TEMA 3 – EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES (II) (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Profesor S.C.
Año del apunte 2014
Páginas 21
Fecha de subida 11/09/2015
Descargas 4

Vista previa del texto

TEMA 3 – EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES II L’expressió gènica en procariotes es pot controlar a nivell de transcripció, traducció o de proteïna.
CONTROL TRANSCRIPCIONAL 1. Control per atenuació El control per atenuació és un control en el qual es produeix una terminació prematura de la transcripció. D’aquesta manera, la cèl·lula acaba la transcripció abans de temps de manera abrupta quan no necessita X producte. Trobem dos tips de control per atenuació: a. Dependent de traducció  La zona implicada en l’atenuació s’ha de traduir.
Exemple 1: l’operó triptòfan (aminoàcid que s’utilitza amb molta cura) en E. coli. Aquest operó està format per uns gens que codifiquan per a proteïnes implicades en la síntesi de triptòfan (W). Si ens trobem que la concentració de W és elevada, el transcrit de l’operó és molt curt; en canvi, si la concentració de W és baixa, el transcrit és molt més llarg, ja que conté les regions codificants per als enzims.
Al costat del promotor hi ha un atenuador, que conté la regió líder a dintre (l’atenuador és tota la regió que hi ha entre el promotor i la regió codificant). El pèptid líder o trpL no té cap altra funció que no sigui la de control. Al final de la seqüència d’aminoàcids d’aquest pèptid podem trobar dos codons codificants per W, molt a prop de l’STOP.
En la regió líder hi ha 4 regions palindròmiques (com els loops) entre elles. La regió 1 està continguda dintre de la regió que codifica pel pèptid líder. Les regions 1-2, 2-3 i 3-4 es podran plegar entre elles formant bucles, però no tots signifiquen el mateix: - - Loops 1-2 i 2-3  la RNA polimerasa no es veu afectada perla presència d’aquests loops.
Loop 3-4  és un loop que acaba en molts U. Per tant, és un bucle terminador Rho independent.
Perquè no es formi el loop 3-4, el sistema depèn del ribosoma. La RNA polimerasa genera el mRNA i es forma el primer bucle. Però quan surt el primer RBS, el ribosoma s’uneix a aquest. Si la concentració de W és elevada, el ribosoma no tindrà cap problema per sintetitzar el pèptid líder amb 2 W al final de la seva seqüència. Al acabar, es desenganxaria i es formaria el loop 1-2 i el 3-4; per tant, sols es podrà fer el transcrit petit.
En canvi, quan la concentració de W és baixa i el ribosoma arriba a la zona dels 2 W, li costarà trobar-ne i per tant el loop que es formarà serà el 2-3 i per tant, el 3-4 no es podrà formar i la transcripció de la unitat transcripcional continuarà fins al final.
El sistema del pèptid líder també es troba en els operons d’altres aminoàcids. Per exemple, en el cas de l’operó histidina, el pèptid líder tindrà histidines.
Exemple 2: operó bgl (implicat en la degradació β-glucòsids). Aquest és un exemple de mecanismes dependents de traducció que presenten un antiterminator (evita l’acció del terminador). En aquest cas no està implicat el ribosoma.
Els β-glucòsids són la alternativa als glúcids: quan els glúcids no es poden degradar, es degraden els β-glucòsids per a obtenir energia. Doncs, l’operó bgl es transcriu sols quan hi ha β-glucòsids i però no glúcids normals.
La cèl·lula té un sistema de captació i transport de β-glucòsids. Els sistemes sensors miren el que hi ha fora. Quan no hi ha β-glucòsids en el medi de cultiu, la proteïna BglG (codificada per gen antiterminador) es troba fosforilada en 4 punts (cada monòmer en dos punts) i doncs queda inactiva.
Abans i després de bglG hi ha dos regions de terminació. Si BglG està inactiva, el transcrit arribarà fins a la primera o com a molt, la segona regió de terminació. Per tant, els gens implicats en la degradació de β-glucòsids no es transcriuran.
En canvi, si en el medi de cultiu hi ha presents β-glucòsids, el transportador n’incorpora a l’interior de la cèl·lula i quan entra, la molècula de seguida se l’ha de fosforilar. 1 dels fosfats d’un monòmer de BglG serà traslladat al β-glucòsid i BglG dimeritzarà (dos subunitats amb un P cadascun). Quan BglG es troba en forma dimèrica es converteix en un antiterminador: s’uneix a la zona on es forma el loop per evitar que es formi. Per tant, el transcrit serà llarg i sí que inclourà els gens implicats en la degradació de β-glucòsids.
L’expressió basal és l’expressió mínima d’un gen a partir d’un promotor. Mai l’expressió d’un gen determinat serà 0, sinó que serà mínima, molt baixa. Només serà 0 si no hi ha promotor i per tant la RNA polimerasa no es pot unir. Per tant, la cèl·lula sempre tindrà BglG, i per molt poc que hi hagi β-glucòsids, aquests es podran fosforilar. A més, com BglG pedra un fosfat, s’unirà al primer loop i bglG es podrà traduir, sintetitzant-se d’aquesta manera més proteïna BglG. Aquesta, al perdre també un P en presència de β-glucòsids, es podrà unir al segon loop i l’operó ja es podrà traduir sencer.
Els altres dos fosfats que li resten a la forma dimèrica de BglG serviran perquè la cèl·lula sàpiga si ha de degradar glúcids o β-glucòsids. Si hi ha glúcids, aquests es gastaran abans que els β-glucòsids. Doncs, si les BglG no tenen cap P (s’han perdut per fosforilar els glúcids ¿?), açò indicarà que s’han de degradar glúcids i no β-glucòsids ja que ja no es trobaran el forma dimèrica (sols es troben formant dímers amb un P).
