Tema 2: Mètodes d'estudi de l'ecologia microbiana (I) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura ecología microbiana
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 30/03/2016
Descargas 12
Subido por

Vista previa del texto

Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll TEMA 2: MÈTODES D'ESTUDI DE L'ECOLOGIA MICROBIANA (I) En aquest tema parlem del mostreig, és a dir, la part bàsica per a que les tècniques que apliquem posteriorment surtin bé. El mostreig està relacionat amb el camp i dependrà bàsicament de l'ambient que haguem de mostrejar. En ecologia microbiana, trobem tres qüestions fonamentals/objectius fonamentals: – Que hi ha? → DIVERSITAT – Quants n'hi ha? → ABUNDÀNCIA – Què poden fer? → ACTIVITAT Si pots respondre aquestes tres preguntes a partir de la teva mostra, pots entendre el ecosistema que estàs estudiant.
En quan al mostreig, trobem tres fases molt diferenciades: 1) RECOLLIDA DE MOSTRES Per examinar els microorganismes en sistemes naturals, cal tenir en compte que no es poden observar directament, sinò que és molt important que s'agafin i s'analitzin submostres representatives, les quals ens permetràn obtenirs resultats que s'han extrapolat a la totalitat de la comunitat o de l'ecosistema.
En aquest cas, és molt difícil ja que poden sorgir molts problemes, com per exemple, en molts ambients la distribuició dels microorganismes és heterogènia, degut a la presència de diversos i multiples microhàbitats que es troben en un únic hàbitat. Per tant, podem dir que la forma de recollir i processar les mostres pot influir profundament en el resultat de les mesures.
El métode de mostreig dependrà bàsicament de l'ambient que es vol mostrejar; dependràn, per tant, de les propietats fisicoquímiques de l'ecosistema sotmès a estudi, de l'abundància esperada dels microorganismes (necessitarem saber quanta mostra hem de recollir) i els procediments de recompte i mesura utilitzats.
Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll Per altre banda, el mètode de mostreig ha d'assegurar la no alteració de les mostres fins el seu processament final i, finalment, l'aspecte de que els microorganismes només provenen de l'ecosistema que s'està estudiant. Per cada tipus d'ambient necessitarem uns dispositius de mostreig diferents. Abans d'anar a mostrejar, has de saber que és el que vols fer i quin és l'objectiu del teu estudi, ja que depenent del teu objectiu hauràs d'agafar una quantitat o una altre de mostra.
A partir d'aquí, podem establir dos exemples de recollida de la mostra depenent d'on estigui situada: si volem agafar mostres de diferents altures del mar, necessitarem un pilot de control remot, un sistema CTD. Tambè hi han robots, com el robot Alvin, on es pot baixar fins a 4.500 metres de profunditat del mar per poder mostrejar tant mostres d'aigua com de sediment.
Són dos sistemes per agafar les mostres indirectes i molt útils a profunditats molt grans.
1.1) Recollida de mostres del sòl Per tal de poder realitzar la recollida de mostres en un ambient com és el sól, primerament hem de tenir molt presents les seves característiques. El sól és un ambient molt estable (poca alteració de la mostra) i presenta una elevada diversitat i alt nombre de microorganismes (abundància i riquesa elevats).
Abans de començar un anàlisis de la microbiologia del sòl, és important seleccionar un disseny experimental adequat i una estratègia de mostreig. El mostreig podria ser dividir una parcela en diferents sectors en base de les propietas del sól, ja que aquest tipus de mostreis és l'estratègia més comuna. A part d'agafar la mostra , s'ha de tenir la màxima informació del ambient (tipografia, pH, textura, temperatura, tipus de vegetació), per tal de realitzar sectors a niv ell de la parcela en referència a tots aquest paràmetres fisico-químics.
Un cop agafes la mostra, pots agafar rèpliques d'un mateix lloc, però aixó dependrà dels objectius del propi investigador.
La gran abundància de microorganismes en el sòl relativitza l'acció de possibles contaminants. Ja a l'hora de obtenir la mostra, degut a que hi ha molts microorganismes i l'ambient és molt estable, simplement amb una pala i una galleda nets podries agafar la teva mostra. Però si desitja obtenir una mostra de sòl d'una profunditat determinada, s'utilitza un mostrejador cilíndic anomenat corer. Aquest instrument es tracta d'un cilindre que s'introdueix al sól i desprès, la mostra surt amb ell; això es degut a què a la seva punta trobem una espècie de vora tallant, el que et permet obtenir la mostra i les diferents capes. Trobem Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll de diferents mesures i profunditats, i tambè poden estar associats a un motor.
