Mecanismes de transferència bacteriana (2008)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Ambientales - 1º curso
Asignatura Biologia
Año del apunte 2008
Páginas 12
Fecha de subida 25/05/2014
Descargas 0

Vista previa del texto

Mecanismes de transferència bacteriana: conjugació, transformació i transducció Xavier Noguera Jordi Ortiz Miriam Pablos Pablo Pellicer CONJUGACIÓ BACTERIANA: 1. DEFINICIÓ: La conjugació bacteriana és un procés pel qual es transfereix material genètic, bé un plasmidi, bé el genoma bacterià, entre bacteris. Aquest procés implica el contacte cèl·lula a cèl·lula.
La cèl·lula que aporta el material genètic se l’anomena donadora i aquella que li manca el plasmidi, receptora.
Degut que la conjugació es va descobrir realitzant encreuaments genètics, les cèl·lules donadores s’anomenen mascles i les receptores femelles.
Els gens que controlen la conjugació estan situats en una regió determinada del plasmidi (regió tra). Molts gens de la regió tra estan relacionats amb la síntesi d’una estructura superficial, el pel sexual. Aquests pels els tenen nomes les cèl·lules donadores, i per tant, permetran l’aparellament específic entre la cèl·lula donadora i la receptora.
Perquè el procés es porti a terme el bacteri donador ha de tenir un plasmidi, el plasmidi F, que contingui la informació genètica necessària per a la conjugació.
Llavors anomenarem: - - F+ a les cèl·lules que posseeixen un plasmidi F no integrat. Son males receptores respecte al mateix plasmidi o de plasmidis relacionats.
Aquest fet es degut a que es bloqueja l’entrada del plasmidi i no a incompatibilitats en el procés de replicació, F- a les cèl·lules que no posseeixen el plasmidi F i poden actuar com a receptores de F+ Hfr (High frequency of recombination) si el plasmidi F està integrat en el seu cromosoma. En aquest últim cas la freqüència de recombinació és major. En aquest tipus de soques la conjugació condueix a la transferència del cromosoma del hoste perquè el plasmidi forma part del cromosoma.
2. DESCRIPCIÓ DEL PROCÈS: Les cèl·lules F+ i Hfr formen d'un a deu pèls sexuals, estructures de proteïnes tubulars que interaccionen, a través de la punta amb un receptor F-, formant-se així, més que parelles, agregats de conjugació, de fins a 20 cèl·lules.
El pèl es va despolimeritzant per la base, produint una aparença de retracció. Així, la cèl·lula F- es va acostant a la F+ (o Hfr).
A l'acabar la desintegració del pèl, es produeix contacte de parets cel·lulars, formant-se un pont de conjugació a través del qual contacten els citoplasmas d'ambdues cèl·lules. Les parelles o agregats s'estabilitzen per l'acció de dos gens del plasmidi i un de la cèl·lula receptora.
Una proteïna localitzada en les membranes externa i citoplásmicas i codificada per un gen del plasmidi sembla facilitar el transport de ADN.
Després d'un cert temps, l'agregat es desfà.
La transferència de l’ADN es produeix pel que els experts anomenen un procés de replicació asimètrica per cercle rodant, es a dir, en el donant actua una endonucleasa, enzim que talla una de les cadenes del ADN de la cèl·lula donant en un punt. Aquesta cadena va passant a la cèl·lula receptora i es va replicant a mesura que entra en ella, formant la cadena complementària: L'altra, no tallada, es queda en la cèl·lula donadora, servint de motlle per a la seva complementària. En el desplaçament de la cadena tallada intervé una helicasa, enzim que fa girar l'hèlix del ADN bicatenari. Els productes d'altres gens transfereixen la cadena tallada.
Una proteïna de la cèl·lula donant codificada per un gen del plasmidi manté, primer, els extrems de la cadena tallada i, ja en la cèl·lula receptora, els torna a unir.
En suma, hi ha dos processos de síntesis de ADN, el de la cadena que passa a la cèl·lula receptora i el de la cadena circular que roman en la donant.
De manera que la cèl·lula donant no perd cap gen i la receptora guanya alguns, convertint-se, en el cas que F estigui en forma de plasmidi, en possible donant. No així en el cas que F estigui en forma de episoma, integrat al cromosoma de la donant.