Aquesta regulació és dependent de traducció perquè necessitem que es transcrigui i tradueixi bglG (inclòs a dintre de l’operó) per regular-lo.
b. Independent de traducció En aquest tipus de regulació, la zona implicada en l’atenuació no s’ha de traduir.
Exemple 1: operó Trp de B. subtilis. Aquest és un bacteri Gram+, mentre que E. coli és un Gram-; per tant, és molt probable que tinguin mecanismes diferents de regulació del mateix operó. Aquest sistema d’atenuació també està associat a loops i a 4 zones palindròmiques (a l’igual que en l’operó Trp d’E.coli).
Hi ha una proteïna (TRAP) que reconeix una zona seqüència concreta de la regió líder del mRNA de l’operó. TRAP fa que els loops canvien: - Si s’uneix al loop 2-3, no es podrà muntar el 3-4, i el transcrit continuarà.
Si no s’uneix, el loop 3-4 es podrà formar i el transcrit s’aturarà abans d’hora.
La proteïna TRAP també uneix Trp. Si la concentració d’aquest aminoàcid és suficient, TRAP uneix suficients W i s’activa, s’uneix al mRNA i aborta l’expressió de l’operó. Si en canvi, la [Trp] no és suficient, no s’uniran prou, l’expressió podrà completar-se, i per tant, es sintetitzaran més Trp.
Però una cèl·lula pot passar d’un medi pobre a un medi ric, on hi ha molt W, en qüestió d’instants. Doncs, ara les seves necessitats de W seran molt majors i la cèl·lula, encara que tingui a la seva disposició molta quantitat d’aquest aminoàcid, necessitarà produir-ne més encara. Açò ho fa gràcies a la anti-TRAP, que s’uneix a la proteïna TRAP i evita que no s’uneixi al mRNA. El que detecta la anti-TRAP són els tRNA amb anticodons Trp però que estiguin buits (que no hagin carregat l’aminoàcid encara). Per tant, qui realment mana, no és la concentració global de Trp, sinó la concentració de tRNATrp buits. Açò també passa a E. coli, ja que en aquell cas els ribosomes s’encallaven per culpa de que els costava molt trobar tRNAs carregats amb W.
Exemple 2: La síntesi d’aminoacil tRNA sintetasa Tyr a B. subtilis. Els aminoacil tRNA sintetasa són els enzims que col·loquen els aminoàcids als tRNA. La síntesi d’aquest enzim ha d’estar coordinada a la presència de tRNAs buits. Doncs, ara serà directament els tRNA qui interaccioni amb el mRNA. Quan interaccioni hi ha dues possibilitats: - Si el tRNA està carregat amb l’aminoàcid corresponent es fa el loop terminador i la transcripció continua.
Si el tRNA està buit, no es fa el loop terminador i per tant, la transcripció pot continuar.
La forma de detectar tRNAs buits o carregats és buscant la regió d’interacció del tRNA amb l’mRNA.
Exemple 3: Regulació de l’operó trp de Lactococcus. El mateix que abans.
L’atenuació dels gens aminoacil tRNA sintetases es fa en molts bacteris i amb aminoàcids diferents.
Exemple 4: Regulació síntesi de metionina mitjançant els riboswitch: “Riboswitches are defined as mRNA elements that bind metabolites, or metal ions (magnesium ions, nucleic acid precursors, enzyme cofactors, and amino acid residues) as ligands and regulate mRNA expression by forming alternative structures in response to this ligand binding.” Els riboswitch són interruptors del tRNA. Poden ser un metall, un aminoàcid, un nucleòtid... Si per exemple, és la [Mg2+] qui regula directament la transcripció de cert operó, la resposta serà molt més ràpida que si intervenen altres proteïnes implicades en la transducció de senyals.
Tenim un domini aptàmer que modifica la seva estructura segons la presència o absència de cert compost, en aquest cas, la metionina, la qual provoca que es formi un loop i que no es continuï la transcripció.
2. Control per alarmones i respostes globals Les alarmones són molècules no proteíniques de baix pes molecular que estan involucrades en la regulació gènica: controlen la concentració de certes molècula que intervinen en l’expressió gènica. Tant la síntesi com la degradació de les alarmones estan catalitzades enzimàticament de manera que els seus nivells intracel·lulars poden ser alterats ràpidament en resposta a estímuls externs.
a. (p)ppGpp: (Penta)tetrafosfat de guanosina Al principi, a aquesta se li anomenava “màgic spot” ja que quan s’agafava una cèl·lula i la passàvem d’un medi ric a un medi pobre, la concentració d’aquest compost “màgic” augmentava molt de cop. ppGpp s’uneix directament a la RNA polimerasa canviant el patró de reconeixement dels promotors i modulant l’expressió gènica.
El ppGpp intervé en el metabolisme anabòlic, és a dir, en la síntesi dels compostos que necessiti la cèl·lula: aminoàcids, nucleòtids... El ppGpp modula la resposta astringent: avisa quan la cèl·lula està en crisi. El ppGpp apareix quan una cèl·lula passa d’estar en un medi ric, on pot obtindré quasi tot el que necessita de l’exterior, a un medi pobre on la cèl·lula ha de fabricar-ho pràcticament tot  adaptació a la nova situació.