A vegades ens podem trobar que el nombre de microorganismes és relativament baix, per tant, s'utilitzen sistemes que permeten el creixement ''in situ'' . Dintre d'aquests sistemes, trobem diferents exemples: – Tècnica Cholodny-Rossi (portaobjectes enterrat): el que es fa es utilitzar un portaobjectes que s'enterra al sòl i es deixa uns quants dies. En aquest portjaobjectes s'hi inseriran microorganismes d'aquell ambient. No és una tècnica selectiva, ja que es comporta com el sól que l'envolta.
– Reixeta de microscòpia electrònica: un cop extretes del sòl, ens permetran observar els microorganismes directament als microscopis electrònics.
– Capil·lars plans de vidre: pedoscopis (sòl) i peloscopis (sediments, els quals presenten una interfase d'aigua). En comptes d'introduir un portaobjectes, es poden introduir capil·lars plans de vidre, on els microorganismes entraràn a l'interior com si fos una substància porosa del sól. A mès si a l'interior del capil·lar posem una substància o líquid característic, estaríem fent un enriquiment, ja que estaríem seleccionant uns microorganismes concrets.
Gràcies a aquest tipus de tècniques capil·lars , s'han pogut realitzar diferents estudis com l'observació de diferents microorganismes (algues, protozous, Caulobacter, Gallionella, Metallogenium...). Tambè es va poder realitzar la descripció de nous gèneres de microorganismes no cultivables segons la seva morfologia i per últim, tambè es va poder arribar a observar les diferents fases de cicles biològics.
Desprès de la pressa de mostres, en el cas que no es poguès tractar-la i proccesament al mateix moment, s'ha de realitzar un bon magatzem i pretractament de mostres.
Primerament, has d'emmagatzemar-la a la nevera o al congelador a 4ºC fins a 3 setmanes (màxim). En el cas que fossin periodes més llargs, haurien d'estar conservades a -20ºC. Un cop has d'analitzar la mostra, es descongela i tot seguit, es garbella per una malla de 2 mm (5 mm en terres humits, o bé pressecar) per tal d'eliminar totes les pedres o materials que es troben en aquell sól i que no són útils per l'anàlisis dels microorganismes presents.
Ecologia TEMA 2 1.2) Ariadna López Coll Recollida de mostres d'aigua Per tal de poder realitzar la recollida de mostres en un ambient com és l'aigua, primerament hem de tenir molt presents les seves característiques. L'aigua és un ambient molt variable respecte a l'estabilitat i diversitat de microorganismes.
Dins de l'ambient de l'aigua, tenim un espectre d'hàbitats molt ampli, i per tant, la diversitat de comunitats associades és tan ampli que cal revisar curosament els protocols de mostreig abans d'aplicar-los al lloc d'estudi. La metodologia dependrà del hàbitat que vulguis estudiar i analitzar.
En aquests ambients són molt importants els cicles, ja que existeixen uns gradients molt importants i abruptes d'energia en la zona eufòtica, de llum envers la fondària (latitud) i gradients importants de nutrients; no és el mateix una zona costanera que una zona d'alta mar, ja que influirà a la comunitat que visqui allà (gradients horitzontals i gradients verticals).
Tambè trobem variacions diàries (entre el dia i la nit), interestacionals i interanuals que cal tenir en compte alhora d'estudiar els processos microbians.
Es requereix un programa de mostreig rigurós i ben dissenyat, mètodes apropiats de recollida de mostres. A l'hora de mostrejar, ens hem de realitzar un seguit dre preguntes com: – Escala de temps? Cicle anual, cicle mensual, cicle setmanal, els quals depenen dels objectius del treball i de la comunitat que vulguis estudiar.
– Variabilitat espaial? Volem mostrejar una profunditat o vàries? – Volum d'aigua? – Dades complementàries del ambient. Substrats dissolts, gasos dissolts, matèria particulada...
– Rèpliques Quan es volen estudiar oceans o mars, el que es fa són transectes (es dibuixen línies sobre el recorregut que realitza el vaixell i es senyalen els punts que es volen estudiar o vols mostrejar, els quals serien els diferents llocs de mostreig) amb un objectiu únic d'estudi. És com una espècie de ''planning''.
