HH (2007)

Otro Otro
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Año del apunte 2007
Páginas 24
Fecha de subida 19/10/2014
Descargas 43
Subido por

Vista previa del texto

Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 7. DETERMINACIÓ DE L’ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE PROTEÏNES Tècniques espectroscòpiques n’hem vist moltes.
Tècniques calorimètriques n’hem vist molt poques, només una quan estudiàvem plegament, ?? d’escombratge.
Proves químiques, vol dir que jo modifico les proteïnes amb quelcom que em doni una senyal, pot ser un enzim, un foròfor, el que sigui.
Una altra tècnica molt usual es l’ús de proteases, quan la gent intenta fer cristalls i aquestes proteïnes no cristal·litzen moltes vegades es perquè aquesta proteïna es molt gran. Lo maco és cristal·litzar la proteïna sencera, però si no pots anem a veure si ho podem fer per dominis.
Com puc saber de una proteïna de la qual no tinc la estructura, on estan els dominis, es molt fàcil, poso proteasa, passa per una gel filtració, i allò que hagi resistit a la proteasa es un domini globular desplegat. Allò ho purifico i ho poso a cristal·litzar.
Tot això ja ho em vist, i estructura quaternària no la veurem.
Espectre electromagnètic 1 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Això ho heu vist un munt de vegades al llarg de curs, esteu acostumats a treballar amb el visible. La majoria de coses que heu fet a les pràctiques ho heu fet en el visible. Sabeu que es una part molt petita de l’espectre que podem utilitzar per analitzar proteïnes. L’espectre va des dels rajos X (els gamma no els podem fer servir) fins a les freqüències de radio. Des de freqüències molt baixes a freqüències molt altes.
Cadascuna d’aquestes bandes de l’espectre ens dóna informació sobre una cosa diferent.
 Quan tenim freqüències baixes, vol dir longituds d’ona altes, són fonts molt poc intenses, fem servir o RMN (ressonància magnètica nuclear) o ESR. Això em prova les propietats magnètiques dels nuclis, i veurem que ens permet resoldre estructures.
 En longituds d’ona més baixes tenim les microones i els IR. D’aquestes dues l’IR el fem servir per estudiar les propietats dels ponts, i en el nostre cas de l’enllaç peptídic.
 Si anem més avall tenim l’UV visible i els rajos X, i aquests em donen informació essencialment de les propietats electròniques de les molècules.
D’aquestes aquelles que em permeten tenir estructura d’alta resolució són els Rajos X o RMN.
Estan en llocs totalment oposats de l’espectre i proven coses totalment diferents, però en els dos casos jo puc tenir una estructura a nivell atòmic.
En quan a les tècniques que puc fer servir, essencialment les puc dividir en dos tipus. Anàlisi en fase sòlida, o Anàlisi en fase aquosa. Preferiblement sempre que pugui faré servir fase aquosa, perquè les proteïnes estan en solucions fisiològiques aquoses.
Per tant moltes de les estructures que heu vist, sobretot les més maques, són estructures de rajos X. Això vol dir que és la proteïna en un cristall, sabem que s’assembla molt a la proteïna en solució, però no ha de ser necessàriament la mateixa.
Anàlisi en fase sòlida: - Difracció de rajos X, per això em de muntar cristalls de proteïna (no es fàcil) i necessitem una font de rajos X d’alta intensitat i monocromàtica. Per sort al costat del campus en tenim una de les millors d’Europa.
- TEM (microscòpia electrònica de transmissió), em serveix quan tinc estructures macromoleculars com fibres amiloides, xaperones, protosoma.. coses grans. Les molècules individuals encara que les fixi no les puc veure.
- Cryo microscòpia, les fibres són congelades en gel i fraccionades. No només pots veure les parts laterals sinó que pots veure les parts interiors amb la resolució d’un microscopi.
Anàlisi en fase aquosa: - IR - UV-Visible 2 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 - Fluorescència - Dicroisme circular - RMN - ERP (que no l’estudiarem) Absorbància i fluorescència Diferència: Quan mesuro absorbància puc mirar com absorbeix la llum, com passen els electrons a un estat superior perquè han absorbit llum, i el que miro es aquesta diferència d’estat.
Quan miro fluorescència el que miro es com després d’excitar, com després d’absorbir llum, hi ha un retorn a l’estat basal. Aquest retorn a l’estat basal es produeix sempre a una longitud d’ona més alta que l’original, perquè perd energia en la transferència.
Aquest seria el típic espectre de absorció-fluorescència (El de ralla blava i vermella, en aquest cas absorbància de Tyr). Absorbeix a 270 i emet desplaçat el espectre a 307.
La fluorescència respecte l’absorbància presenta un avantatge, la sensibilitat. Puc mesurar proteïnes amb molta menys concentració. Quan mesuro fluorescència el retorn energètic es superior.
3 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Infraroig Està en una longitud d’ona més alta, és menys energètic. Això és un espectre típic d’infraroig.
l’IR afecta a l’energia vibracional, impacta directament sobre l’enllaç peptídic, està a la longitud d’ona de ressonància de l’enllaç. L’IR per proteïnes només veiem l’enllaç peptídic, però l’energia de vibració quan jo il·lumino amb IR depèn de la conformació, depèn de l’estructura secundaria i això em permet saber l’estructura secundaria d’una proteïna amb molta fiabilitat.