Les respostes astringents també es disparen en absència del compost d’una auxotròfia (quan no es pot fabricar però sí importar cert compost en cert organisme). Si per exemple, la cèl·lula es auxòtrofa pel W, dispararà la resposta astringent quan eliminem W del medi, ja que la cèl·lula per sí mateixa no el pot fabricar i ara tampoc el pot importar del medi. Doncs, ara es produirà ppGpp i aquest farà dues coses: - Bloquejarà la síntesi de proteïnes per racionalitzar que produir. És a dir, pararà la cèl·lula.
Sintetitzarà els aminoàcids que necessiti, degradarà proteïnes que no necessiti per res, sintetitzarà lípids i nucleòtids, i també controlarà la síntesi de ribosomes per no produir-ne més del compte. Tenim en compte que el 90% del pes en sec d’una cèl·lula d’E. coli són ribosomes  açò es calcula després d’una liofilització (assecament de la cèl·lula).
Cicle del ppGpp Quan falta algun aminoàcid, RelA produeix (p)ppGpp afegint fosfats al GDP o al GTP. Quan tenim estrès cel·lular, perquè falta ferro, fosfat, àcids grassos, carboni o s’ha produït un shock osmòtic SpoT també forma ppGpp. Però quan la senyal d’alarma s’ha acabat, SpoT elimina els P dels ppGpp per tornar a formar GDP i GTP.
A més, si un ribosoma no troba tRNAs carregats perquè la concentració d’aminoàcids és baixa, el tRNA entrarà però el pèptid format en el tRNA anterior no es podrà transferir. Per tant, el tRNA buit sortirà per veure si es pot trobar un altre de ple i el ribosoma s’aturarà. Açò ho detecta RelA, que s’enganxa al ribosoma i comença a produir ppGpp, la qual cosa dispararà la resposta astringent. Doncs, es podran carregar els tRNA quan es carreguen d’aminoàcids i el ppGpp ja no s’unirà al ribosoma.
Mecanisme d’actuació del ppGpp Trobem diversos mecanismes d’actuació: - Directes: o Acció sobre l’accés dels NTPs. El ppGpp és un ribonucleòtid, i per tant pot entrar a dintre de la RNA polimerasa. Però quan ho fa, dificulta la entrada d’altres NTPs i per tant, la velocitat de la RNA polimerasa disminueix. Aquesta disminució de la velocitat fa desensamblar la RNA polimerasa. Doncs, es para la transcripció i en conseqüència la traducció.
o Modulació del reconeixement de la regió promotora. El ppGpp és capaç d’interaccionar amb les subunitats σ de la RNA polimerasa. El ppGpp s’uneix a la proteïna DskA i afavoreix la entrada de torrents de σ que reconeixen diferents promotors. D’aquesta manera es podran afavorir els promotors de gens relacionats amb la síntesi de lípids, aminoàcids, nucleòtids... però no de ribosomes.
- Indirectes: o Increment de la disponibilitat de RNA polimerasa. En situació normal, els promotors forts tindran molta RNA polimerasa i els febles en tindran poques. Però si hi ha pocs aminoàcids, el ppGpp fa com un reset: les RNA polimerases deixaran de fer el que estiguin fent i doncs se’n aniran majoritàriament cap als promotors que ara són forts gràcies a les noves subunitats σ (els que abans eren febles).
o Disminució de la concentració de GTP. Els ppGpp no poden servir per produir RNA, ja que són nucleòtids però contenen massa fosfats. Per tant, la producció de ppGpp gastarà guanines i tot els RNA que comencen amb G (tots els RNA solen començar per G o A excepte alguna excepció) alentiran la seva producció.
 RNA de gens relacionats amb l’anabolisme: comencen per A (no es veuen afectats).
 RNA de gens relacionats amb la síntesi de ribosomes: comencen per G i per tant, la seva síntesi es veu alentida.
o Modulant l’estabilitat de factors. De normal, hi ha subunitats σ que són degradades quan s’uneixen a RssB, una proteïna que incorpora una altra proteïna: ClpXP, la qual s’encarrega de degradar les subunitats σ. Si es dóna aquest cas, certa σ ja no funcionarà i baixarà la seva concentració per mantindré el seu ratio normal respecte a les altres subunitats σ.
Quan es dispara la resposta astringent, s’activa el promotor de IraP, una proteïna que segresta RssB.
Per tant, ja no es degradarà aquesta certa σ i la seva concentració augmentarà i el seu ratio també.
Devem dir que cada σ o cada pool de subunitats σ té la seva pròpia proteïna RssB que controla la seva vida mitjana. Per exemple, si de normal 1/100 subunitats σ és σX, ara podem passar a tenir-ne 20/100.
Però també segons com s’activi el ppGpp, aquesta molècula pot activar proteïnes que segresten RssB per controlar d’una altra manera el ratio de σ.
Com afecta el ppGpp a la RNA polimerasa? ppGpp dificulta la entrada de nucleòtids, però no la tapona. El que provoca açò és que la RNA polimerasa vagi més lenta i en conseqüència de l’alentiment es desensambli. Però açò sols passarà si es provoca un alentiment, si la RNA polimerasa de per sí ja va lenta i l’entrada del ppGpp no fa que vagi encara més lenta, la RNA polimerasa continuarà fent el seu treball ja que no detectarà cap disminució de la velocitat.
El ppGpp també s’utilitza com a senyal d’altres coses: - - Si hi ha pocs nutrients, podrien sintetitzar-se antibiòtics per eliminar els altres bacteris i que els pocs que hi hagin que els pugui gaudir la pròpia cèl·lula.
També pot ser que s’enviï la senyal per a l’esporulació o pel long-term persistence.
