Tema 10. Transformació bacteriana (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 5
Fecha de subida 20/12/2014
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

Grau de Genètica – BMP T-10 Gloria Hidalgo TRANSFORMACIÓ BACTERIANA 1. TRANSFERÈNCIA GÈNICA 2. TRANSFORMACIÓ BACTERIANA Un dels processos més utilitzats per la manipulació genètica de microorganismes (introducció del DNA). En tenim de dos tipus:  Induïda: inclou l’electroporació, la transformació per xoc tèrmic, etc.
 Natural: capten DNA de forma natural (captat del exterior) i incorporen al seu interior.
Ex: experiment de Griffith.
És un procés realitzat tant per gram negatiu com gram positius. Hi ha molt bacteris que incorporen activament (receptor els detecta i l’introdueix) DNA del exterior cap el seu interior.
El punt clau del procés serà com es permet l’entrada a través de la paret cel·lular.
3. TRANSFOMACIÓ NATURAL 3.1. FUNCIONAMENT El DNA exogen sorgeix de la lisis d’altres bacteris (cèl·lules donadores) que alliberen el contingut en el medi (dins del contingut estarà el material genètic). Aquest DNA de doble cadena (dsDNA) es reconegut per uns transportadors de paret que anclen el DNA i l’entren al interior en forma de cadena senzilla (ssDNA). En tant que el sistema de transport reconeix 1 Grau de Genètica – BMP T-10 Gloria Hidalgo el DNA i l’entra amb l’energia de la degradació del enllaços fosfodiésters d’una de les dues cadenes.
Hi haurà microorganismes (sobretot gram positiu) que no seleccionen quin DNA incorporen al seu DNA. Simplement detecten el dsDNA degraden una de les cadenes i incorporen l’altre. Altres microorganismes (normalment gram negatiu) detecten una seqüència determinada de DNA i aleshores activen el sistema de transport.
Igualment ni gram positiu ni negatius, les cèl·lules no sempre estan receptives a incorporar DNA al interior, ja que muntar l’estructura que permet la inserció del DNA costa molt energèticament. Per tant la cèl·lula no ho farà a no ser que pensi que hi haurà molt DNA al exterior que pugui incorporar. L’expressió d’aquest sistemes de transport, per tant, estan determinat per factors ambientals (variant les condicions del medi de cultiu permet que s’expressi o no els sistemes de transport).
L’estat de competència (moment en el que expressa la maquinaria) es pròpia de cada microorganismes, i cada un té un òptim diferent. Està influenciat per paràmetres com: densitat del cultiu, T, pH, font de C, etc.
La cadena ssDNA que s’incorpora activa RecA (reconeix el ssDNA i nucleofilamenta al voltant), de manera que es buscarà recombinació homologa. Si hi ha es pot produir doble recombinació (el DNA que entra es lineal). La majoria de vegades, però el DNA serà degradat per les exonucleases.
3.1.1. Seqüències de reconeixement dels gram – Són seqüències molt petites, i al buscar-lo a la cèl·lula es troba molt més representada que el que s’esperaria per estadística i probabilitat (estudis de combinatòria), de manera que s’està fent una selecció positiva de la seqüència (s‘afavoreix que hi hagi aquestes seqüències). Amés la distància entre aquestes seqüències és equidistant – igual.
El reconeixement i captació del DNA es fa a través de pilis, i a partir dels quals es comença a transformar el DNA. L’entrada del DNA és fa via prot periplasmàtiques permeten la seva entrada al citoplasma.
Els pilis poden ser més o menys llarg en funció de l’espècie.
2 Grau de Genètica – BMP T-10 Gloria Hidalgo 3.2. SIGNIFICAT BIOLÒGIC DE LA TRANSFORMACIÓ NATURAL Hi ha gent que diu que la transformació natural no es res més que un sistema de nutrició per la cèl·lula (trenca enllaços fosfodiésters i obté energia; i s’obtenen nucleòtids alhora). Si per causalitat es dóna recombinació és totalment aleatori.
Altres diuen que el balanç energètic tampoc és tant gran, i amés en alguns casos detectes seqüències específica, és a dir, que la cèl·lula busca DNA molt pròxim al d’ella i per tenir més probabilitat de recombinar.
La presència de DNA en el entorn no és habitual (les lisi no són perquè si), si no que es produeix per situacions d’estrés (antibiòtics, molts macròfags, etc), per tant el DNA que entra és susceptible a recombinació (la cèl·lula busca canvi). El DNA que s’ha llisat por haver mutat i obtingut beneficis, de forma que pot ser incorporat per altres cèl·lules i obtenir el benefici que no li ha servit al altre a temps.
*El DNA que entra no esta subjecte a control dels sistemes de restricció, ja que aquest reconeixia DNA de doble cadena.