El que dóna és un pic (el que es veu es la part de fora) es un pic molt lleig, molt ample, amb una longitud d’ona que va entre 1600 i 1700 que es on estan totes les proteïnes. Això es la regió de mida 1, mida 1 es l’enllaç peptídic.
Afortunadament si us ensenyo la part de fora estic fent l’IR, però aquí posa FTIR, que vol dir FT? Vol dir “furier transformer” puc aconseguir deconvulsionar?(fragmentar/separar..) l’espectre en tantes gaussianes com jo vulgui. La suma de les àrees reconstrueix perfectament l’espectre.
Haig de fer tantes gaussianes com per reconstruir el 99% de l’àrea, quan tinc el 99% de l’àrea ja ho tinc tot deconvolucionat amb els contribuïdors.
Ho tenim aquí (colors): Fulla β (blau): pica sobre 1630 i 1690.
Desordenat(verd) pica sobre 1670 aproximadament.
Alfa(vermell) pica sobre 1650.
L’únic que haig de fer es quantificar l’àrea de cadascun d’aquests pics.
Aquesta proteïna es una proteïna majoritàriament α amb una regió β i una desordenada.
4 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Té un problema, fa falta que la proteïna estigui molt concentrada. Quan menor es la intensitat de la reacció que faig servir, la senyal es més petita. Necessito per sobre de 1mg/ml.
Té un avantatge molt important, jo puc fer infraroig en el líquid, però també en sòlid. Puc fer que la proteïna s’assegui sobre la membrana i excitar igual. Això em permet que encara que no tingui una concentració de proteïna molt gran inicial, s’acabi concentrant. Però en cara és més important que em permet saber estructures secundàries de formes insolubles. No tinc cap altre tècnica per saber estructura secundàries de formes insolubles. Perquè pot interessar això? Perquè una de les formes insolubles més importants són les fibres amiloides, no són solubles, formen agregats.
Això que us ensenyo aquí es un experiment, són dos espectres d’IR, per una proteïna de tipus barril beta.
El que veieu aquí no es aquest tipus de representació, s’assembla, jo puc veure que em agafat la proteïna quan estava soluble, em agafat un espectre d’IR (el de línies discontínues) que té un pic a 1632, que es on ha d’estar perquè es β, però el que puc fer es seguir l’espectre amb el temps a mesura que va agregant i formant fibres. Puc seguir la formació de fibres amiloides en temps real. Sabem que les fibres amiloides també estan formades per fulla β, però és diferent a la fulla β de una proteïna natural, perquè una es intermolecular i l’altre es intramolecular, però des del punt de vista estructural una fibra amiloide és més estable perquè la distància entre les cadenes del backbone és gairebé la distància mínima teòrica, estan molt ben empaquetades.
Aquesta tècnica no només em permet distingir si l’estructura secundària es una β, sinó em permet distingir si aquesta es inter o intra molecular. El mínim teòric d’una fulla β es un pic a 1615, això es la mínima distància a la qual poden estar dues cadenes. Fixeu-vos que les fibres amiloides tenen a 1619-1620, quan tenen un pic tan avall es típic de les fibres amiloides.
UV-visible Fem servir Trp per mesurar absorbància perquè absorbeixen més que qualsevol altre. Tyr i Phe. Això és l’espectre d’absorbància.
Si jo vull mirar un canvi conformacional per absorbància, estic obligat a fer el que s’anomena un espectre de diferència. Haig de restar l’absorbància que te la conformació nova de l’absorbància que jo tenia abans, perquè els canvis de senyal són tant petits que no els puc 5 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 observar, només si faig diferències. El que veieu aquí (espectre de la dreta) són diferències entre un estat i l’altre. Fixeu-vos en els valors d’absorbància. És una tècnica que si em puc estalviar me la trec de sobre, perquè haig de fer diferències, no es l’ideal. L’ideal es fer fluorescència, on no em fa falta fer diferències.
Fluorescència El que veieu a l’esquerra (i això ja ho em vist) es una proteïna a la qual jo li estic mesurant l’espectre de fluorescència del Trp. L’estic excitant a 280, i estic recollint una finestra que va de 300 a 400. Fixeu-vos que quan la proteïna passa de pH 7 a pH 2, on forma un molten globule, o a pH 12 on està totalment desplegat, el canvi de presència es molt espectacular. Però no només canvia la intensitat, canvia la longitud d’ona màxima i això em dóna una informació que no em dóna l’absorbància, em dóna informació de l’estat en el qual es troba aquest Trp. Com que normalment es troba enterrat em dóna informació de l’obertura del nucli. Quan la proteïna esta ja desnaturalitzada li poso urea canvio el pH, si que hi ha canvis en la fluorescència però fixeu-vos que el màxim no canvia.
6 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Si analitzeu una proteïna, li poseu urea, li poseu pH, el que vulgueu, i us augmenta només el màxim a aquesta proteïna no li està passant res. Perquè li passi alguna cosa ha de canviar el màxim en el qual tenim la intensitat.
360 vol dir que això esta totalment exposat a solvent, 340 es que esta totalment protegit. Jo puc saber el grau d’exposició en cadascun dels casos. En un molten globule no esta tan protegit com a l’estat natiu, però clarament està més protegit que a l’estat desplegat.
La fluorescència em dóna informació conformacional.
