Biologia Molecular Tema 1 (Part 1) (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 11
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 7

Vista previa del texto

1 TEMA 1 –L’ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL DNA.
1.1 INTRODUCCIÓ HISTÒRICA: LA BIOLOGIA MOLECULAR EN EL PERÍODE CLÀSSIC I EN L’ACTUALITAT.
Introducció històrica basada en un llibre publicat per un genetista anomenat G. Stent: “The coming of the golden age” (1969), i també en l’obra “Century of DNA” (1977). Ambdós tracten sobre els períodes històrics de la biologia molecular, que es descriuran a continuació: PERÍODE CLÀSSIC –s’inicia el 1866 amb els treballs de Mendel i la instauració de les lleis de l’herència biològica.
Mendel, respecte aquesta qüestió, era molt hipotètic: els gens no eren res concret ni físic. 1860 Miescher, químic, va identificar i aïllar una substància anomenada nucleïna en mostres de pus, i és l’equivalent al que actualment anomenem DNA. El 1884, Kossel va descobrir les histones en experiments realitzats amb eritròcits d’oca (els eritròcits d’au tenen nucli!). Les histones són proteïnes que poden ser separades del DNA amb àcid clorhídric diluït, doncs tenen caràcter bàsic (abundància de Lys i Arg). Unida al DNA és una proteïna insoluble, però un cop separada d’aquest és soluble. En presència d’una alta concentració salina (NaCl 2M) es provocava la dissociació de les histones del DNA. Això ens demostra que aquests dos elements estan units per interaccions iòniques (DNA càrrega – i histones càrrega +). El mateix autor el 1910 va rebre el Nobel per aquest estudi.
Abans de l’any 1900 es feien servir colorants bàsics amb els quals es podien tenyir els nuclis: per això van anomenar el material que es tenyia cromatina. El 1882 Walter Fleming (no el de la penicil·lina!) va descobrir el fenomen de la mitosi. En concret va obserbar la cromatina codensada en forma de cromosomes metafàsics.
Entre els anys 1910 i 1930 els químics van identificar la estructura química del DNA (bases nitrogenades i nucleòtids). Se’ls va acudir la idea que el material genètic estava estructruat en forma de tetranucleòtids. Fins i tot després de la pronunciació de les lleis de Chargaff (proporció Pu=proporció Py) creien en aquesta estructura lligada per enllaços fosfodiéster.
L’any 1943 es va agafar la nucleïna i va fer-ne estudis de viscositat a diferents dissolucions. Van veure que per justificar la seva viscositat el DNA havia de ser un polímer de molt alt pes molecular. Allò va causar controvèrsia perquè els polímers, fins aleshores, no tenien a veure amb els nucleòtids. En aquella època es començava a treballar amb plàstic (polímers sintètics).
PERÍODE ROMÀNTIC –l’any 1940 s’entra en un període romàntic, idealista. En particular, Schrödinger va tenir molta influència intel·lectual, doncs va deixar els seus estudis sobre química quàntica i va centrar-se en els estudis de la vida. Un científic anomenat Delbruck va ser molt influenciat, i va intentar explicar els sistemes vius des d’un punt de vista molt físic i fonamental. Un col·lectiu format per Delbruck et al va ser anomenat “El col·lectiu del fag” o “The phage group” i es van dedicar a fer estudis en aquest tipus de virus i els seus mecanismes d’infecció de bacteris.
PERÍODE DOGMÀTIC –el 1944 va iniciar-se el període dogmàtic gràcies als treballs que va fer Avery et al (microbiòlegs) treballant amb pneumococs. Amb el seu experiment va identificar que allò que contenia el gen o unitat hereditària, era el DNA (àcid nucleic), que va anomenar “principi transformant”. El 1953 Watson i Crick van proposar la hipòtesi de l’estructura del DNA com una cadena de doble hèlix. El 1960 Arthur Kornberg descobreix que el DNA es pot replicar, i que ho fa gràcies a l’enzim DNA polimerasa.
PERÍODE DE CONSOLIDACIÓ (60-70) –l’any 61 Jacob i Nmod van formular la hipòtesi de regulació mitjançant el mecanisme de l’operó mitjançant experiments amb RNA missatger. El 63 Khorana va sintetitzar químicament RNA al laboratori. Gràcies a això, grups com els de Nirenberg i Severo Ochoa van establir el codi genètic (per a quins aminoàcids codificaven els triplets de RNAm). Entre el 60 i el 63 es va construïr el dogma central de la biologia: a partir d’àcids nucleics podem produïr proteïnes, començant pel DNA, passant per l’RNA i acabant en aqueste proteïnes. La hipòtesi la va fer Crick.