4. TRANSFORMACIÓ INDUÏDA El més habitual al laboratori és treballar amb aquest tipus de transformació. El que es fa és generar un estat de competència en les cèl·lules –no seran competents perquè sintetitzi sistema de transport, sinó que s’obliguen a ser competent. Això es fa mitjançant:  Mètodes químics: o Cations bivalents (CaCl2): formació de porus que modifiquen la paret, donantli rigidesa.
o Generació de protoplast (medis hipertònics): cèl·lula bactèria sense peptiglicà, només tenen les membranes citoplasmàtiques. En aquesta situació el DNA té afinitat per la paret i al trobar-se porus entra a la cèl·lula (entra el que sigui ssDNA o dsDNA).
 Electroporació: electrocutant a les cèl·lules (aquest són capaces de conduir corrent si hi ha poques sals en l’aigua), provoques una diferencia de potencial de manera que es generen uns porus a la paret. A través d’aquests es pot translocar el DNA al interior. Al passar una estona les cèl·lules tornen a redistribuir la paret i reparen els porus.
Totes les cèl·lules modificades s’anomenen cèl·lules competents.
3 Grau de Genètica – BMP T-10 Gloria Hidalgo Amb una transformació induïda o artificial, el DNA que entra és qualsevol del medi:  dsDNA: activa els sistemes de modificació (“esto es raro y posiblemente malo”). Si es DNA lineal, per estabilitzar-lo s’ha de integrar per recombinació.
 DNA circular: esta més defensat de les exonucleases (que ataquen extrem 5’). Aquest es podria mantenir de forma extracromosòmica si té origen (perquè es transmeti per herència vertical amb replicació) o es podrà estabilitzar si recombina amb el sistema bacteris o si té maquinaria pròpia per la replicació.
Si es circular només amb un lloc de recombinació (recombinació simple) es suficient perquè s’incorpori en el cromosoma.
4.1. PROCEDIMENT HABITUAL 4.1.1. Mètodes químics En el cas del CaCl2 es posa molta concentració d’aquest catió i es col·loca amb la cèl·lula. Es deixa una estona (depèn del microorganisme), s’elimina el CaCl2 i es trien els que tenen el catió a la paret. Tot això en un medi sense moltes sals: glicerol i congelats.
Procediment El fet de tractar amb CaCl2 provoca que les cèl·lules tinguin la paret molt rígida: Ca2 s’adhereix amb la membrana interna (molt rígida), cosa que provoca contacte amb membrana externa, produint porus –es fusionen les membranes al ajuntar-se.
Aleshores es col·loca DNA exogen (carrega negativa) que s’atrau amb el Ca2 (carrega positiva), de manera que el DNA s’adhereix a la superfície de la cèl·lula i intenta entra per interaccionar amb el catió – no pot entrar perquè és molt rígid.
Tot seguit es fa un xoc tèrmic a 42ºC per donar fluïdesa a la membrana. De manera que permet l’entrada del DNA al interior de la cèl·lula (com més gran és el DNA més difícil serà que entri).
Al treure el calci i el DNA que hagis incorporat ja esta al interior.
S’obtenen 109-8 colònies.
4 Grau de Genètica – BMP T-10 Gloria Hidalgo 4.1.2. Electroporació El voltatge que li posem a les cèl·lules és molt alt (es fa dins d’unes cubetes: té dos paret d’elèctrodes metàl·lics i es col·loquen les cèl·lules en mig). Abans s’han de netejar rentant les sals que hi ha al cultiu, perquè aleshores són les cèl·lules les que conduiran el corrent elèctric.
Es una mica menys eficient: 10 10-11 L’alt voltatge aplicat produeix la permeabilitat transitòria de la membrana. Per tant es creen porus a la paret degut a l’establiment d’un camp elèctric usant com a element conductor les pròpies cèl·lules.
Per cada microorganismes s’ha d’ajustar el paràmetres (concentració de cèl·lules, voltatge, capacitància, resistència, temps,etc). És difícil posar a punt el sistema de electroporació.
4.2. FACTORS QUE AFECTEN A LA TRANSFORMACIÓ INDUÏDA  Mida: més mida més difícil que entri DNA  Puresa DNA: DNA circular sense tall es mantenen més bé. Si tenen discontinuïtat poden ser eliminades per les exonucleases.
 Estat del plasmídic: poden estar molt plegat o no desplegats (més difícil els no plegats)  Estat de les cèl·lula  Temps d’expressió genotípics: temps suficient perquè s’expressi el gen i puguem diferenciar el que ens interessen.
 Catió utilitzat per l’estat de competència. Específic segons l’espècie.
Consideracions final: s’ha de ser molt conscient de que estats posant, ja que si ho alliberes al exterior pot córrer.
5 ...