Dicroisme circular Dóna la mateixa informació que l’IR. Només serveix per solucions. Quan jo mesuro una proteïna el que miro es l’estructura secundària. Hi ha tres tipus d’estructura secundària (ja ho sabeu) i jo se quin tipus d’espectre te cada una d’elles. Això es una estructura desordenada que te un mínim entre 195 i 200. Això es una fulla β amb un mínim a 217, i això es una α amb un mínim a 208 i 222.
El dicroisme circular el que veu es com la molècula fa girar la llum. Es una propietat òptica que depèn exclusivament de l’estructura secundària, aquí les cadenes laterals no juguen cap paper.
El que faig es sumar les diferents contribucions fins que em doni un espectre que correspon a la meva proteïna. Vas al programa al qual li poses l’espectre i et dirà aquest espectre té un 40% de contribució α, un 20% de β i un 0% de desordenada.
Perquè fem servir molt més dicroisme circular que infraroig? són bastant iguals, i barats, de fet IR es més barat. És molt més sensible i necessites més concentració de proteïna. Em dóna el mateix tipus d’informació excepte que el dicroisme circular no pot distingir entre inter i intramoleculars.
7 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 09-01-14 Si volem veure proteïnes o la seva estructura, la solució a nivell atòmic només ho podem fer amb dos temps, identificar estructura terciària i secundària, però mai atòmica. Per veure una cosa físicament necessitem que la longitud d’ona que li arribi sigui equivalent a la cosa que volem veure. Per veure un enllaç químic, que són covalents, la longitud d’ona ha de ser molt curta! Tan curta que ha de ser amb raig X.
Aquest és l’esquema bàsic d’un experiment amb cristal·lografia de raig X. On ho fem? Ho fem al sincrotró alba perquè ens dóna llum monocromàtica de molta intensitat.
Necessitem: 1. Font de raig X 2. Un cristall de proteïna (altament limitant) 3. Un detector on podem veure el raig que difracta el cristall La cristal·lografia ja l’haureu vist en l’assignatura de química. Es basa en tenir una estructura altament ordenada molt repetitiva que es troba en un lloc ben definit. En un cristall tenim diferents cel·les que poden tenir una o més molècules amb una simetria idèntica en cada cel·la. Les proteïnes al contrari que la sal, ocupen volums grans i tenen formes irregulars. Això què fa? Obligatòriament tenim un gran espai al cristall que no està ocupat per la proteïna, està ocupat pel dissolvent. Això causa dos grans problemes: 1. Els cristalls de proteïna són MOLT febles. Pots tardar mesos construint un cristall i al primer mil·lisegon que radies amb raig X te’l carregues. Això és degut a que hi ha molts pocs contactes. De fet, els contactes entre les cel·les normalment no són contactes proteïna-proteïna perquè acostumen a tenir una o més capes de dissolvent. Això és bo perquè encara que la proteïna estigui formant un cristall està rodejada de solvent, cosa que fa que la seva estructura s’assembli molt o fins i tot sigui idèntica a l’estructura de la proteïna en solució. Per RMN resolem estructures en solució.
2. Un cristall difracta més bé com més ordenat està, tens un millor patró de difracció. La proteïna està molt ben ordenada, però tota la superfície de la proteïna hi trobem el solvent, aquest no està ordenat. Per tant, com a mínim el 50% del volum de cristalls tenen un moviment, no estan al mateix punt en cada moment.
8 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Per què calen cristalls si no podem estudiar per raig X estructures en solució? Senzillament perquè una molècula sola donaria una senyal molt petita. Necessitem que la senyal que detectem vingui de moltes molècules en una orientació idèntica. El cristall és com un amplificador.
L’etapa més difícil de la cristal·lografia és intentar fer créixer el cristall, no és fàcil ni previsible.
Una vegada torbem les condicions sí que ho podem reproduir. La cristal·lografia es fa amb un robot ara. Què necessitem per fer un cristall de proteïna? 1. Molta proteïna, mínim 10mg. Això per algunes proteïnes és un valor normal i per altres se n’ha de produir molta.
2. Proteïna molt concentrada normalment 10mg/l o superior, això vol dir que ens juguem tot l’experiment en 1ml.
3. Pura, la proteïna si no és pura no cristal·litza. Pots tenir 95% de puresa, però si tens 90% de puresa i un 10% d’altres components proteics, la proteïna ja no cristal·litzarà.
Per tant, has de purificar la proteïna més d’un cop, i cada pas de purificació suposa pèrdua de proteïna.
4. La proteïna ha de ser homogènia. No va relacionat puresa amb homogènia. Tu pots purificar una carboxipeptidasa i resulta que la purifiques perfectament, però un 5% de les molècules s’han activat, que tenen un fragment lleugerament diferent (més curt).
Aquestes molècules és com si tingués un 90% de puresa, per tant no val.
5. Ha de ser estable. Vol dir que un cop s’ha format el cristall s’ha de mantenir.
Sempre que no es poden tenir mil·ligrams no es poden cristal·lografiar les proteïnes.
Quina és la idea? És iniciar el procés de cristal·lització amb una concentració diluïda (encara que 10mg/l sigui força alta) i aconseguir que la proteïna poc a poc es vagi concentrant fins a obtenir cristalls. Això ho pots aconseguir de moltes maneres diferents. L’exemple explicat a continuació rep el nom de gota penjant.
