tema 5 (2) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 3
Fecha de subida 26/06/2017
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irradiación/desonización está excitado y lo que se produce es una separación en campo eléctrico. Se tiene un tubo vació con la muestras y nos vamos encontrar que en este tubo a vacío acoplado a las placas se produce un desplazamiento eléctrico dependiendo de la carga eléctrica y del tamaño molecular. Los diferentes fragmentos van a presentar un tiempo de vuelo (TOF), esto determina que unas moléculas pasen más rápido o menos. Con un sensor Laser los diferentes fragmentos van a desarrollar picos dependiendo de la carga eléctrica. Este sensor acoplado al tiempo de vuelo va a recoger un perfil de las diferentes muestras. Un exceso de radiación fragmenta el DNA por lo que el perfil que sale al final no se corresponde con la muestra real, si se produce un déficil no adquiere la magnitud de carga suficiente por lo que hay una lectura ambigua. La clave está en encontrar condiciones de ionización y desortización adecuadas sin destruir la molécula de DNA MINISECUENCIACIÓN (SNaPShot) En realidad es una estrategia de Multiplex. Es una estrategia de análisis simultáneo de diferentes SNPs del genoma y lo que se hace es una simple simplificación, de ahí lo de mini secuenciación. Es una secuencia de coamplificación. Es una secuencia de screening poblacional.
Amplificación vía PCR, va a acotar de lo diferentes SNPs la región génica que contiene al SNP.
Se diseñan primers específicos. En el diseño de la primera etapa el diseño de los primers va a determinar una PCR mix. Cuantos más SNPs mayor dificultad de las condiciones consenso de la amplificación (que permita la amplificación eficaz de las regiones génicas que contienen estos SNPs). Tengo ya el producto amplificado.
Se va a efectuar una secuenciación puntual. El SNP por ejemplo con dos variantes alélicas y está en la posición 230. Secuenciación puntual vía PCR. Una vez que se ha producido la amplificación entonces en una segunda etapa se diseñan nuevos primers. Entonces en esta segunda etapa se diseñan nuevos primers de manera que el primer en posición 3´se puede elegir la posición, pero el de la región 5´llega hasta el nucleótido 229. Por lo consiguiente el primer que diseño acaba en la base anterior en la posición a donde se encuentra el SNP. El primer que diseño se va a incorporar a un ligando fluoregénico (TET; ROX; TAMRA; HEXA), van a presentar una actividad fluorescente diferente uno de otro dependiendo del ligando que incorpore en el marcaje terminal. Entonces se va a efectuar una PCR mix. En la PCR tendré que añadir cloruro de magnesio, un tampón adecuado para la amplificación, DNA polimerasa y nucleótidos. Se emplean dideoxinucleótidos que tienen la virtud de que una vez que son incorporados se bloquea la elongación del DNA. Esos dideoxi van a estar marcados cromogénicamente. Al incorporar en la mezcla de reacción estos dideoxi el primer llega hasta la posición 229, y si se efectúa ahora una PCR va a empezar a elongar desde la dirección 5´a la 3´. El primer nucleótido que incorpora va a ser un dideoxi por lo tanto en la posición 230 incorporará el nucleótido correspondiente pero será un dideoxi (ddNTP). Si la posición 230 es una citosina el primero que incorporará será una guanina, y ahí se para la elongación. Vamos a tener todo el fragmento hasta la posición 230, pero a partir de ahí se bloquea. Si incorpora la guanina, que a lo mejor tiene color azul, por consiguiente va a dar un fragmento cromogénicamente activo de color azul. Esto indica que el primero que incorporó fue la TEMA 5: SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISMS) 5 guanina, así podemos distinguir la variante alélica correspondiente a C. Si por el contrario tengo la adenina, se efectúa lo mismo pero esta vez va a incorporar timina, pero dará un fragmento de color amarillo (es el que lleva la timina), por lo tanto estamos hablando de la variante alélica que tiene A Importante: incorpora el complementario, no el que presenta la variante alélica Los primers y los ddNTPs no incorporados se tienen que eliminar de la PCR mix una vez completada la amplificación con fosfatasa alcalina (SAP), que limpia lo que corresponde con los ddNTPS y los primers. Necesita un tiempo determinado (incubación) y un tampón y temperatura óptima. La fosfatasa alcalina va a romper los enlaces y la consecuencia final es la eliminación de todos los productos de interferencia. Ahora al final tengo los productos amplificados limpios, lo que es clave es el color (no se sabe el tamaño). Una vez que tengo la PCR limpia se efectúa una electroforesis capilar La velocidad de migración electroforética va a depender del tamaño total del producto amplificado.