A l'hora d'estudiar un ambient com l'aigua, s'han de tenir en compte tots els paràmetres físico-químics presents: fondària, temperatura, salinitat (conductivitat), oxigen dissolt, llum, Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll fluorescència, pH, redox... Com l'aigua és un ambient molt canviant i variable, cal mesurar cada vegada els paràmetres.
Per poder mesurar aquests factors, tenim diferents aparells que ens ajuden a mesurar les profunditats gràcies a diferents sondes (desde la superfície). La mesura dels paràmetres en profunditat s'anomena perfil fisicoquímic, i la construcció da'quests en ajuden a decidir quines fondàries són les que s'hauran de mostrejar, ja que es veu com els paràmetres, a partir d'un punt concret, vaein molt més lentament (més estabilitat, per tant, punts clau on mostrejar). Abans d'aquestes sondes, teniem diferenTs mesuradors de llum o el disc de Secchi , que és una espècie de cercle que amb un cable es va baixant fins que arriba al límit a on es deixa de veure el disc → serveix per mirar la terbolesa de les aigües per veure la fondària, ja que no és un mesurador molt exacte, però si que és molt útil per comparar com està l'aigua de tèrbola entre unes èpoques i unes altres → distància de Secchi.
Com a totes les recollides de mostres, podem trobar problemes; alguns d'ells serien l'accessibilitat, sobretots a les fondàries, ja que hem d'utilitzar controls remots. Per altre banda, tambè podem trobar el problema de la contaminació per organismes no autòctons (hem d'aconseguir la mínima mostra d'aquests per no alterar la nostra mesura).
Hi ha diferents dispositius de mostreig, com barques o instal·lacions fixes, en les quals s'hi pot guardar material o instarlar-hi sondes. En quan als aparells que podem utilitzar per obtenir mostres, principalment trobem les xarxes, amb les quals no reculls això sinò que pots recolllir algues i protozous planctònics, és a dir, microorganismes més grans (trobem tant xarxes per fitoplàncton, xarxes per zooplàncton i màneques per plàncton). Desprès, aquestes mostres es resuspenen en un altre ambient per tal d'aconseguir l'aïllament i obtenció de bacteris mitjançant la concentració d'aquests. Per tal de recollir bacteris, el que s'ha de fer es recollir aigua i al laboratori realitzar el tractament d'aquesta mostra.
Hi han diversos dispositius; antigament els microbiòlegs estaven molt preocupats per la contaminació, pel tema de que no hi haguès microorganismes autòctons per contaminar la mostra, per tant es van dissenyar diferents mostrejadors poc pràctics.
– Mostrejador Johnson- Zobell:, el qual és estèril degut a que trobem el buit. Està format per un tub de vidre i un tub de goma connectats. Al baixar-lo a la profunditat desitjada, es provoca la obertura de les ampolles mitjançant el missatger o testimoni (suposa un pes important), el qual impacta contra el tub de vidre i el trenca. El tub de Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll goma d'entrada queda lliure i l'aigua pot entrar. El recipient es troba en buit i l'aigua entrarà per pressió negativa. Al no omplir-se més, el pots recuperar. Si has de recollir moltes mostres, has d'utilitzar un recipient nou, per tant, és poc pràctic, però sempre estèril.
– Bossa papallona de Niskin és un altre aparell que consisteix en una bossa que està connectada a un sistema de motlles. Presenta un tub de goma d'entrada que està tancat i una ganiveta. En aquest cas, tambè tenim un missatger que cau sobre la ganiveta, aquesta talla la goma del tub i l'aigua pot entrar. La bossa de plàstic tambè és estèril.
Avui en dia s'utilitzen les ampolles hidrogràfiques, de les quals tenim dos dissenys (pero és el mateix); es poden obrir pels laterals i estàn conectades a un cable, es poden baixar a la profunditat desitjada, no són estèrils però si que han d'estar netes, i sels hi pot passar un reix d'àcid clorhidríc. Quan es troba a la profunditat desitjada i omplerta, es llença un missatger que provoca un impacte contra la ampolla i gràcies al sistema de motlles, es tanca. Aquestes ampolles poden ser ampolles de Nansen ( mostreig vertical) o ampolles de Van Dorn (mostreig horitzontal i està oberta pels dos costats).