GOTA PENJANT: Es posa una gota de solució de proteïna penjant d’un vidre a sobre d’un recipient. Aquest recipient té una solució anomenada precipitat. El què passa és que la solució precipitant normalment és molt rica en sal o component higroscopis (capaç d’absorbir aigua).
L’aigua d’aquí poc a poc tendeix a formar vapor d’aigua i passa cap a la solució. La proteïna que hi ha a dins no s’evapora i això fa que la proteïna inicialment tenia una concentració de 10mg, però a mesura que va avançant va guanyant concentració (10,1-10,2mg...) fins que arriba en una concentració crítica que es poden formar cristalls.
9 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Perquè ens fem una idea de les dimensions: el pot que surt a la imatge té uns 10mm d’alçada.
Què faig? El que fas és que, com que la cristal·lització no és una ciència exacte, tu no saps les condicions en què la teva proteïna cristal·litza. Condicions vol dir dues coses: 1.
Quines condicions hi ha dins la gota 2.
Quines hi ha fora de la gota Les combinacions que pots fer són enormes, per això fem servir plaques de 96 pouets. En cada pouet i ha una condició diferent de proteïna i una condició diferent de solvent. La feinada és preparar tantes solucions com plaques. Ara ja venen solucions que estadísticament és més probable que la proteïna cristal·litzi. Ara bé, ningú et treu que hagis de mirar 960 pouets que els hauràs hagut de pipetejar. Ara ja existeixen robots que pipetegen i miren els cristalls. El domini SH3 és un encant perquè en dos dies tens cristalls boníssims.
Protocol Tenim un cristall, el portem al sincrotró, tenim molta sort perquè el cristall difracta (moltes vegades el cristall és preciós macroscòpicament però no difracta, i moltes altres també tenim un cristall preciós però són les sals que hi havia a la solució; afortunadament ho podem saber, podem tenyir en comàcid (?) i arribem a posar els cristalls dins la proteïna).
De totes les vegades que ho fas quants tenen èxit? Quan ho has de deixar d’intentar? Tot depèn de la proteïna i de la importància que tingui el que vols aconseguir, ja que pots estar molt de temps per fer-ho però et pot valer un Nobel aconseguir-ho.
Si no s’obté la proteïna es poden fer moltes coses, un exemple és que si la proteïna no funciona es pot intentar fer domini per domini, que normalment són molt més fàcils d’aconseguir. El problema és que moltes vegades els dominis per separat no et donen la informació que volem, que és la comunicació.
El seu grup fan mutants (no fan cristal·lografia, tenen un grup d’un company que ho fa per ells) de proteïnes per veure què ha canviat: conformació, estabilitat, etc. Quan ja tenen la condició de com cristal·litza wt, la resta és molt fàcil (el que és difícil és trobar la condició).
Hi ha molts estudis que s’han publicat amb només UN cristall, que ja és suficient.
10 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 El problema que hi ha és que el cristall és poc estable i el Raig X és molt potent. Per tant, el cristall SEMPRE acaba petant. La cosa interessant és si has pogut agafar dades abans que peti i s’oxidi.
El que fan els cristal·lògrafs ara és: - Es recull el cristall amb una nansa buida, que degut a la pressió hidrostàtica superficial es pot pescar.
- Es congela en Nitrogen 15 i amb presencia d’un criopreservant. De manera que quan posem el cristall en el feix no està congelat, però està molt fred i això fa que encara que l’escalfis tinguin molt temps de mesura.
Això que ens sembla tonto és molt nou i ha fet que les resolucions hagin augmentat molt.
Després que el cristall difracti dóna els patrons de difracció (aquella mena de puntets, segona figura de sota) però encara queda resoldre el problema de les fases.
Si l’aconseguim resoldre tindrem una densitat electrònica que es representa en una mena de xarxa. Aquest mapa de densitat electrònica és el veritable resultat de la tècnica (la tercera figura de sota).
Després s’ha d’intentar encaixar la nostra proteïna dins el mapa de difracció. En aquest moment obtindríem el quart dibuix, però penseu que és només això, un dibuix. El que és real és el mapa de densitat, els electrons en la molècula.
-Com encaixem una cosa amb l’altre? Què necessito? No podem resoldre l’estructura d’una proteïna per Raigs X si no sé tota la seva seqüència. El que hem de fer és intentar fer cabre la seqüència d’aminoàcids en aquesta estructura. Per tant, no té sentit fer la proba dels Raigs X sinó tenim la seqüència perquè tota la feina no servirà de res.
Si la resolució és molt bona podem llegir la seqüència directament de l’estructura ja que podríem arribar a veure fins i tot els anells de fenilalanina.
11 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Recordeu: - Mapa de densitat electrònica: El resultat real de l’experiment de difracció, una funció matemàtica que descriu les coordenades espacials dels electrons.
Pot passar que el cristall difracti però que ho faci a 6 Å : això no ens serveix per res! Ja que no podré col·locar cadenes laterals. Com menys Å més augmenta el volum de dades que s’obté.
Les normes de la difracció vénen donades per la llei de Bragg La difracció en un cristall de proteïnes funciona de la següent manera: Arriba un Raig (el dels Raigs X) i aquest (o una part ínfima d’aquest) és absorbida pels diferents àtoms del cristall. Aquests emeten una part de la radiació que han rebut.
