Tema 4 (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular i Genòmica
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 4. PROCESSAMENT DEL RNA EUCARIOTA  Remember Cèl·lules procariotes: la RNA-polimerasa reconeix el promotor amb la subunitat σ i s’inicia la transcripció. Una sola RNA-polimerasa s’encarrega de transcriure tota la seqüència, no tenim introns ni nucli, per tant, la transcripció i la traducció tenen lloc simultàniament en un sol compartiment que seria el citoplasma.
Cèl·lules eucariotes: tenim promotors que marquen l’inici de la transcripció, els TF formen el complex de transcripció i s’encarreguen de reconèixer el promotor. Són proteïnes que identifiquen la seqüència de nucleòtids del promotor i s’uneixen al DNA. Tenim 3 tipus diferents de RNA-polimerases, la RNA-polimerasa II és la que s’encarrega de transcriure el RNAm. La transcripció i la traducció tenen lloc a diferents compartiment, la primera al nucli i la segona al citoplasma. El primer producte generat a la transcripció encara no és el que es transcriu, ha de patir algunes modificacions abans (eliminació d’introns, modificació de l’extrem 5’ i modificació de l’extrem 3’).
 Addició de bases modificades a l’extrem 5’ (CAPPING) La modificació a l’extrem 5’ consisteix en afegir a aquesta regió un cap o casquet, el processament de la molècula de RNA i la transcripció són processos simultanis. Aquesta modificació consisteix en generar un senyal per facilitar el reconeixement de la molècula de RNA i es dóna durant la fase d’elongació de la transcripció on s’afegeixen de 20 a 40 nucleòtids.
La modificació consisteix en eliminar el fosfat de la posició γ amb la RNA-trifosfatasa, addicionar una Guanina amb la Guanilil-transferasa on surt un pirofosfat (PPi) i es forma un enllaç 5’-5’, i metilar la guanina i els residus del voltant amb la Metil-transferasa on s’incorporen metils a la posició 2’-OH dels primers nucleòtids del transcrit.
En la fase d’elongació el domini CTD de la RNA-polimerasa II es troba fosforilat i, per tant, pot interaccionar amb l’enzim dimèric de RNA-trifosfatasa i Guanilil-transferasa.
 Reacció de poliadenilació La modificació a l’extrem 3’ consisteix en afegir una cua de poli-A a l’extrem, tots els RNAm la tenen excepte les histones i no és un resultat de la transcripció. A la fase d’elongació de la transcripció apareix un senyal (cleavage signal) que indica on s’ha de donar la modificació, per afegir la cua de poli-A s’ha de tallar el transcrit i el senyal es troba a uns 10 nucleòtids cap a l’extrem 5’ del punt on s’ha de fer el tall.
Hi ha un complex proteic associat al domini CTD fosforilat de la RNA-polimerasa II que reconeix aquest senyal, el tall el duu a terme una endonucleasa especifica i es genera un extrem 3’-OH lliure que és un senyal de degradació de la molècula. Per evitar que es degradi el missatger l’enzim poli-A polimerasa afegeix la primera A just quan es dóna el tall, les primeres 10 A es van addicionant lentament i després la reacció s’accelera fins que s’afegeixen unes 200-250 A.
Diferenciem entre el primer extrem del RNAm i l’últim perquè el 5’ tindrà una guanina metilada i el 3’ una cua de poli-A que ajuda a estabilitzar la molècula i a definir millor quina serà la regió codificant per proteïnes.
 Seqüències intròniques Són seqüències consensus que es troben al voltant dels llocs d’empalmament 5’ i 3’ als RNAm dels vertebrats: - Els dos primers nucleòtids de l’intró en 5’ són GU Els dos últims nucleòtids de l’intró en 3’ són AG Hi ha una regió rica en pirimidines a prop de l’extrem 3’ Hi ha un punt de ramificació format per l’Adenosina localitzat a uns 20-50 bp del lloc d’empalmament en 3’.
