Tema 5 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 6
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Tema 4: TIPUS DE SUPERFÍCIE I ESCALAT Entenem per escalat al fet de treballar a escales superiors pel que fa al nombre de cèl·lules, és a dir, treballar amb una gran quantitat de cèl·lules i per tant, hem de treballar a una gran escala, buscant mètodes que ens ho permetin.
TIPUS DE SUPERFÍCIES Superfícies estàndard Vidre No tots els vidres són iguals ni tenen la mateixa composició i generalment aquells que són monosilicats amb alumini són els que donen millors resultats. El vidre ja té càrregues de manera que les cèl·lules poden créixer adherides a la superfície sense cap problema, és més, afavorim aquesta adhesió.
Se sap, que a mesura que anem reutilitzant el vidre la seva superfície es veu modificada químicament per les cèl·lules i per tant, la capacitat d’adhesió de les cèl·lules va augmentant en el temps, millora. Arriba un moment però que aquesta propietat cau en picat, el vidre deixa de tenir aquestes propietats adhesives.
Plàstic Per evitar problemes de contaminació s’utilitza molts cops el plàstic, especialment el poliestirè perquè és un material d’un sol ús, estabilitzable a gran escala i molt econòmic. El plàstic per ell mateix no té càrregues i per tant, abans de ser modificat en la superfície (existeixen diferents tècniques que permeten aquesta modificació) podem aconseguir que apareguin càrregues en elles el que ens permet controlar la quantitat i tipus de càrrega. Aquestes superfícies modificades són molt estables en el temps i per tant, es poden emmagatzemar durant un bon període de temps. Si no modifiquem el plàstic les cèl·lules creixen igual però sense adhesió.
Acer També es pot fer servir per fer créixer cèl·lules sobre d’ell.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Superfícies amb recobriment biològic Pot ser que determinades cèl·lules en les condicions anteriors no s’adhereixin correctament i per tant, hem de tenir altres superfícies.
Biomatrius Les biomatrius estan composades per una superfície de plàstic a la qual li afegim una molècula biològica com el col·lagen, polilisina o la fibronectina que ajudarà al creixement. El principal desavantatge és que té una vida limitada.
Feeder Layer La Feeder Layer són unes cèl·lules nodridores que no proliferen i per tant, sobre elles podem fer créixer les cèl·lules que ens interessen. Hem de tenir present que aquestes cèl·lules no proliferem perquè nosaltres hem inhibit la seva capacitat i són línies cel·lulars provinents de diferents orígens de manera que per inhibir la capacitat de reproducció el que es fa és irradiar amb rajos X o γ a dosis molt elevades o bé tractar-les químicament. Aquest tractament provoca un gran nombre de trencaments de doble cadena del DNA i per tant, no es poden resoldre el que produeix que les cèl·lules visquin durant 10/15 dies i desprès moren.
Aquestes cèl·lules no nodreixen les altes (la funció de nodrir l’elabora el medi de cultiu) però si que és veritat que alguns factors de creixement es secreten quan hi ha algun tipus cel·lular i per tant, s’apropa més al creixement normal. Si posem aquestes cèl·lules en monocapa, ocupant tota la superfície, sobre elles no podem sembrar cèl·lules que tinguin inhibició per contacte perquè no proliferaran i per tant, aquest sistema no és òptim per aquest tipus cel·lular. Per cèl·lules transformades, cèl·lules mare o queratinosids és molt útil. Si volem que proliferin altres tipus cel·lulars el que fem és posar les cèl·lules de Feeder en un estat subconfluent, que entre les cèl·lules hi hagi espais que puguin ser ocupats per altres cèl·lules.
Quan les utilitzem per cultivar cèl·lules mare aquestes no es diferencien sinó que es mantenen en un estat indiferenciat i per tant, aconseguim que proliferin per tal de tenir moltes cèl·lules mare indiferenciades. Quan volem la seva diferenciació cal que les cultivem sense la capa de Feeder.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Cèl·lules resistents a tractaments enzimàtics Existeixen cèl·lules que no resisteixen els tractaments enzimàtics de manera que s’han inventat superfícies en les quals les cèl·lules es poden desenganxar en funció de la temperatura. A 37 °C sabem que les proteïnes s’adhereixen la superfície mentre que si les posem a 20 °C l’estructura es modifica i per tant, les cèl·lules es desenganxen.