A la pràctica, encara que parlem de difracció, ho podem veure com si fos una reflexió, com si fos un mirall que ho rebota. Penseu però que aquest rebot és per cada àtom.
Tenim, àtoms que difractaran la llum original d’una manera diferent. La majoria de feixos s’interferiran de manera destructiva. Però hi haurà uns quans feixos que interferiran de manera constructiva i són els que ocuparan una posició equivalent a l’espai en els diferents plans del cristall.
Fixeu-vos que el raig de sobre recorre una distància menor que el de sota (ja que el de sota fa la zona en blau de més a més) . Aquesta distància de més es pot calcular (la diferencia dels plans x sin de l’angle).
Tindré interferència constructiva quan es compleixi aquesta funció: d= distància entre plans λ= longitud d’ona 12 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Per tant, només quan hi hagi una distància entre pla i pla (que heu de pensar que un pla és equivalent a un àtom del cristall) hi haurà aquesta interferència constructiva. És per això que el raig ens dóna informació sobre la molècula. Com que volem saber l’estructura de tota la proteïna hem d’intentar agafar tants plans com sigui possible i, necessitem com més plans millor.
Podriem fer dues coses: - Moure el feix (no és possible, ja que és moure el sincrotró).
- Moure el cristall (és el que fem): Es tracta de moure’l com si fes el recorregut de tota una esfera i per cadascuna de les possibilitats que veiem en el dibuix recollim un patró de difracció.
Com més patrons millor. Tot i que el que normalment passa és que al moure uns 20 graus es trenca el cristall. El resultat que obtenim és un patró de molts punts que no es poden interpretar de cap de les maneres.
Cadascun dels punts és resultat d’una interferència constructiva i, per tant, informació sobre tota la molècula. Però no podem reconstruir la informació a partir d’aquí.
Per fer-ho necessitem tres coses: - Longitud d’ona (λ) : és coneguda (perquè és a la qual hem irradiat) - L’amplitud de l’ona : és coneguda ja que és la intensitat del punt (com més gran o intens és el punt, més ample és la l’ona) - Fase: quan irradiem perdem la fase, una funció matemàtica molt complex. El procés no es pot tirar enrere per aconseguir-la.
Quan ja tenim el mapa de difracció no tenim res, només unes eines molt bones per poder treballar.
-Com reconstruïm la fase? Hi ha diferents opcions: - Irradiar amb un altre longitud d’ona: això fa que canviïn els paràmetres de l’equació i per fer-ho necessitem un sincrotró que ho permeti, és a dir, que tingui dos feixos i pocs ho poden fer.
13 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 En la majoria dels casos tinc una amplitud i una intensitat d’irradiació constant i el que cal fer és el que anomenem: - MIR (Multiple Isomorphous Replacement): és difícil. Quan ja tenim el cristall i proteïna hem de formar un altre cristall en les mateixes condicions. En aquest segon cristall cal introduir àtoms pesats (que difracten molt més fort que un àtom normal, pex: seleni).
Necessitem molt pocs àtoms i en posicions molt concretes. Produïm en codi i fent que en comptes que incorpori cisteïna o metionina incorpori seleno-cisteïna o selenometionina. Això fa que trobem un Seleni en comptes del Sofre.
Quan ja ho tenim tornem a fer l’experiment i en el patró veurem molt fàcilment on s’han col·locat els àtoms pesats i amb això construïm la fase per triangulació.
A partir d’aquí i amb un model matemàtic molt complex ens acaba donant un mapa de densitat electrònica com aquest: Com que ja sabem la seqüència hem de col·locar les cadenes laterals als llocs on pertoca. Gràcies al computador és senzill.
-Cal que sempre resolguem la fase? Afortunadament si hi ha una proteïna en la base de dades que sigui molt semblant no cal. Però penseu que llavors no té gaire importància el que vosaltres esteu cristal·litzant. En el cas que hi sigui aprofitem el seu patró de difracció i fem l’anomenat reemplaçament molecular que ens passa la majoria de vegades.
14 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Si tu vols resoldre una proteïna que no s’ha resolt mai has de passar pel problema de la fase obligatòriament.
En els nostres mutants (les proteïnes que ells fan) no em de resoldre el problema de fase, no em de marcar, ja esta resolta la seva estructura per lo tant amb aquell patró de difracció ja sabem perfectament a que correspon cada punt.
Hi ha alguns residus que son molt característics, molt fàcils de veure, per exemple Trp, Tyr, Phe, His. Els residus aromàtics tenen molt de volum i són molt fàcils d’encabir. Es el primer que el programa es col·loca. Abans això es feia a mà, a ull.
Doncs aquesta es la interpretació d’un mapa de difracció, un mapa de densitat electrònica, i per la meva seqüència aquest es el millor fit possible. I Això es el que normalment jo us he ensenyat o us he representat.
Aquest es el resultat, ho poso a la màquina i el millor fit de la seqüència és aquest: - Si tinc una resolució de 3A, és la distància entre dos punts visibles de l’estructura. Tot el què estigui a menys de 3A no ho veure o ho veuré com un continu. Tinc informació només de la cadena principal, les cadenes laterals no estan definides i no les veig. Això es bo per segons què. Si la proteïna es petita no em serveix per res, però si la proteïna es un ultra complexa molecular, quan més gran sigui la proteïna normalment més dolenta es la difracció, perquè? Perquè menys molècules hi ha en els cristalls, pot ser suficient. Per exemple l’estructura cristal·lina del ribosoma. Va ser premi Nobel i va ser per rajos X ( va tardar 12 anys).