PERÍODE D’OR O ACADÈMIC –a partir dels anys 70 s’iniciava aquest període, en el qual es preveia que els grans descobriments ja estaven fets i només calia gaudir del que s’havia obtingut fins aleshores. Tanmateix no va ser així: el 1970 el coneixement dels enzims de restricció era prou gran com perquè tres anys més tard, el 1973 s’aconseguís la clonació a nivell molecular del DNA. Amb aquest experiment revolucionari es va iniciar l’enginyeria genètica. Va causar tal sobresalt que van decidir no avançar fins que no s’haguessin establit uns protocols ètics de seguretat prou sòlids (conferència d’Asilmar, 1975). El 1974 es va descobrir el nucleosoma, la subunitat fonamental del DNA.
El 1977 dos laboratoris troben la forma de seqüenciar DNA: Sanger per l’anomenat mètode bioquímic o enzimàtic i Maxam&Gilbert per el mètode químic. El mètode més eficient i que s’ha utilitzat fins els nostres dies és el de Sanger. Simultàniament es va començar a fer la síntesi automatitzada d’oligonucleòtids.
El 1983 Kary Mullis descobreix la manera de fer síntesi de DNA amb un mètode que combinava la bioquímica dels enzims amb la química: fent servir polimerasa i un protocol molt elaborat es va idear la PCR o Polymerase Chain Reaction. Darrere de la PCR hi ha una patent, que va moure moltes empreses i molts diners. (Arthur Kornberg va escriure el llibre “The golden helix” en el qual explica tota aquesta revolució). Es pot dir que aquí s’inicia la biotecnologia. L’any 2001 es fa la primera seqüenciació del genoma humà, per part d’una iniciativa privada i una de pública alhora. La seqüència va ser publicada i Klinton (president del EUA) va anunciar-ho públicament: la biologia molecular havia arribat als medis de comunicació i començava a guanyar molt de pes.
A partir d’aquest moment van iniciar-se els estudis a gran escala: la genòmica (anàlisi de la seqüència d’ADN de molts organismes) i la proteòmica (el mateix però en proteïnes). Les tècniques abans tradicionals van robotitzar-se i es van fer kits de reactius perquè qualsevol laboratori pogués treballar. Les aplicacions van arribar fins als transgènics i la teràpia gènica, i el diagnòstic a través de la seqüència del DNA va despertar molt d’interès en el món clínic, forense i militar. També va arribar al món dels fàrmacs i teràpies basades en estratègies de clonació del DNA.
Enmig de tot això, es van oblidar de utilitzar tots aquests recursos per al bé comú i no pas individual: era necessària la bioètica. Calia que experts en aquest tema, biòlegs moleculars i no pas jutges i advocats,decidissin què es podia i què no es podia fer.
Actualment estem en una ETAPA “POP” de la biologia molecular: pràcticament qualsevol laboratori pot tenir acccés als materials i recursos necessaris per a investigar (o produïr) en base aquesta disciplina. Etapa descriptiva, no es busquen nous principis sinó com aplicar aquells que ja tenim. A més, al llarg de l’història hem acumulat moltíssima quantitat de dades, que han donat treball als bioinformàtics que s’encarreguen d’ordenar-les i validar-les. En quant a la tecnologia, podem dir que estem en una etapa de consolidació d’aquesta.
A principis del segle XX, els químics tenien curiositat per saber de què estava feta la “nucleïna”. Als anys 20 es va aconseguir caracteritzar l’estructura dels nucleòtids: Consisteixen en un sucre de 5 C (pentosa) que pot tenir o no un grup hidroxil a l’extrem 2’. En funció d’això tindrem una ribosa (RNA) o una desoxiribosa (DNA). Notem que la ribosa porta els carbonis numerats amb una prima (‘). Al sucre hi ha acoblada una base nitrogenada, i en funció del nombre d’anells que tingui la seva estructura serà una base púrica (Pu) o bé pirimidínica (Py).
Els nucleòtids tenen polaritat (anisotropia): parlem dels extrems 3’ i 5’. El primer carboni de la ribosa que ens trobem és el 5’: el que trobem just en el sentit contrari és el carboni 3’.