Podem cultivar a gran escala cèl·lules que no resisteixin tractaments enzimàtics (com per exemple amb tripsina) perquè quan les subdividim i subcultivem en plaques diferents es tornaran a adherir i créixer. La metodologia és doncs utilitzar una superfície en que la capacitat d’adhesió de les cèl·lules depengui de la temperatura per tant: introduïm les cèl·lules, aquestes proliferen i ocupen tota la superfície. Quan canviem la temperatura de la superfície la capacitat d’adhesió es modifica i per tant, les cèl·lules queden sobrenedant el que ens permet recollir-les i tornar-les a cultivar.
ESCALAT A l’hora d’elaborar un escalat i treballar a amb un gran nombre de cèl·lules cal que tinguem una sèrie de factors en compte:  Si treballem amb cèl·lules adherents hem d’incrementar la superfície d’adhesió  Limitació de nutrients i mètodes d’eliminació dels productes tòxics de rebuig que generen les cèl·lules  Saber si les cèl·lules reben el suficient oxigen per poder funcionar correctament Estratègies d’escalat Escalat en suspensió Aquest serveix per aquells cultius en suspensió. Senzillament podem posar cèl·lules en una espècie de tanc amb un sistema suau de moviment que mantenim durant la cultivació del medi, al que anirem afegim la barreja d’aire amb el CO 2 que correspongui en el seu interior i medi fresc perquè la producció no s’aturi.
És important mantenir una bona gasificació del medi; en l’esquema observem que aquesta es fa sobre una paret perquè la tensió superficial que es produeix amb les bombolles sobre el líquid provoca la mort cel·lular si es toquen i per tant, hem d’evitar sempre al màxim la producció de bombolles.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Molts reactors a gran escala tenen una estructura de cilindres amb un cilindre intern que és per on entra la barreja d’aire. Les cèl·lules majoritàriament creixen pel cilindre intern i sempre es genera un flux cap a l’interior de l’aire però les bombolles no acostumen a arribar.
Hem de tenir present que no totes els cèl·lules són resistents per créixer en bioreactors sinó que hi ha cèl·lules molt sensibles i que aquest moviment continu no els hi va bé i per tant, no creixen Escalat per cèl·lules adherents Podem incrementar el nombre de cèl·lules que cultivem augmentant el nombre de flascons i la mida d’aquests però a gran escala hem de pensar en altres estratègies.
Roller bottles Aquestes ampolles es posen sobre prestatges que tenen un eix que va rodant a una velocitat determinada. Les cèl·lules que posem allà dins estan en aquestes ampolles i s’adhereixen a la paret. Com que l’ampolla va rodant, cada cert temps les cèl·lules entre el medi queden sucades i tornen a sortir. Per sort, com que el gir es relativament ràpid mai no s’arriben a assecar i per tant, les cèl·lules queden unides per tensió superficial.
Les cèl·lules es van nodrint i hi ha un intercanvi de gasos de manera que els productes de generen es queden en el medi. Quan ha passat un cert temps, retirem l’ampolla i el medi i afegim medi fresc, per tal que les cèl·lules segueixin produint les substàncies d’interès. Aquests són cultius que es poden mantenir indefinidament ja tenen unes filtres que asseguren un bon tamponament de CO2 i bicarbonat.
Podem trobar ampolles que han modificat la seva superfície de manera que, en comptes de tenir una superfície plana tenen una superfície rugosa el que permet augmentar el nombre de cèl·lules adherides.
Multitray i variants És un flascó normal en el qual en lloc d’haver-hi la superfície inferior s’han afegit moltes més superfícies per tant, s’ha incrementat el nombre de pisos i per tant, el nombre de cèl·lules que tenim. Es poden arribar a tenir fins a 30 o 40 superfícies que poden ser introduïdes en els incubadors. El gran problema és el muntatge per tal que arribi el medi a totes les parts però un cop ja està en marxa podem treure tot el medi i introduir medi fresc i per tant, és un sistema que també podem mantenir de forma continuada.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Perfusió amb hollow fiber (fibres buides) Aquest és un dels sistemes amb més futur i dels més utilitzats. Tenim un cilindre que està recorregut en el seu interior per milers de fibres buides; per la part externa de les fibres que el recorren l’omplim de cèl·lules i medi de cultiu i per fora posem medi amb cèl·lules. D’aquesta manera les cèl·lules van creixent i adherint-se a la superfície d’aquestes fibres (són cèl·lules) buides.
