Utilitat clínica dels perfils d'expressió gènica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Ciencias Biomédicas - 4º curso
Asignatura Recerca Mèdica Translacional en Oncologia
Año del apunte 2016
Páginas 17
Fecha de subida 22/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Recerca mèdica translacional en Oncologia TEMA 14. UTILITAT CLÍNICA DELS PERFILS D’EXPRESSIÓ GÈNICA L’objectiu del genoma funcional es saber totes les funcions de qualsevol seqüència que hi hagi al genoma. Sabem la seqüència del DNA però també volem saber els SNP i com es relacionen amb el gen. Els transcriptomes mirem el transcriptoma que son els transcrits que estan expressades a els cèl·lules en un temps específic.
Proteòmics: estudien el proteoma, no nomes s’estudien les proteïnes sinó també les seves modificacions Metabolòmics Els microarrays s’utilitzen en genòmics i proteòmics.
Gene expression Totes les cèl·lules del cos tenen el mateix genoma però totes tenen el transcriptoma diferent.
Les diferents patologies faran que hi hagi diferent expressió gènica.
Per estudiar l’expressió de gens s’ha utilitzat els microarrays. Quan tenim el perfil d’expressió gènica hem d’analitzar les dades.
Tipus d’array Hi ha diferents tipus de array.
145 Recerca mèdica translacional en Oncologia Al començament s’utilitzava cDNA, en els 2000 després del projecte genoma humà, el que s’utilitzava eren oligos específics dels gens. Els oligos poden ser sintetitzats en la superfície del micoarrayl (synthesis in situ).
Al IDIBAPS s’utilitza Affymetrix que utilitza Fotolitografia.
També es poden classificar els microarrays segons si tenen dos colors o un. Si tenen dos colors hem de co-hibriditzar dos mostres en el mateix array, cada un tindrà un fluorocrom diferent.
També tenim el de un color en que hibridem una mostra en el array i fem totes les comparacions entre dos arrays.
GeneChip System Scanner: identificar on estan les unions en el RNA.
Probe arrays (chips) -> oven -> fluídics station -> scanner -> software data analysis 146 Recerca mèdica translacional en Oncologia One-color target labelling and hybridization workflow Es comença el procés a partir de RNA total, que ha de ser d’alta qualitat. Com es testa la qualitat? Es fa amb un bioanalitzardor que fa una electroforesi que identifica la mida dels nucleòsids. Quan es veu el 18S i 28S ribosòmic es que tens bona qualitat.
La RNA polimerasa copia , tenim una transcripció in vitro per anar de nanograns a micrograms. Tindrem ribonucleòtids que estaran marcats amb biotina i així representaran els RNA transcrits.
Mirem que tot estigui bé abans de fer el array.
NO es un fluorocrom la biotina. Utilitzarem la Streptavidina que té un fluorocrom PHycoertrina que s’uneixi a biotina i així mirarem en quines posicions del array tenim senyal.
147 Recerca mèdica translacional en Oncologia Strategies for interrogating wide genome gene expression 148 Recerca mèdica translacional en Oncologia Methods of microarrays analysis S’utilitzen algoritmes matemàtics per veure quines mostres s0assemblen. Així les podem classificar en classes.
També podem identificar quins gens s’expressen diferents en dos grups que sabem el seu fenotip. Així el següent temps que tinguem una mostra no haurem de fer un microarray perquè podrem estudiar nomes els gens diferencials dels grups.
Imatge Els números es transformen en colors (heat-map). El roig es sobreexpressat i el blau poc expressat. Això encara es difícil de interpretar però podem aplicar els clustering gens (eines matemàtiques) que ens permeten ajuntar els gens que tenen un mateix patró. Podem veure clarament quin grup de mostres expressen un grup de gens. En un array podem tenir mes de 40.000 línies.
149 Recerca mèdica translacional en Oncologia B-cell NHL Limfoma Son heterogenis perquè poden arribar de qualsevol estadi del procés de diferenciació de les cèl·lules B. Al nòdul limfàtic interaccionen amb un antigen.
De cada tipus de cèl·lula s’han identificat diferents tipus de limfoma que s’originen Mantel cell limfoma, difuse limfimaa, burkitt limfoma...
Diagnosis in hematopathology Els hematopatologistes utilitzen eines per mirar el patró de la malaltia.
- Morfologia - Immunofenotip - Marcadors moleculars Amb els microarryas una de les primeres malalties que es va analitzar van ser els limfomes perquè en aquestes malalties es pot aïllar fàcilment DNA de les mostres de sang.
150 Recerca mèdica translacional en Oncologia Distinct types of diffuse large B-cell lyphoma identified by gene expression profiling Hi ha diferents tipus de limfomes si els classifiquem segons l’expressió dels gens: - CLL - Resting blood B cells - FL: fol·licular limfoma. Les cèl·lules B germinal del centre estan molt expressades en el FL que no estan expressades en el CLL. Això ens diu que el FL s’origina a partir de cèl·lules que venen del centre germinal. Son similars el FL o el CLL però es diferencien principalment en això - Les cèl·lules B activades estan molt expressades en el grup blau, normalment estan expressades in vivo.
Utilitzant nomes l’expressió de gens es podrien identificar les diferents malalties i no cal mirar el microscopi. Però els hematopatologistes diuen que ho poden fer mes barat .
Diffuse large B-cell lymphoma. A heterogeneous category Alguns pacients tenen un bon pronòstic i altres no.
151 Recerca mèdica translacional en Oncologia Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) comprises at least two distinct diseases Es va poden dividir en dos grups. Les GC b-like te un pronòstic mes bo que les activated b-like cell. Això no es pot distingir amb el microscopi.