A més, les cèl·lules podrien desenvolupar virulència o biofilm (serien cèl·lules molt resistents). La virulència es desenvoluparia perquè els nutrients de l’hoste estan molt segrestats per les cèl·lules del propi hoste. Per tant, el bacteri dispararà o no la resposta astringent segons en quina cèl·lula es trobi. Si per exemple, es troba en una cèl·lula de l’epiteli intestinal no, ja que allà trobarà tots els nutrients necessaris; però, si en canvi, es troba dintre d’un macròfag, si que dispararà la resposta astringent per sobreviure allà, on els nutrients són molt més escassos que en l’epiteli intestinal.
b. cAMP: AMP cíclic L’AMPc és AMP que ha estat ciclat per una adenilat ciclasa. Aquesta és una resposta associada al metabolisme catabòlic (al contrari que el ppGpp): degradació de compostos com aminoàcids, sucres, nucleòtids...
L’AMPc actua en una repressió per catabòlit, en aquest cas la glucosa. Hi ha una jerarquia alhora de degradar els sucres: primer de tot es degrada la glucosa, i quan aquesta s’acaba, es podran degradar els demés sucres. Açò és degut a que la glucosa és el sucre que més rendiment li proporciona (parlant d’E. coli).
Però ha d’haver-hi una senyal que indiqui que s’ha de degradar la glucosa quan hi és i no els altres sucres. Aquesta senyal la proporciona l’AMPc. En un experiment es va veure que: - - Si no afegim glucosa, s’activa l’operó lactosa (explicat més endavant) i s’expressa la β-galactosidasa i augmenta molt la seva concentració.
Si afegim glucosa, l’expressió de β-galactosidasa es para durant uns moments però quan s’acaba de degradar la glucosa, comença una altra volta la seva expressió.
Si afegim glucosa + AMPc, l’expressió de la β-galactosidasa serà pràcticament igual que si no afegim cap dels dos components.
Per tant, quan hi ha AMPc, la cèl·lula entén que no hi ha glucosa i que ha de degradar altres sucres, com la lactosa.
Relació entre l’AMPc i la glucosa Quan un sucre entra dintre de la cèl·lula, s’ha de fosforilar per entrar al cicle de Krebs. A partir del PEP (fosfoenol piruvat) i a través d’unes altres proteïnes, es fosforila la proteïna IIA (de la glucosa) i aquesta li passa el seu P al complex IIB/IIC, que fosforila específicament la glucosa. Però IIA també pot interaccionar amb l’adenilat ciclasa perquè produeixi AMPc si no hi ha glucosa. Per tant, quan hi ha glucosa, IIA li passarà el P a IIB/IIC perquè la glucosa es fosforili i si no, a l’AC per ciclar l’AMP.
Però l’AMPc no pot funcionar per sí sol, sinó que s’ha d’associar amb la CRP/CAP per formar un complex que activi tota una sèrie de gens. El complex CRP-AMPc serà capaç d’interaccionar amb el DNA per doblegar-lo i permetre un millor accés de la RNA polimerasa ja que deixarà els promotors més a la vista o més accessibles. Per tant, el complex CRP-AMPc és un activador transcripcional. Doncs, si no hi ha CRP-AMPc la transcripció d’aquests gens serà basal, però no nul·la.
De fet, podem posar l’exemple de l’operó lactosa, el qual té un CRP-site que facilita l’accés de la RNA polimerasa. El CRPsite es troba a la regió upstream (abans de la regió -35) per activar l’operó. Sol tindre unes regions òptimes (al voltant de -60 o -40), perquè la RNA polimerasa interaccioni de millor manera amb el promotor.
CRP-AMPc intervé en diverses ocasions: - Operons que intervenen en la degradació de glúcids, β-glucòsids, aminoàcids...
Gens de respiració.
Algunes resistències antibiòtiques per dominar l’entorn o comunicar-se entre els bacteris.
Inactivar la síntesi de CRP i AMPc per feed-back negatiu.
Però no tots els bacteris funcionen de la mateixa manera. Hi ha diferents senyals moleculars que donaran la mateixa resposta (primer es degrada la glucosa i després els altres sucres) però en bacteris diferents. Per exemple: - Repressió per catabolit a Bacillus subtilis: la glucosa entra a la cèl·lula de la mateixa manera que a E. coli. Però en aquest bacteri, l’alarmona que s’encarregarà de determinar la presència de glucosa és la FBP (fructosa-1,6bifosfat). FBP + CcpA (proteïna equivalent a CRP) + una proteïna rica en histidina formen un complex amb efecte repressor, és a dir, bloquejarà els gens del catabolisme, ja que la concentració de FGP augmenta quan hi ha glucosa al medi per la seva degradació. És a dir, el complex fa el contrari que CRP-AMPc a E. coli.
- Repressió per catabòlit a Pseudomonas putida: Pseudomonas és un microorganisme respirador de succinats i acetats, la seua font de carboni principal no és la glucosa. El modulador CRC (alarmona) s’encarrega del bloqueig de la traducció de gens de transport d’altres sucres si existeixen en el medi succinat o acetat. Per tant, si hi ha malat o succinat en el medi de cultiu, la cèl·lula no incorporarà altres sucres apart d’aquests dos.
c. Lactones – Mecanisme Quorum sensing De vegades, els bacteris d’un cultiu es comuniquen entre sí amb molècules. Açò està relacionat amb que les cèl·lules es posen d’acord per fer totes la mateixa funció alhora: simbiosi, virulència, competència, conjugació, motilitat, esporulació, producció d’antibiòtics, biofilms... Segons la densitat cel·lular tindrem que: - - Si la densitat és baixa: els bacteris segregaran sempre la mateixa molècula i la concentració d’aquesta serà X.
