Problemes resolts sessió 9 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Ejercicio Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 0
Subido por

Descripción

Inclou els problemes resolts corresponents a la sessió 9 de grup mitjà de l'assignatura Biologia Molecular.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) SESSIÓ 9 35. Un vector circular de clonatge porta dues dianes EcoRI que donen lloc a dos fragments de mides molt diferents. L'origen de replicació queda situat en el fragment gran. Si es digereix el vector amb EcoRI i s’afegeix un fragment de DNA per a clonar que ha estat tallat també amb EcoRI, indicar, després del lligament, totes les possibles construccions que en resultarien amb 1 o 2 fragments de DNA units i quines d'aquestes construccions podrien replicar de forma autònoma en la soca d’E. coli hoste.
36. Un tipus cel·lular particular és capaç de fer una substància X en resposta a l'hormona H. Abans d'exposar un cultiu d’aquest tipus cel·lular a l'hormona H, es pot trobar una molècula de RNA llarga en el nucli cel·lular, amb el CAP i la cua poli A. Després de l'addició de l'hormona H, aquest RNA no es troba, però es troba un segon RNA en polisomes citoplasmàtics, el qual en un sistema de síntesi proteica in vitro dóna lloc al polipèptid X. Ambdues molècules de RNA hibriden en un experiment de Southern amb la mateixa molècula de DNA clonat. Quin és el mecanisme que es pot estar utilitzant pel control hormonal de la síntesi de X? 1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Si tots dos hibriden amb el mateix DNA què significa?  un és més llarg i l’altre és més curt. Això ens pot estar dient que hi ha hagut SPLICING. És a dir, si tots dos RNA hibriden amb el mateix fragment de DNA hem de pensar que estaven codificats pel mateix gen i un és més llarg i l’altre és mes curt, un està al nucli i l’altre al citosol.
Probablement provenen del mateix gen i un correspon al pre-mRNA i l’altre ja ha sortit al citosol.
Aquesta hormona quin efecte pot estar provocant? La sortida del nucli i afecta, per tant, al procés de regulació de l’splicing. Amb presència d’hormona surt del nucli i és més curt. També podria estar regulant el transport del nucli cap al citosol. La hormona podria afectar al splicing del pre-mRNA o a tots dos.
Podríem trobar el fragment curt al nucli si el transport no funcionés. No podem dir que no sigui així i a priori pensem que està regulant tots dos processos.
37. Quan es clona un fragment de DNA forà en un plasmidi sol ser útil inserir el fragment en un lloc que interrompi un marcador de selecció amb la finalitat de seleccionar transformants que hagin incorporat el plasmidi que porta l'insert. Si s’utilitza com a vector de clonatge un còsmid això pot ser innecessari. Saps dir per què i en quines circumstancies? L’endonucleasa només podrà tallar si s’ha produït la inserció del fragment amb la mida adient. Si s’acaba empaquetant finalment significa que s’ha unit el fragment de la mida adient. S’ha produït la reacció de lligament i en principi no necessiten marcadors de selecció.
Còsmids són construccions artificials o vectors que tenen característiques de plasmidi i a més a més incorporen com a seqüències externes les seqüències COS del fag landa. En comptes de còsmid podem posar fag landa.
Ús dels genomes de fag landa com a vectors.
Alfa complementacions. Si quan tallem pel punt que sigui de la regió policonnectora expressarà lac Z i quan fiquem un substrat artificial (X-gal) i si hi ha activitat beta gal dona colònies de color blau tot ser X gal transparent. Això si no incorpora cap fragment, relligat.
2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Quan transformi les soques la betagalactosidasa serà defectiva i obtindrem colònies de color blanc perquè tot i afegir Xgal no es dóna la reacció. Això si incorpora el fragment enmig del marcador.
Si utilitzem còsmids tot això pot ser NO necessari.
Si són còsmids o fagsmids són regions policonnectores amb un origen de replicació, por portar marcador de selecció... tallem amb un enzim de restricció i tindrem un extrem que sigui EcoRI, després la seqüència cos, després el marcador de resistència a la tetraciclina i després la diana per EcoRI. Tant el fag landa com els còsmids formen concatèmers. Aquí vindria el meu fragment. I aquí com és EcoRI podem tornar a enganxar amb un vector que porta la seqüència cos, tetraciclina, diana....
Els còsmids tenen l’avantatge (igual que el fag landa amb un braç esquerre i un braç dret que forma concatèmers) a menys que hàgim inserit el fragment que volem de mida desitjada no es pot encapsidar in vitro. Aquí passa el mateix, tenim concatèmers i a menys que hàgim introduït el fragment, la distància entre la seqüència cos i la següent no serà l’adient o necessària per ser reconeguda per l’endonucleasa i per poder encapsidar, formar virions in vitro.
Si no hi hem inserit el fragment no podrem formar virions in vitro.
38. El vector de clonació plasmídic pBR322 es talla mitjançant EcoRI, i mitjançant una reacció de lligament s'aconsegueix una molècula recombinant que porta un gen eucariota que també havia estat tallat amb EcoRI. Amb la barreja de lligament es transformen cèl·lules d'E. coli i se seleccionen les cèl·lules transformades gràcies al marcador de selecció del pBR322 que és un gen de resistència a tetraciclina.
a. Totes aquelles colònies que creixin en un medi amb l’antibiòtic hauran incorporat el gen eucariota? Quines possibilitats tens? Sí. Algunes, tot i posar l’antibiòtic creixeran igualment perquè portaran el vector recircularitzat. Hi ha possibilitat d’obtenir relligar (vector tancat sobre sí mateix) més els que incorporin el fragment de DNA. També es pot realitzar una unió de n B i un A.
b. Dissenya un o més experiments que permetin incrementar el nombre de colònies que portin el gen eucariota.
En el cas que hi hagi la primera opció o la última (empipa).
- Per evitar el primer cas (relligats) es pot realitzar (FINAL DEL TEMA 6): Utilitzar dos enzims de restricció diferents que deixin extrems cohesius però que no siguin complementaris, és a dir, realitzar un clonatge direccional.
Utilitzar enzims isocaudòmers. Tallo el vector amb A i el insert amb B. A i B són els isocaudòmers. Faig la meva reacció de lligament amb A. S’obre el vector i només entren els B.
Eliminar el fosfat amb fosfatasa alcalina SOBRE EL VECTOR. No podrem tancar el vector sobre sí mateix.
- Per evitar el tercer cas, és a dir, més d’un inserit: DIANA EN EL FRAGMENT QUE NO ESTÀ ENMIG DEL VECTOR. Tallo el vector amb A i el insert amb A també però al insert tenim una diana per B. A i B són els 3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) isocaudòmers. Faig la meva reacció de lligament amb A. S’obre el vector i només entren els B. POT ENTRAR MÉS DE  Purifiquem i tractem amb DNA lligasa.
En el cas de tallar el vector amb A i el insert amb B, utilitzem DNA lligasa i afegim B, tots els fragments inserits quedaran tallats (tenim més d’un fragment inserit i volem aconseguir només tenir un) però no quedaran tallats els que porten una diana mixta BA. Al final aconseguim que només hi hagi un fragment inserit, no més. Els concatèmers dins del vector quedaran tallats. La que s’obre es perd, perquè s’ha tallat.
El que només té un fragment no es tallarà i per tant queda constància.
4 ...

Tags:
Comprar Previsualizar