El 1944 Avery va fer l’experiment clau, que va materialitzar allò que Mendel entenia com a concepte que eren els gens. El seu laboratori era de microbiòlegs i treballaven amb pneumococs. D’aquests en tenien dues soques: la letal i la no letal, constituïda per pneumococs mutants. Els letals (o encapsidats) si s’inoculen en ratolins provoquen la mort d’aquests, si no ho són no els maten. Si sotmetem als letals a temperatura alta perden la propietat de ser letals. Si llavors agafem aquesta soca i la posem amb pneumococs no letals, aquests últims adquireixen la letalitat, i si són inoculats en ratolins aquests moren. Els pneumococs letals han “transformat” els no letals, els ha donat quelcom que els ha donat aquesta letalitat. Avery volia saber què erea aquet principi transformant. Per fer-ho, va fer un fraccionament cel·lular amb els pneumococs letals i van separar la mostra de cèl·lules en tres fases: la superior, que contenia els lípids, la del mig, que contenia proteïnes, i la de baix, que contenia àcids nucleics. Posteriorment, va posar en contacte cadascuna de les tres fases per separat amb la soca de pneumococs no letal, i va veure que la transformació es produïa sols si ho feia amb la fracció d’àcids nucleics. Amb això pretenien demostrar que els àcids nucleics portaven l’herència biològica. Tanmateix, la mentalitat de l’època (el tetranucleòtid) els retreia que els seus resultats no eren lògics, que segurament la mostra d’àcids portava proteïnes i que aquestes eren les que transmetien el material genètic (combinant 20 aminoàcids es podia tenir més informació que no pas combinant 4 nucleòtids). Avery va repetir l’experiment, aquest cop afegint proteases als àcids nucleics, i tot i així el principi transformant es transmetia igualment. Però ni així el van creure. Després hi va afegir RNAasa, però el principi transformant continuava igual. Finalment van posar DNAasa i aleshores la letalitat no es transmetia.
Amb aquest experiment podria quedar demostrat que allò que contenia la informació genètica era el DNA, però no va ser fins el 1951 quan dos membres del club del fag van fer un altre experiment (“l’experiment del turmix”) que van aconseguir convèncer la comunitat científica. Van marcar proteïnes víriques de fag amb S-35 i el seu DNA amb P-32, i van inocular aquest fag a un cultiu de bacteris. Al cap d’un temps van procedir a agitarho tot molt intensament amb una batedora de cuina, de manera que tot fag s’hauria de desprendre del bacteri, i seguidament es va procedir a una centrifugació. En el sobrenedant va quedar-hi fragments de fags, i els bacteris quedaven en el sediment. Els fags contenien només S-35; només proteïna! En canvi els bacteris tenien el P-32 amb el qual havien marcat el DNA víric: els virus havien passat el seu “principi transformant” als bacteris, i ho havien fet en forma de DNA. Per corroborar-ho, es van posar els bacteris en cultiu i aquests van continuar el procés d’infecció vírica i acabaven llisats. L’experiment va ser decisiu: la informació genètica es transmetia en forma de DNA.
L’experiment del turmix (Heinsheg i Chase) tenia una contaminació proteica de l’1%. En canvi la de l’experiment d’Avery era del 0,02%; això indica que era el consensus de la comunitat científica el què fallava i no pas la qualitat o veracitat de l’experiment d’Avery.
El químic Chargaff, va fer experiments des de l’any 1648 fins el 52. Es dedicava aïllar DNA de diferents espècies: quan el tenia, el sotmetia a àcid per hidrolitzar-lo. Allò que quedava éren ni més ni menys que els nucleòtids que formaven aquest DNA separats. Llavors agafava paper de filtre i feia una cromatografia sobre paper amb aquesta dissolució. Quan tenia el paper impregnat, posava el paper en contacte amb dissolvent orgànic i llavors apareixien unes taques que migraven en funció de la seva solubilitat en aquest. Al final del procediment hi havia 4 taques, cadascuna d’elles corresponent a una base nitrogenada. Chargaff retallava cada taca del paper i les sotmetia a procediment perquè es desprenguessin de la cel·lulosa. Després posava aquestes mostres líquides de cada taca en una cubeta i les analitzava a l’espectofotòmetre. Amb la mesura de les absorbàncies era capaç de determinar la quantitat de nucleòtid que hi havia en cada taca.
Aquest experiment va poder mesurar la proporció d’ATGC de l’ADN de moltes espècies. Els resultats (composicio de bases en % mols) en l’espècie humana i E.coli van ser: Humà: A=30,9 G=19,9 C=11,8 T=29,4 ; E. Coli: A=24,7 G=26 C=25,7 T=23,6 Si calculava la ratio A/T i G/C era 1,05 i 1 en humans i 1,04 i 1,01 en ecoli.
Amb aquests resultats la conclusió va ser que fos de l’espècie que fos el DNA, sempre es complia que A=T i G=C. No sabia per què, però aquesta conclusió va ser molt contundent i molt important en l’època.
