05.3. Metodologies útils a la fase de registre (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura Toxicologia
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 28/04/2016
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Jon_Snow 121 5.3 METODOLOGIES ÚTILS A LA FASE DE REGISTRE Quan ja tenim un candidat a medicament à cal seguir una metodologia normativa oficial: Fase pre--clínica. FASE PRE--CLÍNICA Abans de començar l’assaig clínic hem de donar resposta a les següents preguntes: • Quina és la dosi que produeix efectes tòxics en animals? • Quina és la dosi que no produeix efectes tòxics en animals • Són els animals models versemblants per predir la toxicitat en l’home? • Quins són els signes i la durada dels efectes tòxics? • Són diferents desprès d’una dosi única o de dosis repetides? • Són reversibles? • Quins són els òrgans o sistemes diana? • Era d’esperar el tipus de toxicitat observada en relació a les característiques químiques? • Es produeixen metabòlits tòxics? • S’ha observat adaptació als efectes tòxics observats? Abans de l’assaig clínic en humans es demanaven una sèrie de coses diferents en cada país. Actualment es va crear una associació, la ICH (International Conference on Harmonisation), que descriu quins assajos i quan s’han de fer en cada moment (com s’han de fer ho diu la OCDE). No és una llei, però se’n sembla molt. ZOOM A ALGUNS ESTUDIS QUÈ CAL ESTUDIAR? • Relació dosi---resposta • Dosi maximal sense efectes tòxics (NOAEL) • Marge terapèutic en l’espècie estudiada o Dosi maximal/Dosi terapèutica o Valoració risc/benefici • Identificació dels òrgans diana • Reversibilitat dels efectes tòxics (grup especial d’animals) EN QUINES ESPÈCIES ES FA? Cada assaig s’aplica a unes espècies diferents (rossegador: rata, ratolí… conill no). La ICH exigeix que com a mínim es faci en 2 espècies diferents: 2 mamífers, dels quals 1 sigui rossegador i l’altre no. Aquest han de ser suficientment diferents. Jon_Snow 122 Es fa en 2 espècies per tal de poder estar més segurs de que allò serà segur per humans, tot i que mai podem estar 100% segurs. Cal seleccionar les espècies en funció de les característiques cinètiques i metabòliques que tinguin, i que siguin similars a les de l’home. Característiques: --- S’intenta reduir el nombre d’animals utilitzats: 10---20/sexe/dosi en rates i ratolins; 6---8/ sexe/dosi en gossos. --- Administració: via similar a l’exposició humana, freqüència diària, 3nivells de dosi (estudi previ aproximatiu per saber quants nivells de dosi són necessaris) + control negatiu. o Nivell de dosi Alta: efectes tòxics i mortalitat d’un 10% o Nivell de dosi Mitjana: mitjana geomètrica entre l’alta i baixa. o Nivell de dosi Baixa: lo ideal és trobar una dosi superior a la terapèutica (2 o 3 vegades la dosi terapèutica) però sense efectes tòxics. o Control: administració del vehicle --- Paràmetres a observar: o Toxicocinètics: BD, acumulació, metabolisme, inducció, etc. (Informació valuosa per la manipulació posterior del producte) o Paràmetres generals: pes, consum d’aliment i aigua, signes clínics i conducta o Paràmetres analítics: hematologia, BQ sèrica i d’orina o Anatomia patològica: pes absolut i relatiu dels òrgans, histopatologia Resultat que obtindrem idealment: A dosis baixes i a dosi terapèutica à No toxicitat. Jon_Snow 123 Quan més separada estigui la corba de toxicitat de la corba terapèutica, més marge tenim, més segur. El que tingui la pendent més petita, més segur. Disminueix les variacions amb diferents dosis. A més pendent, més variacions. Exemple: La corba vermella (fosca), presenta més toxicitat a la Dosi 50, però a dosis baixes gairebé no presenta toxicitat; en canvi la verda a dosis baixes produeix més toxicitat. Això demostra que la toxicitat no es pot resumir només amb la D50, només amb un número perquè estaríem perdent informació. GENOTOXICITAT / MUTAGENICITAT Hi ha diversos mètodes per evaluar la genotoxicitat. Hi ha tants mètodes perquè poden escollir---se moltes cèl·lules diferents per aplicar--- los. Determinem els canvis que es donen a l’ADN. Cal que es facin tots els assajos? No, cal que es facin els que diu la ICH. La ICH diu que la bateria mínima d’assaig és: --- mètodes que avaluen mutacions puntuals Jon_Snow 124 --- mètodes que avaluen alteracions en l’estructura del cromosoma --- mètodes in vivo i in vitro Exemples: a) Test d’ames Partim d’una soca de Salmonella que necessita histidina en el medi per créixer. Si afegim una substància tòxica, pot afectar al genoma de la Salmonella, i pot ser que actui sobre el gen concret i que faci que no requereixi captar histidina del medi per créixer à de manera que en el medi observarem el creixement de colònies (quantes més colònies veiem, voldrà dir que més genotòxica és). Hi ha 2 assajos que pretenen veure mutacions. Si es pot s’utiltzen cèl·lules eucariotes ja que si ho fem amb bacteris no és del tot igual el mecanisme d’empaquetament del DNA. En el test d’ames localitzem les colònies que han sigut capaces de viure en el medi advers, de manera que voldrà dir que han mutat. 