- 2 A, permet veure cadenes laterals i té tres vegades més 15 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 informació que 3A.
- 1A és resolució atòmica, permet veure els hidrògens. Desafortunadament la quantitat de proteïnes que difracten a 1A són molt poquetes.
Una resolució entre 1-2A es el millor. Fixeu-vos: Això que es? Trp. A 4A això no pots saber què és, a 3A comences a veure-ho una mica, a 2’5 falten densitat i a 1A veus els carbonis (els 6 carbonis), pots veure ponts d’hidrogen.
Puc veure, això és un substrat dintre d’un enzim, això és un àtom de zinc. Puc veure les diferents interaccions que em defineixen el centre actiu. No les veig, jo veig distàncies, però si veig distàncies i tinc un donador i un acceptor això és un pont d’hidrogen, si tinc una càrrega negativa i una positiva això és un enllaç.
NMR (ressonància magnètica nuclear) Permet fer una cosa que no permet fer la cristal·lografia de rajos X, permet veure l’estructura de proteïnes en solució. L’estructura s’adquireix en una solució líquida, per tant m’estalvio tots els problemes de muntar un cristall, no em fa falta. A més a més la proteïna estarà en el seu entorn natural. Problemes que presenta: - És una tècnica molt poc sensible. Em fa falta concentracions de proteïna molt elevades. I quan concentro molt la proteïna té un problema i és que pot agregar. El temps que necessito per fer una RMN es llarg, i durant el temps de l’experiment la proteïna em pot agregar.
- Té molt poca resolució, això fa que només el pugui utilitzar per proteïnes petites, fins a 30kDa comença a ser un límit raonable. (ribosoma impossible) 16 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Perquè? Fixeu- vos que quan us explicava rajos X i NMR? estan en els dos llocs de l’espectre, aquí estem treballant amb ones de radio que tenen una energia baixíssima, si l’energia es baixa la resolució es baixa.
Veureu que en rajos X veiem l’estructura perquè tenim un patró, un mapa electrònic que es l’estructura real. En RMN intuïm l’estructura.
Els àtoms que tenen un número atòmic imparell o de massa imparell tenen spin. Si el número de protons i neutrons es parell no serveix. Si un dels dos es imparell em serveix per fer NMN.
Normalment (no em pregunteu) utilitzo aquest tipus d’àtoms, on un es parell i l’altre es imparell (suposo que fa referència a les dos ultimes files de la taula).
El què utilitzo habitualment és el protó. És molt abundant, té spin ½ i puc fer ressonància magnètica. D’hidrogen a la proteïna n’hi ha molts, té moltes senyals, això es bo.
Però a l’aigua n’hi ha una passada, per tant quan jo vull ver una RMN haig d’eliminar la senyal de l’aigua.
Com l’elimino? Fent servir deuteris, faig servir aigua deuterada (amb deuteri). Aquesta no dona senyals en el lloc on dona senyal l’hidrogen.
O ho faig amb la proteïna deuterada i ho faig amb l’aigua (que es molt més complicat) o tinc una proteïna normal, purificada en un medi normal, i la poso aigua deuterada. L’aigua deuterada no altera per res les propietats la proteïna.
La idea és que els àtoms que tenen spin són com si fossin un petit magneto, tenen dos pols (N/S) i en solució el protó s’orienta en qualsevol posició perquè no hi ha ningú que mani ( s’hauria d’orientar d’acord amb els pols magnètics de la terra, però no tenen suficient força), però el que puc fer es aplicar un camp magnètic, i això es el que fa la RMN. (no és més que un gran electró-imant). Això fa que tots els protons s’orientin en un sentit, d’acord amb el camp. Un cop orientat, se li dona una senyal que es una radio-freqüència, aquesta fa que l’spin que està orientat passi a un estat d’excitació superior (es lo de sempre). L’àtom passa a un estat superior. Puc utilitzar radio-freqüències del 17 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 tipus que vulgui, de diferents intensitats... Veig el retorn d’aquest àtom al seu lloc original quan jo deixo d’irradiar.
Cadascun d’aquests quan retorna emet una certa energia i aquesta es la que jo detecto. La gràcia de RMN es que l’energia que jo detecto, la diferència entre el que jo tenia originalment i el que em retorna (sempre em retorna una mica menys d’energia ja ho sabeu), depèn de l’entorn de l’àtom d’hidrogen. Per tant si està en un OH em dona aquesta senyal, si l’hidrogen es un CH2 em dona una altre senyal, depèn de l’entorn químic em dona una senyal, em dona uns patrons de senyal. Un expert en MRN li poses això i et diu la molècula que es immediatament. MRN es fa servir moltíssim en química orgànica.
Això es un compost químic: Això es una proteïna (de 55aa): La proteïna de 55 aminoàcids és molt petita, però fixeu-vos quina quantitat de senyals. La informació s’ha perdut totalment. En un compost químic els entorns depenen de l’enllaç, però en una proteïna depenen de si tenen a prop un Trp, o una Phe, estan en solució, o estan 50% exposats, o no ho estan i l’entorn et dona una senyal diferent, cada protó et dona bàsicament una senyal diferent. Els espectres són molt complicats d’interpretar.