Transformació genètica La transformació genètica és un procés per el que el DNA lliure s’incorpora en una cèl·lula receptora la qual produeix el canvi genètic.
El descobriment de la transformació genètica en bactèries va se un dels fets més destacables en biologia, ja que va portar a experiments que van provar que el DNA és el material genètic. Aquest descobriment va arribar a ser l’inici de la biologia molecular i la genètica moderna.
S’han trobat diversos procariotes que són transformables en condicions naturals, incloent espècies de Gram positiu i Gram negatiu del domini bacterià i algunes espècies del domini Archaea. Tot i així, dins d’alguns gèneres transformables, només algunes espècies o soques són transformables. Com el DNA dels procariotes es presenta en la cèl·lula com una gran molècula única, quan la cèl·lula es troba en condicions suaus el DNA surt i s’estén. Degut a la seva gran, la molècula de DNA es trenca fàcilment; encara que s’extregui suaument es fragmenta en 100 o més troços. (DNA de B. Subtilis de 5 x 106 parells de bases -> 15.000 parells de bases).
Com el DNA que correspon a un gen promig té uns 1.000 nucleòtids, cada un dels fragments de DNA purificat té al voltant de 15 gens. Normalment la cèl·lula incorpora només un o uns quants fragments de DNA, de manera que per un únic succés de transformació només es pot transferir una petita proporció de gens d’una cèl·lula a una altra.
Competència Una cèl·lula que és capaç de prendre una molècula de DNA i ser transformada es diu que és competent. Només algunes soques són competents; aquesta capacitat sembla ser una propietat heretable de l’organisme. A la majoria de les bactèries que es poden transformar naturalment la competència està regulada i hi ha unes proteïnes especials que s’encarreguen del transport i el processament del DNA. Aquestes proteïnes específiques de competència inclouen una proteïna d’unió del DNA que està associat a la membrana (una autolisina de la paret cel·lular i varies nucleases).
Tant en Bacillus subtilis com en Streptococcus pneumoniae, la inducció de la competència depèn del medi i de la fase de creixement del cultiu. En Bacillus, prop del 20% de les cèl·lules es fan competents i es mantenen hores en aquest estat. En canvi en Streptococcus el 100% de les cèl·lules es tornen comptetents, però només durant uns quants minuts al llarg del cicle de creixement.
Incorporació del DNA Les bactèries difereixen per la forma en que incorporen el DNA.
Per exemple, en Haemophilusk, que és Gram negatiu, només penetra en les cèl·lules DNA bicatenari, tot i que els segments monocatenaris són els que s’arriben a incorporar realment en el genoma per recombinació.
Per altra banda, en microorganismes Gram positius dels domini Bactèria, com Streptococcus o Bacillus, només s’incorpora DNA monocatenari mentre que la cadena complementària resulta degradada simultàniament. Tot i així, en tots els casos, el DNA bicatenari s’uneix més eficaçment a les cèl·lules.
Durant el procés de transformació, les bactèries competents fixen primer el DNA de forma reversible, aviat però, aquesta unió passa a ser irreversible.
Les cèl·lules competents fixen molt més DNA que les no competents (fins a 1.000 vegades més). El tamany dels fragments transformants és molt més petit que els del genoma i el DNA es degrada addicionalment durant el procés d’ingestió. Cada cèl·lula Streptococcus pneumoniae només pot unir unes 10 molècules de DNA bicatenari de 15.000-20.000 parells de bases cadascuna. Tot i així, a mesura que es van incorporant, es converteixen en peces monocatenàries de unes 8.000 bases. Els diferents fragments de DNA en una mescla competeixen entre si, i si s’afegeix un excés de DNA sense el marcador genètic s’aprecia un descens en el número de transformants.
En les preparacions de DNA transformant només 1 de cada 100-200 fragments conté el marcador que està essent estudiat. Per tant, a elevades concentracions de DNA, la competència entre les molècules de DNA porta a la saturació del sistema, així doncs tot i sota les millors condicions, resulta impossible transformar totes les cèl·lules d’una població per un marcador genètic donat. La freqüència màxima de transformació obtinguda fins ara ha estat prop al 20% de la població; en realitat, els valors normalment obtinguts estan entre el 0,1 – 1 %.
La concentració mínima de DNA que produeix transformants detectables és al voltant de 1 x 10-5 g/ml i és tant baixa que resulta químicament indetectable.
