1º CURS BIOLOGIA UAB TEMA1: Microscòpia òptica.
Microscòpia Òptica (1400 augments màxim)  utilitza els fotons Electrònica major resolució Imatge + nítida + augments que el òptic.
Utilitza electrons Microscopi òptic: Incrementa la imatge amb diferents resolucions. Té un límit d’ampliació que no pot passar, perquè sinó es perd resolució.
 Aspectes: -llum – lents condensadors – mostra – lents objectius (revòlver) – prisma reflector – plànol focal – lents oculars (10-12 augments) – línia de visió  Lents objectius x lents oculars = augments totals (fins a 100 x)  (10-12 augm.) Resolució : Capacitat per veure separades 2 estructures independents. Distància a la qual som capaços de veure-les separades.
D = 0,61 x λ / n x sinα λ= longitud d’ona (modificable) * n=índex de refracció α= angle de llum en forma de con D= distància ** * Com més petita es la longitud d’ona, + energètica és la llum i més resolució tindrà la imatge.
** Com més petita és la D (distància), més resolució tindrà la imatge.
- n x sinα : obertura numèrica -α angle màx.(αmàx) 90º característica de cada objectiu sinαmàx = 1 com + gran millor qualitat (màx. real 1.4) el millor α seria d’uns 70º aprox.
no modificable sin i n= = sin r  vel. llum aire = 1,5 (valor estàndard en el vidre) vel. llum vidre Els augments útils en un microscopi serien l’obertura numèrica multiplicada per 1000 (és a dir, si l’obertura numèrica fos 14, serien 1400 augments).
 De vegades s’empra un oli d’immersió en les observacions microscòpiques del mateix índex de refracció que el vidre, per tal que tant la llum perpendicular com la obliqua arribi a la lent.
BIOLOGIA CEL·LULAR Tania Mesa González 1º CURS BIOLOGIA UAB  L’ocular serveix per a fer coincidir el feix de llum en la nostre retina, donant una imatge inversa però real.
 PREPARACIÓ DE LA MOSTRA; Per a poder veure la mostra l’hem de tallar en làmines molt primes, però sense perdre estructura, per a que pugui passar la llum. Hi ha diferents passos.
1. Fixació  Per fixar i mantenir les qualitats. Es fa amb alcohol o formaldehid. La cèl·lula queda morta.
2. Inclusió  Fer-ho rígid per tal de poder fer làmines homogènies. Opció: ceres o resines.
3. Tall El tenim en un pot i fem seccions amb un micròtom (làmines d’acer). Les làmines es van movent i van donant mostres (entre 1-10 micròmetres).
4. Tinció  Colorants específics ens permet fer distincions. (de diversos colors per potenciar diferents parts)  2 fotons de la mateixa incidència, en travessar zones de la mostra de diferent gruix/densitat, poden variar.
Microscopi invertit amb contrast de fase: S’utilitza per exemple en les clíniques de fertilitat per veure els embrions.
- També hi ha microscopis al revés, amb la llum a dalt, d’aquesta manera la distància entre la mostra i les lents és més petita (sobretot utilitzat amb mostres gruixudes).
Microscopi de contrast interferencial (DIC o Nomarski): En el qual podem observar fins i tot les mostres amb volum. Ens permet visualitzar cèl·lules vives (no cal fer el procés anterior).
Microscopi de contrast de fase: Per veure cèl·lules vives, per tant no podem fixar.
Té un condensador especial en forma de xarxa cristal·lina que fa que els feixos lluminosos procedents de la font de llum es subdivideixin en infinits feixos que en arribar a la preparació contrasten millor els objectes a observar. Empra uns objectius especials de contrast de fase. Contràriament a la majoria de microscopis el feix de llum prové de la part superior mentre que l'objectiu és troba a sota la mostra, cosa que permet treballar-la fàcilment mentre s'observa la mateixa. La imatge que es forma ve donada per la diferència de fase que adopten els feixos lluminosos en passar per part més o menys denses de la mostra.
Aquest microscopi permet observar estructures internes, però per això la mostra ha de ser molt fina.
Microscopi de fluorescència: Utilitza les partícules anomenades Fluorocroms(que s’exciten en unes determinades λ i emeten altres llum de λ diferent).
 Permet visualitzar diferents estructures de la cèl·lula.
Immuno fluorescència  Alguns fluorocroms s’exciten i serveixen per marcar coses de la cèl·lula (es poden recuperar anticossos de malalties ). Els anticossos immuno-fluoresncents, són marcadors fluorescents utilitzats per fer visibles determinades molècules o estructures cel·lulars.
BIOLOGIA CEL·LULAR Tania Mesa González 1º CURS BIOLOGIA  UAB Com funciona? Bombeta de fluorenscència  1r filtre (que només deixa passar certes λ)  la llum seleccionada arriba a un mirall que fa que la llum idònia es reflecteixi sobre la mostra  passa per la lent objectiva  posteriorment passa per un 2n filtre per tal que arribi només la llum que ens interessa . En aquest procés la llum no arriba directament a la mostra.
- El fons on hem de posar la mostra ha de ser negre - El filtres els anem canviant per poder veure diferents fluorocroms. Els filtres dobles o triples són per a diferents a l’hora.
- Marcatge fluorescent : en anticossos i en DNA - FISH: Hibridació “in situ” fluorescent.
Microscopi làser confocal: Utilitzen llum làser que permet controlar més estrictament la λ.
- Dona imatges molt nítides però no gaire grans.
La llum arriba molt exacte i permet que la llum només incideixi en una part de la mostra (si no ens interessa observar-la sencera).
- Podem fer un recorregut (escombrat) de la superfície de diferent punts en diferents plans focals.
- Permet fer imatges tridimensionals (3D).
 Per obtenir imatges més nítides hi ha altres tipus de microscopi. Deconvolució  Tota la mostra està il·luminada, però va per plans, i llavors es construeix una imatge, amb les molècules enfocades a cada pla (les que més intensitat emeten).
Microscopi de fluorescència amb super resolució: STORM: microscòpia de reconstrucció òptica estocàstica.
 Funcionalment  La mostra s’il·lumina amb llum de diferents λ durant diversos cicles de temps molt curts. A cada cicle tan sols algunes molècules s’exciten de forma aleatòria. Això permet localitzar-les amb molta precisió i incrementar la resolució que pot arribar als 20nm.
- Dona imatges molt nítides, donades de la anteposició de diferents imatges.
- Nivells de resolució molt pròxims als de la microscòpia electrònica (no tant).
...