Si la densitat és alta: la concentració d’aquella molècula serà molt més elevada. Aquesta senyal serà rebuda per les cèl·lules per comunicar-se entre sí. Tindrem cèl·lules receptores i productores/ donadores, i una mateixa cèl·lula pot comportar-se de les dues maneres.
Aquests reguladors entraran a dintre de la cèl·lula i activaran o desactivaran certs gens perquè totes les cèl·lules funcionen igual i que es comportin de la mateixa manera.
Les lactones són només un tipus d’aquestes alarmones. També trobem autoinductors, oligopèptids i altres tipus de molècules.
d. di-c-GMP: diguanilat cíclic La guanina també té una ciclasa específica (diguanilat ciclasa) que la cicla: agafa dos GMP i els uneix entre sí de manera cíclica.
El di-c-GMP intervé en senyals també de motilitat, virulència, formació de biofilms... i inclús en la progressió del cicle de vida de la cèl·lula. Arribaran senyals que modificaran la concentració del di-c-GMP i açò canviarà d’una manera o altra l’expressió de certs gens.
3. Regulons i reguladors transcripcionals Un reguló està format per tots els gens que es troben sota control d’un mateix regulador (diguem-li A). Aquesta regulació pot ser simple (directa) o indirecta, a través d’altres molècules.
Si un dels gens d’un reguló codifica per a un altre regulador (B), els gens del reguló B també estaràn inclosos dintre del reguló A. Un reguló que engloba a l’altre (A) pot anomenar-se moduló o reguló igualment.
A més, si hi ha un estímul que afecta al regulador i fa que variï la seva acció, els gens dels quals es veu afectada la seva expressió per aquest estímul formen l’estimuló. Un estímul pot afectar a diferents modulons/regulons alhora.
També pot ser que diferents estimulons o modulons es solapen entre sí, ja que un mateix gen pot estar controlat per diferents reguladors transcripcionals, que estan afectats alhora per diferents estímuls.
Per exemple, el reguló de LacI el formen els gens lacZ, lacY i lacA (gens de l’operó lactosa). L’estimuló de la lactosa estarà compost pels gens regulats per LacI i altres gens que puguin estar afectats per la presència de lactosa. Un altre exemple és el moduló CRP-AMPc, que controla més coses que l’operó lac. La presència de glucosa o d’AMPc seria l’estimuló global, és a dir, la senyal externa.
Detecció senyals de l’exterior: Sistemes sensors de dos components (sensor i efector) Un component de la paret bacteriana (proteïna o complex proteic), com el transportador de la glucosa (IIA, IIB...), transmet una senyal a un efector, normalment mitjançant una cascada de fosforilacions. També pot ser que s’activi un regulador transcripcional directament. Tant el receptor (sensor) com l’efector poden estar formats per un complex proteic format per moltes proteïnes.
Hi arriba un senyal al complex sensor i aquest modifica l’efector, que transmet la senyal.
Estructures membres sistemes de dos components: és un concepte de dos components que fa referència a la presència de dos mòduls més que de dues proteïnes.
- Estructura canònica  - Altres variants descrites  Reguladors transcripcionals Tenim dos tipus de reguladors transcripcionals: - Repressors: bloquegen la RNA polimerasa.
Activador: augmenta la taxa de transcripció del promotor.
Trobem les regions upstream i downstream: - A la regió upstream normalment s’ancoraran els activadors.
A la regió downstream normalment s’ancoraran els repressors En l’operó lac hi ha un operador. Als operadors abans se’ls considerava com a que sols s’hi unien repressors.
Els activadors s’ancoraven a regions anomenades activation-sites. Però ara, els operadors es consideren regions de DNA on s’uneixen tant activadors com repressors.
Hi ha proteïnes que poden actuar tan com activadors que com a repressors. Actuaran d’una manera o altra segons a la zona del DNA on s’uneixin: upstream o downstream.
Els activadors activaran la transcripció, estimularan l’expressió gènica. També podem travar coactivadors: activadors que actuen amb altres per augmentar l’expressió gènica o perquè si no actuen conjuntament no funcionen. Un activador pot tindre efecte positiu o negatiu (efecte dual), ja que pot activar un gen que codifiqui per un altre activador o per un repressor, o també pot ser que tingui efecte negatiu sobre el gen directament. Per tant, només seran activadors si es situen correctament per doblegar el DNA per deixar més a la vista el promotor per a la RNA polimerasa.
Els repressors en canvi, bloquegen la transcripció: bloquegen el pas de la RNA polimerasa o evita directament que s’ancori al promotor. Pot realitzar un plegament que oculti el promotor o inclús pot bloquejar l’acció d’un activador per provocar l’efecte antagònic d’aquest: anti-activador.
- Efecte directe.
Bloqueig de l’activador.
Repressió d’un altre repressor: efecte positiu.
Tipus de control transcripcional Control negatiu  repressor Control positiu  activador Inducció  inductor El repressor està unit de manera normal al DNA però l’inductor fa que es desancori.
L’activador interacciona amb l’inductor, i ja podrà unir-se al DNA per facilitar l pas de la RNA polimerasa.
El repressor sols interacciona amb el DNA quan el co-repressor fa que canviï conformacionalment. Doncs, ja podrà unir-se al DNA. Estimula la repressió.
L’activador interacciona de manera normal amb el DNA, però quan es troba el corepressor baixa l’expressió gènica.
Repressió  co-repressor Normalment es combinaran els tipus de regulació activador – inductor i repressor – co-repressor, i repressor – inductor i activador – co-repressor (en diagonal). Però també pot ser que per exemple es combinen negatiu i positiu amb inductor, però reconeixent diferents regions de DNA.