Gràcies a aquestes seqüències consensus identifiquem els introns i els podem eliminar. Els introns solen ser molt més grans que els exons però sempre tenen la mateixa seqüència per tant el mecanisme d’eliminació és molt efectiu.
La reacció més senzilla per trencar un enllaç seria la hidròlisi amb la posterior unió dels dos fragments mitjançant una lligasa, l’inconvenient és que es requereix ATP i hi hauria un desgast d’energia molt important si ho haguéssim de fer per tots els introns. Es necessita una altra estratègia que la duguin a terme molècules catalitzadores que no siguin enzims, és a dir, el RNA.
 Components de l’espliceosoma Per a aquesta estratègia d’eliminació dels introns s’utilitza un complex anomenat espliceosoma que s’encarrega de reconèixer els llocs d’empalmament 5’ i 3’ dels introns, el punt de ramificació, d’aproximar els exons per aquests llocs d’empalmament i de la catàlisi del procés d’empalmament dels introns.
En aquest complex trobem unes proteïnes que només tenen funció estructural i RNA petits sintetitzats per la RNA-polimerasa II que són els encarregats de la catàlisi de la reacció d’empalmament dels introns, aquests components es troben molt separats linealment però gràcies a l’estructura de l’espliceosoma es troben més propers i poden interaccionar.
Està format per 5 subunitats de RNPsn = partícules de ribonucleoproteïna nuclear petites obtingudes del processament dels precursors de RNAm. RNPsn = RNAsn + proteïnes RNPsn Nº de nucleòtids del RNPsn U1 165 U2 185 U5 116 U4 145 U6 106  Funció S’uneix amb el lloc d’empalmament 5’ i després amb el 3’ S’uneix al punt de ramificació i forma part del centre catalític S’uneix al lloc d’empalmament 5’ Emmascara l’activitat catalítica de la subunitat U6 Catalitza la reacció d’eliminació o splicing de l’intró Ensamblatge de l’espliceosoma El substrat de la reacció són dos exons separats per un intró. El primer pas és la unió dels components U1 i U2 al lloc d’empalmament en 5’ i al punt de ramificació respectivament.
Reconeixen la seqüència de l’intró perquè tenen la seqüència de RNA complementària i es formen els ponts d’H.
Es dóna una interacció per complementarietat de bases entre l’intró del RNAm i el RNAsn del component U1. En el cas del U2, es formen ponts d’H amb tots els nucleòtids excepte la A del punt de ramificació, el deixa lliure, per tant, queda com un pont.
La resta de components s’uneix de manera conjunta a l’intró perquè estan units per reaccions de complementarietat els components U4 i U6 i per reaccions de proteïna-proteïna el component U5. Aquest tres formaran un pre-complex que posteriorment s’unirà al RNAm amb U1 i U2. Amb la unió d’aquest pre-complex aconseguim que els dos exons estiguin molt més propers.
Tot aquest complex format per les subunitats de l’espliceosoma i l’intró ha d’evolucionar, patirà una reorganització que consisteix en la recol·locació i eliminació dels components U1 i U4, ara el component U5 substituirà la funció del U1. Com el U4 ha estat eliminat, no hi ha inhibició de l’activitat del U6 i, per tant, es produirà la reacció d’empalmament ja que l’espliceosoma es troba en la forma activa.
 Centre catalític de l’espliceosoma El centre catalític de l’espliceosoma no té aminoàcids perquè no és un enzim, cal assolir aquesta estructura perquè tingui lloc la reacció d’empalmament. Es duen a terme dues reaccions de transesterificació.
 1a reacció de transesterificació Aquesta reacció la desencadena el punt de ramificació, les transesterificacions consisteixen en trencar un enllaç i formar un altre simultàniament, així el balanç d’energia està equilibrat perquè el número d’enllaços és constant, no requereix cap aportació d’ATP. L’enllaç èster entre el fosfat en 5’ de l’intró i l’oxigen en 3’ de l’exó 1 en canvia per un enllaç èster amb l’oxigen en 2’ de l’adenosina al punt de ramificació.
