Tema 4: Genoma models d'estudi (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 16
Subido por

Vista previa del texto

Tema 4: Genoma de models d’estudi Què fa a un organisme experimental un bon model? (6) - - Fàcil manteniment en el laboratori: no presenta dificultats ni és perillós a l’hora de treballar, no requereix condicions especials per al seu creixement i en cas que escapi del laboratori no hauria de presentar contaminacions importants. Molts animals biològicament interessants fallen en aquest criteri, ja que són difícils de fer créixer en un laboratori en quantitats suficients per a la investigació.
Que puguin establir línies homozigòtiques pures: això té gran interès quan volem fer modificacions genètiques, per poder observar canvis necessitem que els organismes siguin homozigòtics.
Les mutacions poden ser fàcilment induïbles i reconegudes: per exemple enginyeria genètica, per extreure gens i veure què passa (estudis de funcionalitat).
Producció de moltes cries en relativament poc temps: permetent així a l’investigador detectar mutacions fàcilment, és preferible que l’organisme sigui petit.
Clonatge senzill: que els gens puguin ser clonats per procediments estàndard i que els gens clonats puguin ser re-introduïts dins de l’organisme  manipulació genètica relativament senzilla.
Que desperti interès en altres científics Per a què serveixen? - - - Estudi propietats universals dels organismes: processos de meiosi, diferenciació, secreció, transcripció, translació, replicació, mutacions, etc: per conèixer els principis bàsics de la biologia molecular, els quals són tots iguals en tots els organismes Estudi propietats específiques de taxonomia: perspectiva en evolució, organismes model ens han proporcionat les eines moleculars i genètiques per poder considerar qüestions experimentals que són comuns en tot el grup filogenètic: hi ha unes propietats específiques de taxó, per exemple, Drosophila melanogaster serveix per a l’estudi d’altres insectes, quan usem aquests organismes per comparar desenvolupaments biològics, parlem de evo-devo.
Estudi de propietats específiques d’espècie: el que fa una espècie diferent en morfologia, comportament, hàbitat, etc, s’estudien els processos que fan dues espècies d’un mateix gènere diferents.
Donar informació sobre els humans: s’usen els coneixements que obtenim per conèixer la biologia humana i les seves deficiències.
Models eucariotes més corrents: genomes seqüenciats i accessibles en bases de dades - Saccharomyces cerevisiae: primer genoma d’eucariota seqüenciat.
Atractives pel seu ús en la indústria de la cervesa, perquè són eucariotes unicel·lulars que poden créixer en grans quantitats i a més perquè poden créixer com a diploides o haploides, podem induir aquesta variabilitat segons el que ens interessi estudiar: - En un medi pobre en nutrients  inducció formació ascos per part dels diploides  secreció espores En un medi ric en nutrients  inducció conjugació espores obtenció cèl·lules diploides Des que es van definir els requeriments nutricionals les mutacions que eviten la síntesi d’alguna molècula clau són fàcils d’usar i identificar, aquestes mutacions es coneixen com auxotròfia, es tracta de mutacions en les quals l’absència d’un producte causa l’impediment del creixement del llevat. Les auxotròfies són útils com a marcadors genètics, un exemple típic és ura3.
El cultiu es fa en plaques d’agar, tot i que també es poden fer créixer en suspensió, en un parell de dies podem observar colònies.
Alta capacitat de recombinació homòloga: “gene targeting”: si eliminem un gen el procés s’anomena knock-out, si volem posar un gen d’interès haurem d’inserir-lo en una zona que no sigui vital (majoritàriament en URA3, afegirem uracil al medi i podrà créixer) Un exemple de procés fonamental que s’estudia amb el llevat és el transport de proteïnes a partir de l’anàlisi genètic: Les cèl·lules eucariotes es caracteritzen en diferents components cel·lulars o orgànuls amb diferents funcions. Per poder dur a terme aquestes funcions, ha d’haver diferents proteïnes localitzades de forma apropiada en l’orgànul correcte, la distribució particular de proteïnes és característica de l’orgànul. Les proteïnes es sintetitzen en el ribosoma, el qual està associat al reticle endoplasmàtic rugós, des del RER, les proteïnes són transportades a altres parts de la cèl·lula inclòs l’aparell de Golgi, els lisosomes i la membrana plasmàtica. Aquest procés de transport de proteïnes és fonamental en cèl·lules eucariotes.
Proteïnes diferents tenen característiques que les dirigeixen a localitzacions particulars (seqüències senyal o modificacions post-traduccionals com per exemple la glicosilació). Tot i així, han d’haver unes proteïnes que controlin aquest tràfic, les quals reconeixeran els senyals moleculars i distribuiran les proteïnes al compartiment correcte. La majoria de proteïnes encarregades de la classificació i la secreció de proteïnes que són comuns en les cèl·lules eucariotes s’han identificat en aquest llevat. Els estudis s’han realitzat en llevats que fan una classificació incorrecta de les proteïnes.