Resulta interessant que en Haemophilus influenzae cal que el fragment de DNA tingui una seqüència particular de 11 parells de bases per que succeeixi la fixació irreversible i la incorporació subsegüent. En aquesta seqüència es troba amb una freqüència alta en el cromosoma de Haemophilus. Aquest tipus d’evidència, i el fet de que al menys algunes bactèries es facin competents en els seu medi natural, suggereix que la transformació no és un invent de laboratori si no que juga un paper important a la transferència genètica de la natura.
Integració del DNA transformant El DNA transformant s’uneix a la superfície cel·lular per una proteïna d’unió a DNA, llavors el fragment bicatenari complet és captat per la cèl·lula o bé una nucleasa degrada una cadena i l’altra és incorporada. Un cop incorporada, el DNA s’associa amb una proteïna específica de competència que es manté unida al DNA, possiblement per a protegir-lo d’atacs per nucleases, fins que aquest arriba al cromosoma, on és substituïda per la proteïna RecA. El DNA, llavors s’integra en el genoma del receptor per processos de recombinació.
Durant la replicació d’aquest DNA heterodúplex, es forma una molècula de DNA parental i una molècula de DNA recombinant. [...] Transfecció Definició: Les bactèries es poden transformar amb DNA extret d’un virus bacterià en lloc d’una bactèria, mitjançant un procés que es coneix com a transfecció.
Si el DNA és d’un bacteriòfag lític, la transfecció es pot mesurar amb l’assaig estàndard en placa per fags. La transfecció ha arribat a constituir un mètode útil en l’estudi d’una població casi homogènia de molècules de DNA.
En canvi, en la transformació convencional, el DNA transformant és un conjunt aleatori de DNA cromosòmic de diferent llargada, i això tendeix a complicar els experiments dissenyats per a estudiar el mecanisme de transformació.
Competència induïda artificialment La transformació natural d’alta eficàcia es troba únicament en unes quantes bactèries (p.ex: Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria i Thermus). Molts procariotes es transformes molt pobrament o quasi en absolut en condicions naturals. La determinació de com induir competència en aquestes bactèries pot representar un enorme estudi empíric, amb variacions en el medi de cultiu, temperatura i d’altres factors.
La naturalesa de la superfície cel·lular pot semblar ser important a l’hora de determinar si una cèl·lula pot prendre DNA, així com la presència o absència de nucleases intracel·lulars.
Per transferir DNA a cèl·lules en experiments d’enginyeria genètica va ser necessari trobar un mode de fer competent a Escherichia coli, un organisme Gram negatiu. S’ha trobat que en quant E.coli es tracta a lates concentracions d’ions de calci i llavors es manté en fred, es converteix en transformable amb baixa eficiència. Amb procediments adequats és possible seleccionar transformants d’E.coli per a gens cromosòmics, tot i que amb baixa freqüència. Les cèl·lules d’E.coli tractades d’aquesta manera incorporen DNA bicaternari i, per tant la transformació per DNA plasmítidic resulta més eficaç per que no cal recombinació.
No se sap per què el tractament amb calci funciona d’aquesta manera, però el procediment també funciona amb d’altres bactèries Gram negaties. Tot i així, aquests mètodes per a induïr artificialment la competència estan essent ràpidament substituïts per un nou mètode anomenat electroporació.
Desenvolupament de la competència i unió del DNA transformant.
Processant i presa del DNA d’orígen extern.
Proteïnes específiques s’uneixien i protegeixen el DNA exògen monocatenari.
El DNA exògen s’integra al cromosoma bacterià en regions homòlogues mitjançant la proteïna RecA.
TRANSDUCCIÓ Definició: La transducció és un procés de transferència de l’ ADN de l’hoste entre cèl·lules, i a través d’un virus. A més, és un procés en el qual no tots els fags el poden dur a terme i no totes les bactèries poden ser transduïdes, tot i això, és un fenomen molt estès i això fa que tingui especial rellevància en la transferència genètica de la natura. La transferència es pot dur a terme de dues maneres: La primera, la transducció generalitzada, en la qual l’ADN de la bactèria hoste (procedent de qualsevol part del genoma) passa a formar part de l’ADN de la partícula madura del virus en comptes del seu genoma.
En aquest tipus de transducció, és necessari que els gens del donador han de passar una recombinació homòloga amb el cromosoma de la bactèria receptora, perquè sinó es perdran. Alhora, no es poden replicar independentment.