 2a reacció de transesterificació L’enllaç èster entre el fosfat en 5’ de l’exó 2 i l’oxigen en 3’ de l’intró es canvia per un enllaç èster amb l’oxigen en 3’ de l’exó 1, i s’allibera l’intró en forma d’una estructura lariat o en llaç que queda unit a l’espliceosoma. A aquesta estructura lariat queda un grup –OH que és senyal de degradació, per tant, el resultat de les dues reaccions és la unió dels dos exons i l’eliminació de l’intró.
 Productes resultants de l’empalmament d’un intró Aquests productes es poden observar al laboratori mitjançant un gel d’electroforesi ja que els introns i els exons tenen mides molt diferents. Al tub eppendorf afegim un fragment de RNA amb dos exons i un intró i es marca amb P32, un marcatge radioactiu, no utilitzem el fluorescent perquè el radioactiu és molt més sensible amb petites i poques molècules, també necessitarem l’espliceosoma.
Tots aquests components es troben al nucli cel·lular, necessitem tot el que formi el nucli menys el DNA i les histones, el que s’anomena extracte nuclear.
 Transcripció i maduració Són dos processos acoblats. Les modificacions en 5’ i 3’ són paral·leles, després es dóna l’empalmament també al nucli i el domini CTD de la RNA-polimerasa II és l’encarregat de reclutar tots els elements que la recció requereix. Un cop s’han donat les 3 modificacions, el RNAm estarà processat i serà madur, ja podrà sortir al citoplasma per donar lloc a proteïnes.
 Procés d’empalmament alternatiu La majoria de gens de les nostres cèl·lules donen lloc a molts RNAm a partir d’un mateix gen mitjançant el procés d’empalmament alternatiu, això permet generar diferents proteïnes però amb una certa relació a partir d’un sol gen.
 Poliadenilació alternativa A més de l’empalmament alternatiu també tenim la reacció de poliadenilació alternativa mitjançant la qual obtenim una multitud de proteïnes diferents a partir d’una sola seqüència gènica.
EX: gen de la calcitonina. Tenim la molècula del gen de la calcitonina present a una cèl·lula de la tiroides i a una cèl·lula neuronal. Es dóna la transcripció mitjançant la poliadenilació alternativa i seguidament l’empalmament alternatiu per obtenir els RNAm a cada cèl·lula.
Després es dóna la traducció per obtenir els polipèptids precursors o pre-hormones, finalment es dóna un tall post-traduccional i obtenim el polipèptid. Aquesta proteïna a la cèl·lula de la tiroides serà la calcitonina i a la cèl·lula neuronal serà la CGRP (calcitonin gene-related peptide).
 Tipus d’introns autoempalmables El RNAm té un poder catalític molt clar quan és capaç de treure els introns d’ell mateix sense necessitar un espliceosoma, no és una tendència normal, diem que aquest tipus de gens té introns autoempalmables. Es divideixen en dos grups amb diferències significatives: 1) El punt de ramificació en aquest cas és una G i no forma part de l’intró, és un cofactor provinent de GTP, quan es donin les dues reaccions de transesterificació l’intró serà eliminat en forma lineal i no de llaç tot i que les reaccions siguin les mateixes.
2) El punt de ramificació és una A i forma part de l’intró, després de les reaccions de transesterificació obtenim l’intró en forma lariat o de llaç.