1r. Cultiu eucariota 2n Afegim el tòxic 3r Si muten es cèl·lules ------> aconseguiran sobreviure; sinó no sobreviuran. Hi ha diversos tipus d’assaig. Un exemple és utilitzar cèl·lules que només presenten una còpia d’un determinat gen de manera que serà més fàcil observar la mutació; si tingués vàries còpies seria difícil observar la mutació en tots ells. Exemple TK/ATPasa HGPRT: gen que no és necessari per la supervivència. Aquesta proteïna s’utilitza per sintetitzar bases del DNA, però si no la té sintetizarà el DNA d’una altra manera. SI cultivem la cèl·lula en presència d’un antimetabòlit: 6---tioguanina ------> se sintetitzarà un DNA erroni ------> s’intoxicarà la cèl·lula i morirà. Si afegim una substància, la que volem assejar, i la cèl·lula muta ------> ja no utilitzarà la 6---tioguanina del medi per la síntesi de DNA i per tant sobreviurà. 125 Jon_Snow La cèl·lula sobreviu perquè no cal que incorpori nucleòtids del medi sinó que pot sintetitzar---los de novo. Aberracions cromosòmiques (in vitro/in vivo) Hi ha substàncies que no veurem que provoquin mutacions en el test d’ames però que sí que produeixen alteracions cromosòmiques. Com podem observar---ho? S’aconsegueix que les cèl·lules estiguin en mitosi i s’observaran els cromosomes al microscopi per veure si són correctes o no. TOXICIDAD SOBRE LA REPRODUCCIÓN Regulado por una ICH y por la OCDE 414. En un test de teratogénia hay que usar dos especies: una de roedor (rata) y una de no roedor (conejo). 126 Jon_Snow En ratas, para embarazarlas, usamos el método clásico, separamos los machos de las hembras, y al ponerla en contacto con el serrín del macho entra en celo. Después de toda la noche, si hacemos un frotis en la vagina de la rata y hay esperma la consideramos embarazada. En conejos es mas complicado, por lo que se inseminan artificialmente. La eficiencia de embarazo es de un 90%. En el estudio hay que estudiar 3 niveles de dosis y un control (será el vehículo). Para cada grupo necesitamos un mínimo de 20 animales embarazados. Como en las ratas no sabemos si están embarazadas o no tendremos un margen de 24-25 ratas, en conejos tendremos un margen menor (21-22). El día 5 empezamos a administrar el producto/control, hasta el día antes de la fecha prevista de parto (en ratas 20-21 días), donde son sacrificadas. En los conejos lo hacemos hasta el día 29-30. Durante todos los días previos se anotan todos los parámetros relacionados con la adm del medicamento o sus efectos adversos. Se sacrifican las hembras, se hace un examen del animal y se extraen los úteros y fetos (se pesan, se sexan, se observan malformaciones visibles, se observa si ha habido aborto). Habrá una media de 12 fetos por hembra. Habrá una media de 1000 fetos por analizar. Se separan en dos grupos, uno para observar malformaciones esqueléticas y otro para observar malformaciones viscerales. MALFORMACIONES VISCERALES Iran al fijador, se harán lavados con etanol para endurecerlo y se analiza. Primero siempre las malformaciones externas, se corta la cabeza y las extremidades. De la cabeza se separa la mandibula inferior y la lengua. Cuando tenemos la mandibula y el cráneo cortamos con secciones de más o menos de un mm. 127 Jon_Snow En el resto del cuerpo hacemos los mismo, y vamos observando todos los órganos. En las extremidades se mira que tengan todos los dedos. Se hacen fotografías y se guardan en el archivo BPL MALFORMACIONES ESQUELETICAS Se ponen con una solución…. Toda la noche, luego 2 días en etanol y se sacan todos los órganos internos, sin intentar no romper ningún hueso ni ninguna costilla. Nos queda un feto vacío. También se le saca la piel. Si hay alguna incidencia hay que anotarla, pq sino la persona que analiza el feto lo va a anotar como malformación. Una vez extraída la piel se pasa por soluciones blanqueadoras y luego con dos tinciones se ven los cartílagos (azul) y los huesos (rojo). Se cuentan todos los huesos y que estos tengan tamaños adecuados. Todos los fetos se guardan en glicerol (como mínimo 5 años), con lo cual se pueden volver a estudiar siempre que sean necesarios. Siempre hay que mirar si hay una relación dosis respuesta en relación a las malformaciones. TEST DE CARCINOGENICIDAD Es muy probable que regulatoria lo exija si estamos investigando un medicamento humano. Se rige por la OCDE 451 y normalizado mediante una ICH S1B. Las ICH no te dicen como se hace, sino que datos damos. Las OCDE si que te dicen como llevarlos a cabo. Normalmente se usan roedores, a lo largo de toda su vida (aprox 2 años). Se usa vía de administración oral (en productos farmacéuticos), tb puede ser cutáneo o por inhalación (productos químicos o contaminantes). 