El segon tipus de transducció, la transducció especialitzada, consisteix en la integració directa d’una regió específica del cromosoma bacterià en el genoma del virus, tot reemplaçant alguns dels gens d’aquest. Aquest tipus de transducció, només té lloc en determinats tipus de virus temperats.
A la transducció especialitzada també pot tenir lloc una recombinació homòloga, tot i que degut a que el ADN de la bactèria donadora, un cop realitzada la transducció, passa a formar part d’un virus temperat, el ADN pot passar a ser part del cromosoma de l’hoste en el procés de lisogenització, o el ADN es pot replicar com a part de la infecció lítica.
Tot i ser diferents tipus de transducció, tant la generalitzada com la especialitzada, comparteixen la característica de que la partícula viral és defectiva, degut a que hi ha agut alguns gens del virus reemplaçats per gens de la bactèria hoste.
2. DESCRIPCIÓ DEL PROCÈS: Pel que fa al procés de transducció es podran parlar de 2 tipus diferents: Transducció generalitzada Es pot transferir qualsevol marcador genètic des del donador fins al receptor.
Es va descobrir i es va estudiar inicialment a la bacteria Salmonella typhimurium i ha sigut també estudiada a l'Escherichia coli.
Llavors,quan una bactèria s'infecta amb un fag es pot iniciar el cicle lític.
Durant la infecció en aquest cicle,els enzims que fan possible empaquetar l'ADN víric al bacteriòfag a vegades introdueixen el ADN el hoste de forma errònia.
Així aquesta partícula resultant serà una partícula transductora.
A partir d'aquí, s’alliberarà aquestes partícules juntament amb els virions per lisi(o trencament) de la cèl·lula,de forma que el trencament conté virions normals i aquestes partícules transductores, però no podran iniciar la infecció normal perquè no contenen ADN víric. Llavors rebran el nom de defectives.
Quan s'utilitza per infectar a cèl·lules receptores:Són infectades per un virus normal.
En canvi,una petita part de cèl·lules són infectades per partícules transductores,que injecten ADN que van rebre de la cèl·lula hoste. Així aquest ADN podrà fer una recombinació genètica amb l'ADN de la nova cèl·lula hoste.
Els fags que formen les partícules transductores poden ser:atemperats o virulents i el que faran serà: -Empaqueten l'ADN de forma que no reconeix l'ADN de l'hoste.
Aquest tipus de tranducció serà més possible quan una cèl·lula sigui infectada per tan sols un fag,perquè si hi han múltiples infeccions les cèl·lules podran resultar mortes per les partícules normals.
Transducció especialitzada A diferencia de la generalitzada, l'especialitzada permet una transferència molt eficaç y també fa possible que una petita regió del cromosoma bacterià es repliqui independentment de la resta.
El exemple més clar per explicar aquesta transducció va ser el primer que es va descobrir: transducció dels gens de la galactosa per el fag lambda de l'Escherichia coli.
Quan una cèl·lula està lisogenitzada per lambda,el genoma del fag es posa a l'ADN de l'hoste de forma específica. Així la regió on es troben els gens de la galactosa, estarà aïllada de la resta de gens de l'hoste. Llavors s'aconseguirà que l'ADN víric quedi controlat per l'hoste.
Per inducció(rajos UV.),l'ADN víric es separa de l'ADN de l'hoste. Així l'ADN de lambda queda com una unitat.
Però en situacions rares,la regió de galactosa es junta amb l'ADN del fag,i un tros d'ADN del fag es quedarà allà.
Així es formarà el que es diu lambda dgal (defectiva a causa de l'ADN del fag perdut i no formarà fag madurs). Però apareixerà un fag auxiliar(idèntic a lambda inicial),que farà les funcions que no pot fer les partícules defectives. Per últim quan es produeixi la lisi hi hauran partícules lambda dgal (fags defectius ) que transduiran el gens de la galactosa i virions normals .
Així,la gran diferència entre aquesta transducció i l'altre,es que l'altre no fa falta que passi per inducció de un lisògen,sinó que pot passar per infecció d'un bacteri,(no lisogènic),amb replicació del fag i lisi de la cèl·lula.
Bibliografia: Brock - Biologia de los microorganismos (10ª ed.) http://fai.unne.edu.ar/biologia/animaciones/temas/bacterias/conjugacion2.swf ...