Segons el tipus de RNA tindrem la següent classificació: GRUP I II CARACTERÍSTIQUES G al punt de ramificació sense formar part de l’intró i producte de la reacció en forma lineal A al punt de ramificació formant part de l’intró i producte en forma lariat A al punt de ramificació formant part de l’intró, producte final en forma lariat i requereix espliceosoma Tall i lligació com a reacció d’eliminació de l’intró III IV  Mecanisme d’autoempalmament Aquest mecanisme és la prova evident de que el RNA té capacitat catalítica pròpia. Agafem com a exemple els introns del grup 1. El cofactor nucleòtid guanilat (G) ataca el lloc d’empalmament en 5’ per formar un enllaç fosfodièster (3’-5’) amb l’extrem 5’ de l’intró.
Aquesta reacció de transesterificació genera un grup 3’-OH al final de l’exó 5’ que ataca al lloc d’empalmament en 3’. Així amb la segona reacció de transesterificació s’uneixen els dos exons i s’allibera l’intró en forma lineal.
 Precursors del RNAr Els RNAr i els RNAt també pateixen algunes modificacions. En el cas dels RNAr després de la transcripció s’obté un sol transcrit que codificarà per les diferents mides que hi ha d’aquest tipus de RNA (18S, 5.8S i 28S) obtenint així la mateixa quantitat de totes les subunitats després de la traducció.
La primera modificació consisteix en modificar la majoria de les bases que formen les seqüències codificants amb metilacions i apareixen pseudouridines com a resultat, la segona és l’eliminació de les seqüències que separen les regions codificants per les diferents mides de RNA, també s’anomenen espaiadores, es tallen i es degraden.
 Processament dels RNAt És el tipus de RNA més petit, té una estructura molt característica i pateix una modificació molt extensiva.
Al RNAt no madur trobem una seqüència en 5’ anomenada Leader que és eliminada durant el processament per la RNAsa P., l’extrem 3’ també és modificat i eliminem una seqüència anomenada Trailer amb la RNAsa D., per últim en comptes d’introns tenim unes seqüències anomenades pseudointròniques que són eliminades mitjançant un procés d’hidròlisi i unint després els dos extrems amb la RNAendonucleasa i la lligasa.
Al RNAt madur trobem a l’extrem 3’ el lloc d’unió als aminoàcids que el RNAt ha de transportar.
 Edició del RNA (RNA editing) També anomenat correcció post-transcripcional, ens permet obtenir proteïnes diferents a partir d’una mateixa seqüència gènica.
Ex: apolipoproteïna B expressada al fetge i a l’intestí que transporta colesterol i triglicèrids endògens (fetge) o de la dieta (intestí).
- Fetge: el RNA no és modificat i s’obté la proteïna de la mida determinada i esperada.
- Intestí: el transcrit pateix una modificació sobre la molècula de RNA, en aquest cas és una desaminació d’un nucleòtid d’un codó i com a resultat obtenim un codó de parada, per tant, tindrem una versió truncada de la proteïna.
Hem generat 2 proteïnes diferents amb la desaminació d’un nucleòtid formant un senyal de STOP, per això tenim funcions diferents, però en cap moment s’ha modificat la seqüència gènica.
 Sumari a) Els productes de la transcripció de les tres RNA polimerases d’eucariotes s’han de processar.
b) A l’extrem 5’ dels precursors de RNAm s’afegeix un cap o casquet i a la majoria una cua de poli-A a l’extrem 3’.
c) El tall i empalmament dels precursors de RNAm té lloc a l’espliceosoma, constituït per partícules de ribonucloproteïnes nuclears (RNPsn). Determinades seqüències dels extrems dels introns i un punt de ramificació proper a l’extrem 3’ especifiquen els llocs d’empalmament.
d) L’eliminació d’un intró en una molècula de pre-RNA consisteix en dues reaccions de transesterificació que manté constant el número d’enllaços fosfodièster.
e) Algunes molècules de RNA amb activitat catalítica experimenten processos d’autoempalmament en absència de proteïnes.
f) Els RNAt i RNAr també segueixen un procés de maduració post-transcripcional.
g) La correcció post-transcripcional o edició del RNA altera la seqüència de nucleòtids d’alguns RNAm.
...

Tags:
Comprar Previsualizar