128 Jon_Snow Se compara también animales control, pq estos también pueden desarrollar tumores. Tenemos que intentar hallar el órgano diana donde se produce la carcinogénesis. Si nuestro producto causa tumores es importante saber cuando empiezan a formarse e intentar relacionar dosis – respuesta y calcular la NOAEL (dosis más alta posible que no genera tumores). Intentar extrapolar resultados a humanos y obtener suficientes datos para poder probar la hipótesis de un mecanismo de acción determinado. La substancia se adm diariamente durante toda la vida de la rata. Diariamente se observan los animales, observamos signos de toxicidad y los palpamos para ver signos de tumores. Lo apuntamos todo. Los animales que mueren no pueden usarse para el ensayo, pero se hace una necropsia completa donde se extraen diferentes órganos y se fijan. Las hembras tiene que ser nulíparas (que no hayan parido) y que no estén embarazadas. Todas tiene que ser del mismo proveedor y de la misma cepa. La guideline fija las condiciones ambientales, distribución de las jaulas, luz… información sobre el tipo de agua y pienso que han comido. Los animales se aclimatan durante 7 dias, y se empieza lo antes posible (se empieza justo después del destete, unos 20 dias) + los 7 de aclimatación. Intentamos empezar unos 30 dias después del nacimento. Intentamos que las diferencias de peso sean homogenias y las jaulas no sean todos hermanos. En cada nivel de dosis ( mínimo alta, media, baja y control) se necesitan 50 ratas macho y 50 ratas hembra. En cada grupo tendremos 100 animales y en el ensayo 400 animales. La dosis alta tiene que evitar el sufrimiento, no letal, pero si que se vean efectos tóxicos. Como dosis baja escogeremos el umbral (zona no probable de efectos tóxicos). Como dosis media escogeremos la zona de la pendiente. El grupo control se tratara igual que los grupos tratados, se sondaran, se manipularan… igual, pero solo con el vehículo y no VO+ vehículo. 129 Jon_Snow Si trabajamos con VO podemos incluirlo en la dieta, pero no comen siempre lo mismo, y tendríamos que tener individualizados en jaulas. En el tratamiento dérmico será de 6 horas en contacto, todos los días durante 2 años. En el tratamiento inhalado tienen que estar 6 horas inhalando, todos los días. El estudio se para cuando los controles o las dosis bajas mueren más de un 75%. Si los de las dosis altas mueren no paramos el estudio, ya que es previsible (estamos a dosis toxicas y puede ser que los tumores maten el animal). En este caso actuaríamos igual que si alguien muere. La supervivencia de cada sexo debe considerarse por separado. Cada día se revisan los animales dos veces, si el animal lo esta pasando mal se sacrifica el animal (según una escala que nosotros establecemos). Se tiene que mirar como varia el peso de los animales (tienen que aumentar de peso para que todo vaya bien), asi como el consumo de agua y comida. AUTOPSIA DEL ANIMAL Hay que hacer un examen externo completo, se observan todos los signos adversos, se recogen cierta cantidad de órganos de cada animal y se guardan. Se analizan más de 30 organos de cada animal, que son los que hay que guardar. Si hay órganos dobles (ojos, riñones) analizaremos los dos. De todos los que hemos guardado analizaremos: - Todos los tejidos de los grupos de dosis altas y control. Si vemos alteraciones de algún tipo en X órgano se analizaran también en dosis media o baja. Todos los tejidos de los grupos muertos o que murieron durante el ensayo. 130 Jon_Snow TEST REPORT - Caracterización completa de la molécula que estamos testando, tb del vehículo. - Caracterización completa de los animales que hemos usado. - Condiciones de ensayo, nº lotes de la comida, composición del agua que usamos. - Resultados de supervivencia, cambios de peso, consumos de agua y alimentos, revisiones de los animales (oftalmoscopia, hematología, bioquímica sérica). - Todos los datos de la necropsia, de todos los órganos analizados (peso y relación del peso con el resto del cuerpo). - Diferenciar las observaciones histopatologías neoplásicas de las que no lo son. - Gradaciones de la gravedad relacionados con la dosis. - Tratamiento estadístico de los datos, discusión de los resultados. - Conclusiones. ...