Primary mediastinal b-cell lymphoma. Distinct gene expression profile Els pacients tenen característiques determinades.
Es van veure anormalitats en els cromosomes, per tant s’estan comportant com diferents malalties.
152 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene expression profiling recognize three molecularly and clinically distinct DLBCL subgroups S’utilitzen diferents vies oncogèniques. En el GCB es freqüent la translocació de BCl-2..
Burkitt lymphoma Es difícil de diferenciar del diffuse limfoma Gene expression Hi ha signes específics del Burkitt limfoma que ens permet diferenciar-lo del DLBCL.
Molecular versus pathology diagnosis Dels pacients diagnosticats amb microscopi de DLBCL, el 35%b dels casos eren BUrkitt limfoma.
EL limfoma de Burkitt es molt agressiu però tenim un tractament que te molt bona resposta. SI tens un limfoma de Burkitt i et diagnostiquen com DLBCL et donaran un tractament (CHOP) que farà que tinguis menys possibilitats de sobreviure.
153 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene expression profil·les of the major classes of B-cell NHL Això té funció en diagnòstic però també en predicció.
Chronic lymphocytic leukemia Hi ha dos tipus de CLL: - Immunoglobulina hipermutada - No mutada Es seqüencia el receptor de immunoglobulina i es mira si esta mutat o no. Es comporten clínicament diferent. Els mutats tenen mes supervivència.
154 Recerca mèdica translacional en Oncologia 155 Recerca mèdica translacional en Oncologia Discovery of a common gene expression profiling in CLL Els mutats i no mutats tenen una expressió de gens bastants similars però si es comparen podem identificar gens diferents de cada grup. Hi ha 20-30 gens que s’expressen diferent, un d’aquest està molt expressat en els no mutats (ZAP70).
Es va fer un citometria S’utilitza el ZAP70 per diferenciar els dos tipus de CLL.
Mantle cell lymphoma Es molt agressiu. HI ha una translocació entre el cromosoma 11 i 14. Al cromosoma 11 hi ha el BCL que es queda expressat sempre. La ciclina D1 afavoreix el desenvolupament de la malaltia.
156 Recerca mèdica translacional en Oncologia El linfoma de células de manto es uno de los más raros de los linfoma, con cerca de 6% de los casos de no-Hodgkins, con unos 15.000 pacientes actualmente en los E.E.U.U. (el porcentaje parece ser algo más alto en Europa). Debido a que la enfermedad es difícil de tratar, raramente considerada curada, e identificada solo en la década de 1990, la investigación para encontrar tratamientos mejores se persigue activamente por todo el mundo. La supervivencia mediana de los pacientes era cerca de 3 años, pero ahora se estima cerca de los 6 años para los nuevos pacientes. LCM es un subtipo del linfoma de célula linfocito B. Las células de LCM sobreexpresan la proteína ciclina D1 debido a la translocación cromosómica t(11;14)(q13;q32), que afecta a los gen BCL1 e IgH. LCM no es contagioso. LCM implica una rotura anormal y un desplazamiento subsecuente que causa que las células se dividan tempranamente, antes de llegar a ser funcionales para combatir infecciones. Además, las células escapan a la apoptosis y por lo tanto se acumulan en el sistema linfoide. Las células afectadas LCM proliferan en patrón nodular o difuso, con dos variantes citológicos principales: típicos o "blástico".
Cyclin D1 negative MCL variant Hi ha alguns pacients que tenien un patró similar al MCL però que no expressaven CD1. La cilcina D1 es la senyal del mantle. Aquests pacients expressen altres ciclines.
Encara que no tinguin la CD1 son mantle perquè tenen la mateixa expressió e gens i tenen la mateixa poca supervivència. Per tant els hem de diferenciar d’altres limfomes que no siguin MCL.
157 Recerca mèdica translacional en Oncologia SOx11 expressoin is highly specfic for MCL and identifies cyclin D1-negative subtype Es negatiu en el difús, poc en el burkitt limfoma i en el MCL tant en els CD1+ com – tots son Sox11 positius.
MCL prognosis Hi ha pacients que tenen una llarga supervivència encara que normalment la supervivència es baixa. Es va fer un perfil d’expressió de gens per si podem diferenciar entre aquests pacient que viuen mes i els que menys.
Study design Es van aïllar cèl·lules.
Unsupervised: microarray data B-NHL with leukemic involvemnt Gene expression profiling Sox 11 expression in a independent validation series Sox 11 es utilitzat com un marcador de pronòstic CD1+ Sox11- -> bon pronòstic CD1+ Sox11+ -> mal pronòstic Non-nodal type Pathwork Permet saber el origen del tumor, de quijn teixit prové.
158 Recerca mèdica translacional en Oncologia 159 Recerca mèdica translacional en Oncologia Gene expression profiling predicts clincal outcome of breast càncer Multigene prolifing assays for breast patines Mammaprint: 70 gens. S’ha d’envair les mostres Oncotype: 21 gens. S’ha d’enviar les mostres Prosigna assay: PAM50 (50 gens). Es pot fer al laboratori.
How nCounter Assays Work Es compatible amb la parafina. EL teixit esta amb formol i parafina on tenim poca qualitat del RNA perquè es trenca. Aquesta tècnica es compatible amb RNA de poca qualitat.
S’ha dissenyat dues seqüències, una marcada amb biotina i una amb fluorocroms per cada seqüència de 100 pb.
Quantitatiu, compatible amb parafina.
160 Recerca mèdica translacional en Oncologia 161 ...

Comprar Previsualizar