En la imatge podem veure un mètode per identificar gens involucrats en el tràfic de proteïnes: A. Trobem una proteïna de fusió formada per carboxipeptidasa Y (CPY) i invertasa. CPY es troba normalment en vacuoles mentre que la invertasa acostuma a ser secretada per les cèl·lules i digereix la sacarosa.
Es fusionen els extrems N-terminal de la invertasa amb el C-terminal de CPY.
B. Classificació normal: si es produeix fusió de proteïnes, CPY dirigirà la proteïna de fusió a les vacuoles, com a resultat d’aquesta localització, la invertasa no és secretada a l’exterior de la cèl·lula i la cèl·lula no pot créixer en un medi amb sacarosa C. Classificació mutant: una mutació que altera la proteïna de fusió enviarà aquesta a la membrana plasmàtica abans que a la vacuola, serà secretada fora de la cèl·lula i aquesta podrà viure en presència de sacarosa.
Estem estudiant CPY i la porció de la proteïna de fusió que ens proporciona la selecció genètica és la invertasa.
S’han trobat centenars de mutacions que afecten en la classificació de proteïnes i s’han localitzat d’aquesta forma, aquestes mutacions s’assignen a diferents gens per tests de complementació: actualment es coneixen 40 o més proteïnes de classificació de vacuola.
Es pot introduir DNA dins els llevats per transformació usant electroporació o xoc osmòtic, introdueixen DNA forani amb molta facilitat, el que comporta un gran avantatge pels llevats. La forma d’introduir aquest DNA dependrà de l’aplicació experimental. Molts dels vectors de transformació estan dissenyats per a ser capaços de créixer en E. coli o en el llevat, i tenen marcadors seleccionables apropiats per a cada hoste. El creixement dels bacteris proporciona una quantitat suficient de DNA per dur a terme els experiments en el llevat. Aquests vectors de transformació es coneixen com vector llançadora, ja que poden moure entre els bacteris i els llevats. Un llevat pot tenir fins a 20 plasmidis dins i aquests es secreten a l’atzar en la mitosi.
Els vectors es dissenyen amb una gran homologia amb la seqüència de URA3, de forma que en la selecció estarem buscant mutants auxòtrofs, que són els que hauran inserit el gen d’interès perquè no presenten enzims que degraden URA3 i en conseqüència moren en un medi on hi ha uracil present. També es poden seleccionar a partir de resistència a antibiòtics.
Limitacions: la senyalització extracel·lular és limitada ja que és un organisme unicel·lular, és un genoma molt dens en el qual els centròmers usualment són petits (???) i pot ser que no presentin microRNAs Base de dades: http://www.yeastgenome.org/ - Caenorhabditis elegans: viu en plaques d’agar untades amb E. coli¸ s’arrossega per la superfície i es menja els bacteris. Són aproximadament de 1 mm de longitud i es poden observar fàcilment sense un microscopi, tot i que s’usen microscopis dissectors. És morfològicament simple. 6 cromosomes  105 Mb  18500 gens.
S’han definit moltes línies cel·lulars concretes, a partir de poques cèl·lules desenvolupa tot el sistema nerviós i aquestes connexions estan molt definides i ens han ajudat a estudiar tots els processos degut a la seva simplicitat, els hermafrodites poden autofertilitzar-se i en conseqüència donar lloc a soques homozigòtiques, hi ha dos tipus de sexes: hermafrodites (AA:XX) que es converteixen en mascles quan perden un cromosoma X (AA:X). En cas de fer un creuament d’hermafrodites i mascles, obtindríem 50% de cadascun.
Per fer transgènics, s’insereixen moltes còpies de DNA de doble cadena en les gònades i una de les característiques del cuc és que pot mantenir molt de temps aquest dsDNA com una seqüència extracromosomal (array). Resulten molt útils per silenciar gens, però no podem fer una integració dirigida ja que manquen de la característica de S. cerevisiae d’una alta freqüència de recombinació homologa.
La majoria de mutacions usen 2 marcadors: el moviment del cuc (mutacions no-coordinades (unc) que afecten en el moviment del cuc per la placa) o la seva morfologia (les mutacions dumpy (dpy) donen dom a resultat cucs curts i grassos).
Les limitacions que té aquest organisme model són que no presenta un cultiu de teixits establert, el gene targeting és dificultuós i hi ha diversos gens amb transcrits poligènics.
Base de dades: http://www.wormbase.org/ - Drosophila melanogaster: mosca de la fruita, és el segon organisme per ordre de complexitat. 4 cromosomes  170 Mb  13.750 gens.
És un organisme que creix fàcilment en laboratori, en el qual els fenotips són vistosos. Cal tenir en compte que fa gairebé 100 anys que s’està estudiant aquesta mosca i que hi ha un gran ventall de línies mutants. Reordenaments possibles (??).