18 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Proteïna purificada (aquí posa marcada però no cal), un magneto, un protocol de recolliment.
Si tenim una proteïna tindrem sempre un espectre de RMN, sempre. No es com quan tinc rajos X que pot ser que no em difracti o no. El problema es si sereu capaços d’interpretar aquest espectre per després treure una funció que sigui capaç de fer això. Això és un espectre de RMN: Quins tipus de senyals tindré? Això que veieu aquí és la suma de tots els protons, per poder assignar una estructura de MRN el que es fa és fer espectres bidimensionals. Això que veieu aquí és aquesta diagonal de l’espectre, és com si tinguéssim els pics fent així. A banda tinc molts pics, em donen informació de cada pic de la diagonal a prop de què està. Aquí tinc tots els protons de tots els aminoàcids i de totes les cadenes laterals.
Quan tindré un pic a aquí? Quan aquest protó d’aquí estigui molt a prop d’aquest protó d’aquí (fa referència a un punt qualsevol de la imatge, ningú entén res, però més endavant ho explica millor). Cada pic d’aquí em diu que en l’espai estic a prop, que m’estic interferint. Aleshores, en funció del punt que jo faci servir tindré dos tipus d’informació: 19 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 La primera informació em detecta els protons que estan a prop i connectats per enllaços covalents. Què és això? Què m’està detectant? Cada aminoàcid, si faig servir aquest tipus de punts, tindrà una marca característica. I aquesta marca dependrà de quants protons tinguin i de com estan connectats en l’espai. Em permetrà identificar els aminoàcids que jo tingui a aquí, a la meva seqüència. Podré veure quin pic de la diagonal és la serina, quin és la fenilalanina, etc. No sabré res sobre la seqüència. Sabré el nombre de serines que tinc, per exemple. Per tant, per fer RMN necessito la seqüència de la proteïna, igual que amb rajos X.
Això em dirà on està.
A més a més, aquests protons formaran contactes d’ordre llarg, formaran contactes a l’estructura. Això ho veuré amb un altre tipus de freqüència (una em permet veure contactes curts i una altra em permet veure contactes curts i llargs).
Anem a veure NOESY (Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy). Imagineu-vos aquesta proteïna tan senzilla, que té només cinc aminoàcids: Això és la diagonal, si fos un espectre monodimensional hi hauria cinc pics (en l’espectre que hem vist hi hauria cinc pics -> no és el cas de les proteïnes, on tenen molts protons i cada protó és un pic en la diagonal; però imaginem-nos que només en tenim cinc). Si faig un experiment amb una freqüència NOESY i H-H estan a prop en l’espai es poden transferir energia, es veuen.
I això fa que m’aparegui un pic fora de la diagonal (els que senyalava abans). I aquest pic què m’està dient? Veig que això és un contacte 5,2 i hi ha un altre contacte simètric a l’altre costat, un contacte 2,5. A aquí hi ha transferència, hi ha senyal. Com més intens és el contacte més alta és la transferència, i això vol dir que més a prop estan en l’espai.
20 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Ja he resolt que 1 és una serina, 2 és una metionina... i ara sabré qui està a prop de qui. Tindré dos tipus d’àtoms que estaran a prop. els que estan a prop en seqüència, que estaran a prop i em donaran una senyal, i els que estiguin no consecutius en seqüència, sinó en estructura.
Es tracta d’anar comptant senyals i aquesta és la pinta que té d’espectre final.
Com més contactes vulguin millor resolució, però hi ha mapes que no es poden resoldre.
Aleshores, mapa COSY. Aquest em diu contactes a curt termini. Jo sé que si tinc una senyal a aquí, sé que és una serina (un punt qualsevol), si la tinc a aquí i a aquí, això és un triptòfan, etc.
I el NOESY, fixeu-vos que és com un COSY, tinc tota la informació d’un COSY, però a dalt hi tinc molta més informació. Cada contacte superior a aquí és un contacte en l’espai (superior a la diagonal).
Per tant, el resultat d’un experiment RMN és un espectre bidimensional, on hi ha tota la informació. I la diagonal és això d’aquí: I ara què faig? Formo una equació de molts graus amb moltes incògnites. Això és la seqüència en l’espai tal qual (A): 21 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Sé que aquest està en contacte amb aquest, que aquest està a prop d’aquest... (són els punts roses en la imatge). Uns contactes són seqüencials, mentre que també hi ha els contactes i+3.
Ara el què faig és que si tinc 200, 300, 800 o els contactes que sigui, resoldre l’equació que s’ajusti millor en aquests contactes. És una restricció de distàncies, com més contactes tinc més coses sé.
Aleshores, què és el que en aquest cas em diu? Que l’estructura ha de ser aquesta d’aquí (B).
Fixeu-vos que en algunes parts no tinc informació, idealment hauria de tenir informació sobre tot. Aleshores, quan la proteïna és molt gran, bé, a partir de 20KDa, en un mapa bidimensional els espectres se’m solapen. No tinc suficient resolució i em cal marcar la proteïna (això és molt habitual). Igual que abans marcàvem amb seleni, ara marquem amb C13 o N15. Fem créixer els bacteris en un medi que no té C12 ni N14, sinó que té isòtops. La proteïna té molts carbonis i nitrògens (cada enllaç peptídic té un nitrogen i un carboni).