Operons bacterians Els operons bacterians poden ser: - Catabòlics: implicats en la degradació de certs compostos per a l’obtenció d’energia. Es controlen mitjançant la repressió per catabòlit (CRP-AMPc).
Anabòlics: implicats en la síntesi de certes molècules. Es controlen mitjançant la resposta astringent (ppGpp).
a) Operó lactosa L’operó lactosa està encarregat de la degradació de la lactosa. És el model d’operó amb control negatiu per inducció.
Està format per tres gens (lacZ, lacY i lacA), sota el control d’un mateix promotor i per tant, les proteïnes es sintetitzen a partir d’un únic transcrit. El gen lacI no formarà part de la unitat policistrònica, sinó que codifica pel repressor del mateix operó.
- LacZ o β-galactosidasa és un enzim que hidrolitza/degrada la lactosa en glucosa i galactosa.
LacY és una permeasa que permet l’entrada de la lactosa a dintre de la cèl·lula.
LacA és una acetilasa que modifica una mica el receptor. No se sap clarament la seva funció ja que no s’ha vist una afectació massa clara si es retira el gen lacA.
Aquest operó presenta un operador, que és la caixa del repressor transcripcional LacI. L’operador pot anomenar-se lacO, però s’ha de tindre clar que no és un gen, ja que no codifica per res.
Normalment, sense lactosa, lacI generarà un repressor que s’enganxarà al DNA. La RNA polimerasa reconeixerà el promotor però a continuació es trobarà amb el repressor i no podrà fer la transcripció. Per tant, la transcripció serà basal.
En canvi, quan hi ha lactosa o un anàleg d’aquest sucre, com l’IPTG, aquests s’uneixen al repressor i li provoquen un canvi conformacional que fa que es desenganxi de l’operador. Per tant, la RNA polimerasa sí que podrà transcriure la unitat policistrònica moltes vegades i es sintetitzaran la β-galactosidasa, la permeasa i la proteïna LacA. LacZ degradarà lactosa fins que aquesta s’acabi de la cèl·lula, i com ja no en quedarà, el repressor es tornarà a enganxar a l’operador i la transcripció tornarà a ser basal.
IPTG és un anàleg de la lactosa no hidrolitzable, és a dir, pot interaccionar amb el repressor però no podrà ser degradat per la β-galactosidasa ni serà reconegut per la permeasa.
A més, no només hi ha un operador, sinó que de vegades, en poden hi haure diversos. En aquest cas, segons els repressors que hi hagi, l’expressió basal serà encara més petita (però mai nul·la). Inclús poden doblegar el DNA perquè la RNA polimerasa no reconegui el promotor.
Podem trobar diferents mutants de l’operó lactosa: - - lac‐1 = LacZ‐  Mutació que fa no funcional a la proteïna LacZ. La lactosa no es podrà degradar.
lac‐2 = LacOc  Expressió elevada de l’operó lac degut a un defecte al punt d’unió del repressor. Hi ha una mutació a la regió operadora i per tant, el repressor LacI no podrà unir-se a l’operador. Per tant, l’expressió de tots els gens de la unitat transcripcional serà molt elevada.
lac‐3 = LacId  Repressor defectiu, no funcional. Tindrà els mateixos efectes que la mutació lac-2.
lac‐4 = LacIs  Repressor insensible l’inductor, el qual no interaccionarà amb el repressor i per tant, l’expressió serà basal (fenotip contrari a la mutació lac-3).
- - lac‐5 = LacZ‐  Mutació polar molt forta al gen lacZ. Si l‘efecte polar és sobre la traducció, aquesta mutació, a part de al gen lacZ també afectarà als que venen darrere. Per tant, les concentracions de la permeasa i del LacA, seran menors que en una soca no mutada, però no seran nul·les.
Si l’efecte polar fos sobre la transcripció, la concentració de LacY i LacA si que serien nul·les degut a que els seus gens no arribarien ni a transcriure’s.
lac‐6 = LacI‐  Mutació àmbar (codó STOP) al gen del repressor. Mateix fenotip que la2 i lac-3.
lac‐7 = LacY‐  Mutació que fa no funcional a la proteïna LacY.
Les soques merodiploids són les que presenten la duplicació d’una part del cromosoma bacterià en un plasmidi. Tenim dos al·lels, que poden ser diferents per mutació en cadascuna de les còpies (no s’ha de confondre amb tindre diverses còpies directes del mateix gen en el cromosoma).
La merodipoidia serà estricta quan l’origen d’una còpia és diferent de la de l’altra còpia: per exemple, la duplicació s’ha aconseguit per la transmissió horitzontal d’un plasmidi que contenia una còpia, de per exemple, l’operó lactosa.
b) Operó Triptòfan L’operó triptòfan és un operó anabòlic en el control del qual intervé el ppGpp. És el model d’operó amb control negatiu per co-repressió. Pot estar controlat pel ppGpp, per atenuació (TRAP, ribosoma...) i/o amb control propi (negatiu per co-repressió).
- Quan hi hagi una baixa concentració de trp, els gens estaran activats per sintetitzar-ne.
Quan hi hagi una alta concentració, el trp s’unirà al repressor i aquest s’enganxarà al DNA per reprimir l’expressió gènica.
Aquest control serà molt fort, ja que es combina amb el ppGpp i el control per atenuació, i per tant l’expressió basal serà molt baixa. Per tant, el promotor està altament controlat, ja que presenta un alt control a diferents nivells. Açò és degut a: - - Es molt car sintetitzar trp, i més si no se’n necessita. Per tant, sols es produirà quan realment sigui necessari.