Un altre tipus d'ampolla és la ampolla de Niskin, que s'utilitza en el sistema CTD, el qual presenta entre 25-30 ampolles d'aquestes en un suport metàlic que presenten diferents sensors per mesurar diferents factors hidrogràfics (molt útil per fer perfils fisicoquímics per tal de decidir quines fundàries es poden mostrejar) . Controlen de manera electrònica les ampolles que s'obren en determinades profunditats per tal de determinar diferents paràmetres Les ampolles Ruttner s'utilitza per llacs i dins pot portar termòmetres.
Com a tots els dispositius de mostreig, trobem un seguit de problemes que poden sorgir degut al mal funcionament d'aquests. Pot ser que si l'ampolla no tanca bé, la mostra recollida estigui contaminada amb aigua de diferents fondàries, i per tant, diferents condicions que poden suposar diferents comunitats microbianes. Per altre banda, tambè es pot produir contaminació degut al cable hidrogràfic que presenten aquests sistemes. Per evitar-ho, a la punta hi ha una xeringa que, quan es llença el testimoni, s'omple per tal de que no entri l'aigua pel cable.
Ecologia TEMA 2 1.3) Ariadna López Coll Recollida de mostres de sediment Per tal de poder realitzar la recollida de mostres en un ambient com és el sediment primerament hem de tenir molt presents les seves característiques. El sediment és un ambient molt estable amb un gran nombre de microorganismes i elevada diversitat.
Per tal de mesurar els paràmetres fisico-químics d'aquest ambient, utilitzem microelectròdes. Aquests són una espècie de sensors microscòpics que es poden posar a l'interior del sòl i poden recollir diferents paràmetres, com per exemple nivells d'oxigen, sulfhídric, òxid nitrós, nitrat, nitrit, hidrogen, i inclús paràmetres com el pH i la temperatura.
S'utilitza sobretot en els mantells microbians, i aquests són sediment on les comunitats s'han estratificat en base a paràmetres fisicoquímics com la llum (trobem diferents capes amb coloracions diferents degut a les diferents condicions determinants del creixement d'uns o d'uns altres). Els mantells microbians es troben en zones intermareals com el Delta de l'Ebre.
Els microelectrodes realitzen els perfils fisicoquímics a escala milimètrica de sediment.
Si la mostra que volem obtenir de sediment són poc accessibles, necessitarem aparells més contundents, com per exemple: – Dragues o corers cilíndrics (draga Van Veen): es tracta d'un sistema de culleres semblants a les ampolles hidrogràfiques, les quals gràcies a un missatger es tanquen i recullen sediments. Baixa de manera oberta i al llençar el missatger es tanca. L'únic defecte que presenten és que el sediment es trobarà barrejat amb aigua, mentres que lo ideal seria que no fos així.
– Box corers: es tracta d'una espècie de caixa que es baixa fins al sediment, on es llença posteriorment un missatges i la guillotina present en aquesta capsa es tanca. En aquest cas és millor perquè no hi trobem interfase d'aigua.
– Corer de gravetat: en aquest cas, el baixem per efecte de la gravetat i s'introdueix a dins del sól, on s'agafa la part de mostra interessada. És tracta d'un sistema molt fiable.
– Sistema multicorer: dispositius amb diversos corers que s'introdueixen en el sediment i aquest és succionat. En aquest cas, tampoc trobem interfase d'aigua i permet obtenir diferents mostres a l'hora Ecologia TEMA 2 – Ariadna López Coll Submarinistes i/o aparells submergibles: mostrejar de manera presencial o bè, en el cas dels submarins, a travès de diferents sondes i braços mostrejadors per agafar mostres d'incubació in situ. Un exemple seria el robot Alvin, el qual va descobrir el Titanic.
1.4) Recollida de mostres de l'aire Per tal de poder realitzar la recollida de mostres en un ambient com és l'aire, primerament hem de tenir molt presents les seves característiques. L'aire és utilitzat principalment com a medi de dispersió (molt útil en contaminació d'indústries o ambients clínics), en el qual trobem pocs microorganismes (abundància baixa) però una alta diversitat i homogeneitat.
Tambè trobem que és un ambient amb estabilitat molt baixa.