Ara el què faig és RMN en 3D, no us ensenyaré els resultats. Cadascun d’aquests pics que estaria en pla, ara donarà un pic a l’àrea, tindré (x, y, z) i podré identificar tots els nitrògens i podré saber si el protó aquest està a prop del N1, per exemple. Genero un mapa de RMN en 3D. Els resultats són aquests d’aquí (imatge esquerra) (això és la proteïna de 55 aminoàcids): Normalment el bidimensional em permet veure bastant bé quina serà l’estructura global, però no em permet molta resolució. Amb el suficient nombre de contactes em dóna molta resolució, la mateixa resolució que raigs X, ara bé, fixeu-vos aquesta informació. Si jo us ensenyo això d’aquí (dreta), això d’aquí és igual que el què us presentaria en una estructura de raigs X, però el resultat de l’experiment és realment aquest d’aquí (esquerra). Què és això d’aquí? Normalment sempre representem el què diem 20 conformers. Com sabeu, com més complexa és una equació més solucions té. Això són 20 solucions que compleixen els requisits impostats per l’estructura. Quina és millor que una altra? No se sap, totes vint són estructures que d’acord amb els contactes que jo tinc són reals.
22 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 Quina avantatge em dóna això? Això m’està informant de la flexibilitat de la cadena (la imatge de l’esquerra), de com s’estan movent les cadenes laterals en solució (aquesta informació no la tinc en raigs X, on estan fixades). El fet que tingui tantes solucions vol dir que quan estava recollint en un moment estava a aquí, en l’altre estava més enllà, en l’altre una mica més enllà, etc. S’estava movent i això em dóna informació dinàmica. Em diu, per exemple, que aquest residu d’aquí és molt dinàmic (encerclat a la imatge) i que pot estar implicat en binding. Fixeuvos els residus del centre, els residus del centre estan perfectament definits. Què és això? És el core hidrofòbic, que està perfectament empaquetat, és com un cristall, no es mouen i cada vegada que mesuri estarà sempre en la mateixa posició.
El programa a base d’anar agafant estructures, interaccions, cada vegada té més restriccions de distància. I això ho puc fer tant com vulgui. Puc tenir una estructura, fer-li un nou experiment i incorporar noves restriccions.
Aquesta és una estructura d’alta resolució (imatge). Cada punt que veieu és un punt en l’espectre. Això és el què ha fet servir el programa matemàtic, són restriccions de distàncies. I això de què depèn? Bàsicament de la intensitat del punt i de la seva posició.
Però això és una estructura de molt alta resolució.
Això és el què fa el programa, és una solució a un problema, però no ho veureu mai, és a dir, no existeix aquesta estructura com a tal, l’esteu deduint. A aquí teniu unes quantes estructures, tenen aquesta pinta, els loops es mouen...: Em permeten fer coses que no puc fer amb raigs X de manera fàcil. Qui fa servir molt RMN? Ho fa servir molt, i totes les companyies ho tenen, les companyies farmacèutiques. Imagineu que sou una companyia farmacèutica i teniu una estructura resolta amb RMN molt “guai” i una 23 Química i Enginyeria de les Proteïnes, Parcial 2 proteïna molt “guai” i el vostre departament es dedica a buscar drogues que interaccionin amb aquesta proteïna. I voleu saber de manera molt ràpida, sense esperar a tenir la sort que es formi un cristall, si interacciona i a on interacciona, sense haver fet molts càlculs, vol un screening ràpid. Per exemple, ho està fent la gent que està treballant amb APP. Què faig? Tinc un compost, tinc l’estructura de RMN. Si tinc raigs X què puc fer? Intentar muntar l’estructura amb els cristalls. Però no podré muntar-ho per totes, perquè la gran majoria no serviran per res, no interaccionaran. Què faig: tinc la meva proteïna en un tub, he recollit l’espectre de RMN, que sempre és igual en la proteïna si no l’escalfo o la desnaturalitzo. Poso el compost. Si el compost interacciona amb algun hidrogen, aquell hidrogen canvia d’entorn químic i la senyal ja no hi és (el punt), se’n va a un altre lloc. De manera que l’únic que he de fer és comparar espectres de RMN. Cada punt d’aquests em diu un contacte. Si aquest punt desapareix per a qualsevol compost, aquest compost està interaccionant a aquí. Vosaltres ja teniu l’estructura assignada, ja sabeu què és cadascun d’ells, sabeu cada punt, no només a quin aminoàcid correspon, sinó que a quin hidrogen correspon (alfa, beta...). Per tant, és tan senzill com agafar la proteïna i anar posant compostos i mirar si canvien la senyal. És un sistema de screening molt útil. Això no puc fer-ho per raigs X així de ràpid.
Aquesta és la primera proteïna que es va resoldre per RMN: Es va publicar en una revista que és bona, però que no és excepcional perquè fins en aquell moment a ningú se li havia acudit utilitzar RMN per analitzar proteïnes.
Premi Nobel de Química 2002 perquè ens ha permès descobrir un nou món. El primer home (de la foto) va posar les bases teòriques, el segon va construir la màquina (el xinet) i el tercer va resoldre l’estructura.
24 ...