La detección tiene que ser cromática para saber que nucleótido se ha incorporado y deducir por consiguiente el nucleótido complementario. Existe un rayo láser que se va a activar en función del tipo de fluorocromo que hayamos incorporado, y esto va a dar una imagen según los colores (cromáticamente activa). Los diferentes fragmentos tienen un color específico, esto nos indica cual es la base nucleotídica incorporada. Lo que me permite distinguir es que ddNTP se ha incorporado y por consiguiente se sabe cual es el nucleótido que se corresponde con la variante alélica, en función del color Esto permite que con una batería baja de fluorocromos podamos analizar varias SNPs simultáneamente porque se le asignan tamaño de amplificación diferentes, y esto depende del diseño de los primers La electroforesis capilar a cada fragmento va a asignarle un tamaño y así se cual variante alélica corresponde en cada caso. Esto determina que en un electroferograma podamos tener picos de diferente color de movilidad electroforética diferente. Si no aplicamos la fosfatasa alcalina los ddNTP que están libres se va medir fluorescencia por lo tanto puede confundir la lectura (ruido/fluorescencia de fondo) La estrategia de minisecueciación va a permitir screening. Cuando hablamos de SNPs estamos hablando de un número de 20 millones. Hay que desarrollar técnicas de análisis masivo.
Permite barajar un amplio nº de SNPs del genoma humano en estudios de screening clínico, identificación de grupos de riesgo, biodinámica de las poblaciones humanas, es decir en análisis simultáneo de una batería amplia de SNPs.
Esta es una técnica usada por: - Fiabilidad Permite barajar un amplio número de SNPs del genoma humano en estudio de screening clínico, identificación de grupos de riesgo… TEMA 5: SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISMS) 6 MICROARRAYS (BIOCHIPS) Es un paso más allá en el análisis masivo, que está basado en técnicas elementales como las técnicas de miniseceunciación o las técnicas ASOS Los biochips no es una estrategia metodológica nueva. Va a ser una aplicación práctica de estrategias metodológicas que hemos vista, MALDI TOF y ASO.
En una pequeña placa se pueden albergar 96 pocillos donde cada pocillo corresponde a una muestra independiente. Tengo la posibilidad de analizar cientos o miles de individuos simultáneamente. El screening puede ser aplicado tanto para número de individuos como para el número de SNPs (20 millones), análisis simultáneo Son estrategias de optimización que va a permitir dar un paso de gigante en lo que es el proyecto genoma humano. Ya tenemos la secuencia, pero la pregunta es cual es el impacto biológico de una secuencia nucleotídica, en el campo de la expresión biológica (biología celular) y se podrá entonces entender los diferentes caracteres de la especie humana Hap Map  significado fisiológico/biológico Son el instrumento estrella a la hora de poder abordar un amplio número de SNPs, en un amplio número de individuos Los principios metodológicos son MALDI-TOF, ASO y minisecuenciación. Son sistemas semiautomatizados Necesitas un DNA altamente purificado y tienes que decir que secuencias quieres analizar, el diseño de los primers y el diseño de la PCR, el resto lo hace el robot La variabilidad alélica puede llevar a casos clínicos, estamos hablando entonces de grupo de riesgo que tienen implicaciones clínicas La perspectiva final del proyecto genoma es la biología de la célula porque es la que da el significado biológico, fisiológico y anatómico También queremos ver la expresión disfuncional, porque algunas variantes de SNPs implican algunos grupos de riesgo para ciertas patologías. La biología de la especie es el punto clave porque es el que permite entender el significado biológico, fisiológico y anatómico.
    Secuencia específica Hibridación: astringencia Reacción cromo-fluorogénica Ambigüedad: adscripción fenotípica TEMA 5: SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLIMORPHISMS) 7 ...