La regió -35 és una regió molt forta, molt òptima perquè sigui reconeguda per la RNA polimerasa. De normal, l’expressió basal seria molt alta si no hi hagués aquest control tant gran.
És una regió tant forta que inclús s’utilitza per crear promotors sintètics. Per exemple, el promotor Ptac està format per la regió -35 de l’Operó triptòfan i la -10 de l’operó lactosa.
A l’opero trp també podem trobar diferents mutacions, com per exemple: - - trpOC: operador constitutiu trpq: repressor d’alta afinitat. La seua Ka per la regió operador és molt alta. També pot ser que hi hagi més concentració de repressor i que per tant es necessiti més concentració de co-repressor per contrastar-ho, però tindria el mateix efecte.
trpRs: insensible al triptòfan c) Operó arabinosa L’arabinosa es un sucre (acaba en –osa, com la glucosa).
L’operó arabinosa és un operó catabòlic encarregat de la degradació de l’arabinosa, i està controlat d’una banda, per CRP-AMPc. Però també té un control propi: el reguló AraC (regulador transcripcional) conté diferents unitats transcripcionals. PBAD és el promotor de la unitat transcripcional conformada per araB, araA i araD. El reguló AraC està encarat a la degradació de l’arabinosa: conté els gens per incorporar arabinosa al medi i degradar-la al cicle de Krebs.
Normalment, el seu control és positiu per inducció. Però en PBAD, pot ser positiu o negatiu (presenta un control dual).
A més, AraC, també pot controlar negativament la seva unitat transcripcional (control negatiu per co-repressió).
AraC presenta dos dominis: un d’ancoratge a l’arabinosa i un altre d’interacció amb el DNA. Quan la concentració d’arabinosa és mínima, AraC pot dimeritzar i d’aquesta manera bloquejar l’accés de la RNA polimerasa al promotor PBAD; encara que açò tot depèn de la regió operadora. Si tenim dos operadors allunyats per una certa separació, aquest dímer s’ancora i s’estabilitza. D’aquesta manera es forma un loop i les regions promotores queden bloquejades i per tant, la RNA polimerasa no podrà ancorar-se i l’expressió d’araB, araA i araD serà basal.
Però per què AraC controla positivament araE i araFGH? En aquestes unitats transcripcionals no tenim la regió operadora que teníem en araBAD. A més, no és el mateix no activar que reprimir. En aquestes unitats transcripcionals, AraC no s’unirà directament, i per tant, no es formarà cap loop que impedeixi el pas de la RNA polimerasa.
Si la concentració d’arabinosa és elevada perquè hi és al medi de cultiu, aquest sucre interacciona amb AraC, que canvia conformacionalment i per tant l’estructura del dímer canvia. Cada un dels monòmers del dímer serà capaç de reconèixer una regió operadora (per tant, es reconeixeran dues que vagin seguides, les mateixes que abans per formar el loop) del promotor. D’aquesta manera sí que es podrà ancorar la RNA polimerasa per incrementar l’expressió d’araBAD.
En les altres unitats transcripcionals, AraC sí que podrà unir-se i per tant, augmentarà la seva expressió. A més, també augmentarà l’expressió del gen araC per tindre més repressor.
Per tant, quan la concentració d’arabinosa és elevada, AraC quan s’uneixi a PBAD actuarà com a activador, i quan sigui baixa, com a repressor o anti-activador.
Per tant, com hem vist en diferents operons, un mateix promotor pot acumular diferents senyals.
CONTROL POST-TRANSCRIPCIONAL Aquest control es pot donar quan veiem que la concentració de mRNA no coincideix amb la de proteïna. El control post-transcripcional es pot dividir en: - Vida mitjana d’una proteïna.
Control de síntesi proteica.
Exemple 1: Control de la síntesi de les proteïnes ribosomals Les proteïnes ribosomals són aquelles que s’associen al rRNA per formar els ribosomes. Els seus gens s’agrupen en unitats transcripcionals grans: formen clusters de gens associats a subunitats de la RNA polimerasa, factors transcripcionals, tRNAs o gens implicats en la replicació. A més, hi ha diferents còpies dels gens d’aquestes proteïnes però poder-les produir de manera massiva quan es necessiten. Per exemple, en un ribosoma d’E. coli podem trobar: - 22 proteïnes ribosomals (S1 a S22) a la subunitat 30S (petita=S) 34 proteïnes ribosomals (L1 a L34) a la subunitat 50S (gran=L) El control transcripcional d’aquestes proteïnes es duu a terme mitjançant el ppGpp i la resposta astringent. Necessitem molta energia per poder sintetitzar un ribosoma, ja que cal sintetitzar les 56 proteïnes i el rRNA. A més, un 80-90% del pes en sec del bacteri ve dels ribosomes. Per tant, només aturant la síntesi de ribosomes, es poden accedir a molts aminoàcids.
Quan tenim rRNA, les proteïnes ribosomals tenen afinitat per ell i es munta el ribosoma. Però quan la concentració de rRNA és molt baixa o quan el rRNA ja està col·lapsat, les proteïnes ribosomals s’uniran al seu mRNA, ja que també tenen afinitat per ell, però menor que pel rRNA.
S’enganxaran a una seqüència específica propera al RBS que el bloqueja (si s’uniria al RBS es podria unir a RBSs de qualsevol mRNA).
Si de sobte tornem a un medi ric, es sintetitzarà molt rRNA i les proteïnes ribosomals s’enganxaran al rRNA per formar el ribosoma. D’aquesta manera el mRNA queda lliure i ja es por traduir (a més, no cal que es transcrigui).