Les cèl·lules buides estan connectades a un sistema que bombeja a través d’elles medi fresc de tal manera que la membrana de les fibres està feta d’un material que permet el pas de molècules de baix pes molecular, els nutrients que fan les cèl·lules i per tant, pels canals viatja el medi que les nodreix. Les cèl·lules que estan dins primer proliferen per colonitzar la superfície i després produiran una determinada molècula.
Per tal de mantenir el sistema cada un cert temps hem de buidar el líquid que hi ha i recuperem el medi amb la producció tot afegint medi fresc per continuar-la. Les cèl·lules sempre estan en el medi i a més, el medi que va fluint per l’interior dels capil·lars és el que les va nodrint.
Aquesta tècnica s’utilitza per fer cultius en 3D i per intentar ajustar les condicions in vivo d’alguns tipus cel·lulars o teixits.
Per exemple, podem intentar reconstruir una estructura tridimensional semblant a la que hi ha al moll de l’os aquestes cèl·lules es comporten diferent que si les tractem individualment ja que interaccionen amb l’entorn.
Perfusió amb membroferm És un mètode que no ha quedat ben implantat i és poc utilitzat. Podem entendre aquesta tècnica com un híbrid entre l’anterior i el que presenta diferents superfícies (multitray) tenim cambres diferents on cada cambra té dues membranes que limiten l’espai on van les cèl·lules (verd). Les membranes tant superiors com inferiors tenen porus de diferents mides de manera que per una podem fer córrer els nutrients i per l’altre podem recollir els productes generats. És el mateix principi que anteriorment però en lloc de tenir-ho com capil·lars ho tenim formant làmines, en que les cèl·lules estan entre dos membranes que tenen diàmetres de porus diferents.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T4 Microcarriers Aquests són petites perles que són afegides al flascó on cultivem les cèl·lules en una determinada superfície el que provoca que la superfície de creixement pugui anar augmentant.
Reactors de llit fix o fluid Sabem que en cultivar els cèl·lules les podem mantenir fixes o movent-se en un estat fluid, la tria dels dos mètodes s’elaborarà en funció del tipus cel·lulars. Podem introduir les perles anteriors en un estat líquid i en moviment el que provocarà el xoc entre elles i per tant, si hi ha moltes cèl·lules o aquestes són molt febles pot ser que una gran quantitat mori pels xocs de manera que és un sistema utilitzat en tipus cel·lulars molt resistents.
Opticell Aquest sistema està basat en capces en que la part central està limitada per dos membranes en que pot haver-hi intercanvi de gasos però no de microorganismes (no hi ha contaminació) el que permet mantenir una part central estèril.
Entre les dues membranes podem injectar el medi de cultiu amb les cèl·lules de manera que les cèl·lules creixen a la membrana inferior i superiors el que ens permet tenir el doble de cèl·lules que en un flascó normal i en una estructura molt prima.
El sistema ens permet recuperar el medi i afegir-ne de nou. Té un gran avantatge respecte els altres mètodes i és que podem visualitzar els cultius amb la utilització d’un microscopi invertit. A més, es poden emmagatzemar en incubadors de forma molt fàcil. El principal desavantatge és que és un sistema molt car.
Escalat per cultius en 3D Trobem (estudiarem aquest aspecte més endavant):  Microcarriers porosos. S’utilitzen per mantenir el potencial de diferenciació.
 Esferoides. Agregats multicel·lulars que es formen al cultivar cèl·lules en superfícies recobertes amb agarosa o poly-hema, que permeten que les cèl·lules s’adhereixin entre sí. Útils en estudis d’embriogènesi de diferents teixits, i de teràpia antitumoral.
 Filterwells. Membranes permeables que separen dues fases líquides, que permeten a les cèl·lules epitelials adquirir la polarització, disminuint l'estrès del cultiu en monocapa.
 Esponges de biomatrius, gels en 3D i sandvitxos de biomatrius. Han permès simular l’endometri secretor humà o l’orientació de cèl·lules de múscul llis arterial induïda per estrès mecànic.
6 ...