Per tal de fer transgènics, s’usa l’element P, aquest és un transposó i, com hem vist al Tema 2, aquests s’insereixen en el genoma a l’atzar. Aquest element P està format per 4 exons i és actiu en la línia germinal.
En aquest element P trobarem el gen de la transposasa i les LTR (Long Terminal Repitions) que aquest enzim reconeix, aquest element P presenta diferents splicing depenent si es tracta d’una cèl·lula germinal o una somàtica, en una germinal, el splicing donarà com a resultat una transposasa complerta, mentre que en les cèl·lules somàtiques el resultat del splicing serà una transposasa reprimida.
En A trobem el fragment P complert, aquest presenta 4 ORF (ORF0-ORF3) i les repeticions invertides en els extrems (indicades amb fletxes vermelles). En la línia germinal, els introns són escindits i com a resultat queden els 4 exons units, donant com a resultat la transposasa activa. En les cèl·lules somàtiques, l’intró que separa ORF2 de ORF3 no s’escindeix, i el resultat d’aquest splicing és una transposasa inactiva  aquest producte reprimeix la transposició.
En B es mostra com l’element P es pot usar com a vector de transformació, els exons del transposó són eliminats i són reemplaçats per un gen que ens interessa introduir en el genoma de la mosca, aquest està en color blau clar, les LTR es mantenen en els extrems, quan aquest element P és inserit en la mosca, no es pot moure per sí sol (no presenta el gen de la transposasa, l’hem escindit, i a més les mosques de laboratori no presenten aquest element per evitar que la transposasa canviï de lloc en el genoma i hi hagi un augment de la variabilitat  únicament el trobem en mosques salvatges), però es pot moure a partir d’una transposasa activa que trobarem en un altre element P. La integració serà a l’atzar!.
En les glàndules salivals trobem els cromosomes politènics, aquest són fàcilment visibles, tenen una funció desconeguda però poden ser útils en experimentació.
Les limitacions de Drosophila melanogaster són que no podem dur a terme gene targeting (tampoc knock-out)¸ ja que les introduccions són a l’atzar i a més, en mascles no hi ha recombinació homòloga.
Base de dades: http://flybase.org/ - Arabidopsis thaliana: té més densitat genètica que la mosca, es creu que hi ha famílies de gens que han patit duplicacions al llarg de l’evolució. Es poden auto-polinitzar, de forma que podem obtenir línies homozigòtiques pures (com C. elegans), presenta elements transposables propis (com D. melanogaster): MITEs (Miniature Inverted Repeat Transposable elements) i MULEs (Mutation Like Transposable Elements).
Tenen capacitat de silenciar gens externs com a mecanismes de defensa (estudis sobre la regulació de l’expressió gènica). Els inconvenients és que no tenen recombinació homòloga: no podem fer integració dirigida d’un gen d’interès.
Agrobacterium tumefaciens: en simbiosi amb la planta, pot integrar un tros del seu plasmidi a l’atzar. Amb enginyeria genètica substituïm el tros que s’integra per el nostre gen d’interès. S’integren a l’atzar (mecanisme desconegut), obtenim transgènics però sense integració dirigida.
Hi ha molts gens redundants: si aconseguim modificar un dels molts gens, els altres supliran la seva funció. És difícil aconseguir estudiar la funció d’un gen.
- Mus musculus: va divergir dels humans fa uns 75 milions d’anys, és molt proper i diferent a la vegada. La mida del seu genoma és similar a la dels humans:3x109 bp  60.000 - 100.000 gens (com en humans). El 99% d’aquests gens s’estima que són ortòlegs en humans.
Hi ha diversos mètodes per tal de fer transgènics, el més usat és el de recombinació homòloga en cèl·lules mare d’embrió, aquestes s’extreuen d’un embrió i són inserides en un blastòcit, de forma que obtenim animals transgènics mitjançant gene targeting podem inserir gens i els podem interrompre de forma dirigida. A més, els fenotips són fàcilment observables, podem trobar canvis en el color del cabell. Una gran avantatge respecte tots els altres organismes model és que es pot comparar amb gairebé totes les àrees dels humans.
Base de dades: http://www.informatics.jax.org/ En aquesta imatge poden veure l’ús de 3 d’aquests organismes model explicats (S. cerevisiae, C. elegans i D.
melanogaster) per l’estudi de malalties humanes. Els gens implicats en una malaltia humana no tenen perquè provocar una malaltia en els organisme model, però ens poden proporcionar dades mitjançant l’estudi de com es relacionen amb altres gens, és a dir, quan s’expressen, entre altres coses.
Aquestes 5 models que hem vist estan totalment seqüenciats, degut a la facilitat actual de seqüenciació, cada cop trobem més organismes que poden servir com a model (M. mulatta  93% similitud humans), . Cada organisme té els seus avantatges. No tots es treballen igual.
Projectes genoma animals: http://www.intlgenome.org ...

Comprar Previsualizar