La recollida de microorganismes viables de l'aire requereix mecanismes que minimitzin l'estrés del mostreig i que permetin l'obtenció de mostres del tamany de les gotes de bioaerosol, sense matar als microorganismes i així que estiguin vius per analitzar-los. Dintre dels diferents mètodes que trobem, tenim el mostreig passiu, el qual és més fiable a l'hora d'obtenir espores fúngiques (molt útil per sedimentació). Per altre banda, tenim el recipient d'Andersen, el qual s'utilitza pels bacteris i és com una mena d'aspiradora que s'encarrega d'aspirar l'aire per una reixeta (on queden adherits) i es col·loca en una placa de Petri amb Agar (amb un medi específic amb el que volem seleccionar o fer crèixer). La quantitat d'aire pot ser variada amb la pròpia màquina.
1.5) Recollida de mostres biològiques A l'hora d'obtenir mostres biològiques, s'ha de tenir en compte la recuperació de microorganismes en plantes i animals, és a dir, el mostreig. Aquest es pot realitzar gràcies a la recollida de fluids vitals, gràcies a la dissecció de diferents teixits, gràcies a la recollida de productes d'excreció i finalment tambè, gràcies al mostreig de teixits de superfície (mitjançant escovillons). Els escovillons ajuden a recollir aquest tipus de mostra, ja que fent un fricció sobre la superfície a mostrejar ja podem obtenir mostra. En aquest cas, els microorganismes no poden estar adherits formatment a la superfície i a vegades no es poden separar de teixits vius (el cas dels virus).
Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll 2) PROCESSAMENT Abans de processar les mostres, moltes d'elles s'han de preservar, ja que no és possible tractar-les a l'instant. Tant siguin de l'ambient que siguin, hem de realitzar-ho mitjançant envasos adients els quals siguin inerts (que no reaccionin amb la mostra o el vidre). Tambè s'ha d'utilitzar un volum adequat. Per altre banda, les mostres sempre han d'estar etiquetades correctament amb la data de mostreig, el lloc, el contingut, la rèplica que sigui... Un cop han sigut ben etiquetades, s'ha de realitzar un transport i processament el més ràpid possible al laboratori (mitjançant neveres, per a que la comunitat microbiana present no es modifiqui.
Tambè hem de tenir en compte el temps entre congelació-descongelació, el qual hade ser mínim. I per últim, i només en alguns caos, s'haurà de realitzar la fixació de la mostra, on el que es fa es matar a la comunitat mitjançant formaldehid per tal de mantenir les condicions actuals i no es modifiqui cap aspecte.
Ara si, un cop preservades, passem al processament d'aquestes. En quan a la mostra dels nostres microorganismes, sempre veurem que o bé hi ha molta concentració de microorganismes (per tant, no es pot comptar res) o bé que no hi han quasi cap. En el primer cas, el que es fa és un dilució per tal de diluïr la mostra i disminuir la concentració present (parlem de dilucions seriades, on desprès, a l'hora del recompte, hauràs de tenir en compte les dilucions realitzades). En el segon cas, el que es fa és una concentració mitjançant o bé centrifugació o bé filtració.
En quan a problemes que poden sorgir envers aquest processament, podem observar que la comunitat és pot modificar si no seguim un processament estricte. A vegades, per exemple, en el mostreig de l'aigua del mar, els nutrients es queden adquirits a la paret d'ampolla i els microorganismes comencen a crèixer aprofitant-los de manera no desitjada. Aquest seria l'efecte ampolla. Tambè pot ser que es produeixi la mort molts microorganismes.
Hi ha vegades, sobretot en els bacteris del sól, que s'ha d'agitar per a que els microorganismes es desenganxin en aquelles mostres que estan formats per partícules. En aquest procès, has d'assegurar un procès d'agitació per tal de desenganxar-los, però s'ha d'optimitzar. Depenent del tipus de mostra, pots obtenir un resultat o un altre.
El tipus de diluient tambè s'ha de triar segons el que vulguis estudiar,, ja que l'ús d'un o un altre fa variar les corbres de creixemen; són factors que tambè s'han de tenir en compte a l'hora del processament de les mostres i trobem diferents tipus com per exemple aigua, Ecologia TEMA 2 Ariadna López Coll pirofosfats, solució de Ringer....
Quan vols filtrar per tal de concentrar, tambè es important el tipus de filtre que faràs servir, ja que trobem de diferents mides i formes; filtres de bicarbonat o filtres de cel·lulosa, els quals són heterogenis, a que els porus són més petits, i filtres de fibres entrecreuades que s'utilitzen sobretot com a prefiltres o maies per a microorganismes més grans.
Les condicions no compatibles amb els requeriments fisiològics de grups particulars de microorganismes produiràn resultats inferiors als reals.
3) MESURES - ...