Exemple 2: Small RNA (sRNA) Els sRNA són RNA reguladors que modulen l’expressió gènica. Determinen la traducció dels transcrits i ajusten la velocitat de degradació dels transcrits.
Hi ha molts sRNA diferents i impliquen molt de control. Són RNA molt petits i funcionals que s’encarregaran de regular l’expressió del mRNA: ajusten quan es tradueix i com de ràpid es degrada.
Presenten una estructura secundaria molt complicada, amb loops i altres estructures. S’uneixen al mRNA i bloquegen algunes de les seqüències senyal. Per exemple, es poden unir al RBS per bloquejar la unió i funció del ribosoma.
Alhora pot induir la degradació del mRNA perquè la cèl·lula, a través d’uns enzims específics, detecta un fragment de RNA de doble cadena, la qual interpreta com que alguna cosa no va bé. Es degradarà sols el fragment de mRNA que s’ha aparellat amb el sRNA o es degradarà sencer. Açò podria provocar un efecte polar molt fort sobre els gens que no han sigut degradats.
Si el sRNA s’uneix sols al RBS (els quals són tots bastant semblants), bloquejarien la traducció de molts gens i per tant, no tindria un efecte regulador sobre els gens específics. El que de veres passa es que el sRNA ocupa també una petita seqüència contigua al RBS: d’aquesta manera sí que és un regulador específic. De vegades aquestes regions poder estar llunyanes al RBS: al final de mRNA.
Segons la interacció (hi ha diferents tipus de plegament) poden tenir tant un efecte positiu com negatiu.
- Negatiu: bloquegen (fent inaccessible la regió del RBS en el mRNA) i degraden el mRNA (estabilitzant estructures secundàries del mRNA regulat).
- Positiu: hi ha mRNAs que de normal generen un loop que amaga el RBS: d’entrada ja es controla ell mateix. Si hi ha un sRNA aquest pot fer que el mRNA pateixi un canvi conformacional i s’alliberi el RBS perquè es pugui donar la transcripció.
Al llarg dels anys s’ha vist que perquè els sRNA interaccionin amb el mRNA necessiten la proteïna Hfq, que permet a la majoria dels sRNA per poder realitzar aquesta interacció. No intervé en tots els microorganismes, però es pensa que poden haver-hi altres proteïnes que facin una funció semblant.
Hi ha sistemes més complexes d’activació que impliquen més d’un sRNA. Per exemple, es va veure que hi havia una unitat transcripcional i un sRNA que augmentava l’expressió del mRNA. Es podria pensar que era un efecte positiu del sRNA però es va veure que era la impossible la interacció d’aquest sRNA amb el mRNA.
El que es va veure que es que la unitat transcripcional tenia un loop que tapava el RBS. Hi havia dos sRNA diferents però molt semblants: el GimY sRNA i el GimZ sRNA. El GimZ sRNA és ràpidament processat per inactivar-lo. GimY sRNA és degradat pel mateix enzim que GimZ sRNA, i per tant si es sintetitza molt GimY sRNA, l’enzim degradarà molt més d’aquest que de GimZ sRNA. Per tant, GimZ sRNA podrà fer la seva funció. No s’assemblen en seqüència però sí en el plegament, que és el que detecta l’enzim encarregat de la degradació d’ambdós sRNA.
Aquest mecanisme és un mecanisme molt car energèticament parlant, però si la evolució ho ha seleccionat serà per algun motiu. Podria ser que l’enzim que s’encarrega de degradar-lo també degrada altres molècules i per això no és millor que l’enzim canviï perquè no calgui el sRNA trampa.
Els sRNA solen generar-se a la regió que degraden, però a part de regular aquesta regió, també poden regular altres gens: solen regular un pool de gens. Molts d’aquests gens no tindran relació amb els de la regió d’on ha sorgit el sRNA.
Per tant, els sRNA no només regulen per a una cosa.
Aquests sistemes solapen amb el sistema de regulons i estimulons. Per exemple, un regulador por regular per a un gen que codifiqui per a un sRNA (doble regulació de transcripció i regulació). Els esquemes poden ser tan complexes com vulguem.
ALTRES NIVELLS DE CONTROL Hi ha molts factors de regulació com podem veure: - - Nombre de copies de l’expressió d’un gen segons la seva posició.
Activitat del promotor.
Associació a atenuadors o repressors.
Estabilitat del mRNA.
Unió del ribosoma.
Estabilitat de la proteïna: si la vida mitjana d’una proteïna és llarga, la proteïna durarà més i podrà fer la seua funció durant més temps.
Estructura de la proteïna i modificacions d’aquesta.
Us del codó: un mateix aminoàcid pot estar codificat per diferents codons degut a que el genoma està degenerat. La cèl·lula té preferència per uns determinats codons. Per exemple, si AAA i ACA codifiquen pel mateix aminoàcid i AAA s’utilitza en un 90% dels casos, açò disminuiria el contingut en GC d’eixa regió del DNA.
El codó UUG codifica per la leucina i s’utilitza molt poc. Si mirem on es troba aquest codó, ens podem adonar que es troben en gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb la virulència (resistència a un antibacterià, flagels, hemòlisi...): és a dir, es troba en gens relacionats funcionalment.
Per tant, si controlem la síntesi de tRNA amb cert anticodó controlarem a la vegada la traducció de les proteïnes que contenen el codó respectiu, i per tant, les proteïnes que tenen certa funció. Aquests gens solen formar part d’un mateix reguló. A més, hi ha gens que codifiquen per a una infecció molt rara i que codifiquen per a tRNAs poc comuns en la cèl·lula i que es necessiten per sintetitzar les proteïnes implicades en aquella infecció.
...