1.2 ESTRUCTURA DEL DNA B: EL MODEL DE WATSON I CRICK.
Quins elements tenien W i C per proposar la hipòtesi (o model) de l’estructura de la doble hèlix el 1953? 1 LLEIS DE BRAGG. El 1912 pare i fill Bragg van desenvolupar la cristal·lografia de raigs X i la interpretació dels seus difractogrames. Quan els raigs X incideixen en un punt material, aquests són dispersats en totes direccions. Si la matèria que estudies té una estructura repetida, el conjunt de raigs que hi incideixen i es dispersen ho fan de manera que els seus màxims d’ona es sumen perquè estan en fase. Això fa que dóni una gran intensitat en una direcció, que anomenem privilegiada. En el difractograma observem aquestes direccions en forma de taques fosques.
Bragg va determinar que els màxims tenen uns angles determinats: hi haurà interferència constructiva quan es compleixi l’equació de Bragg. D’aquesta equació sabem n, que és un nombre natural, landa, que és un paràmetre fix, d, que és la distància entre els àtoms, l’únic que no sabem és el sin θ. A la placa fotogràfica, com més gran siguin els angles de desviació (és a dir com més gran sigui θ) més petita serà la distància entre les estructures que es repeteixen.
2 DIFRACTOGRAMA DE LA MOLÈCULA DE DNA. Rosalind Franklin & Wilkinson van preparar DNA molt pur i en van analitzar l’estructura amb la tècnica de difracció de raigs X. El primer que observem en el difractograma és que té forma de cercles concèntrics, cosa que es dóna quan a l’estructura hi ha repeticions determinades però el material no està ordenat del tot.
Com va preparar Franklin el DNA per a la difracció de raigs X? Es va centrifugar una mostra de DNA amb detergent i se’n van aïllar els nuclis, que són cromatina essencialment. Per separar el DNA de les proteïnes nuclears es va posar en solució NaCl 2M i detergent SDS (perquè té càrrega – i s’uneix amb les proteïnes bàsiques del DNA). A més hi afegim proteïnasa K, perquè destrueixi les proteïnes que puguin quedar disperses ja que és un enzim que actua en concentracions elevades de detergent sense desnaturalitzar-se. Després s’afegeix un dissolvent orgànic (fenol, cloroform) i una mica d’aigua i es centrifuga. Quedaran dues fases: una fase superior amb el dissolvent orgànic, i una d’inferior d’aquosa, amb el DNA.
A l’interfase hi trobarem les proteïnes ja que són amfipàtiques. Xuclem amb una pipeta la fase inferior i la transferim a un tub net. Repetim el procés dues vegades més per assegurar-nos que no queda proteïna.
A la fase aquosa amb el DNA el més pur possible hi posem etanol i barregem amb vareta de vidre. L’etanol provocarà la precipitació del DNA, de manera que quedarà en forma de pasta filamentosa translúcida enganxada a la vareta de vidre. Agafem aquest DNA amb unes pinces, i les obrim de manera que ens quedi el DNA “estirat”. Això ens permetrà orientar la majoria de les fibres de DNA en una mateixa direcció. Amb això ja tenim la mostra a punt de ser sotmesa a difracció de raigs X! En el difractograma veiem que hi ha dues grans taques a dalt i a baix, de color fosc. Aquestes taques tenen un angle de Bragg gran: per tant l’estructura que es repeteix ha de tenir una distància molt petita en la molècula. Correspon a la successió de bases nitrogenades de la cadena. A més la mesura de la distància a partir del difractograma ho va confirmar doncs donava una distància de 3,4A.
Una altra forma destacada són les taques en X. Es va calcular la distància entre taques, i es va veure que corresponia a una distància de 34A. Això volia dir que l’estructura de parells de bases es repetia 10 vegades per cada volta d’hèlix.
(10*3,4A=34A).
En la interpretació del difractograma va ser molt important la contribució de Linus Pauling, premi Nobel de la Química i de la Pau, per haver obtingut el difractograma d’una hèlix alfa proteica.
3 MODELS MOLECULARS: W i C van fer un model amb barres i cargols del DNA. Tots els seus components estan dimensionats de veritat per els químics de la època.
4 PROPIETATS QUÍMIQUES DE LES BASES. Els químics havien estudiat les propietats tautomèriques de les bases.
L’adenina, per exemple, presenta forma amino i imino, i d’aquesta última forma, a més, podia tenir isòmers.
Guanina i timina poden presentar tautomeria cetoenòlica. Les formes més estables són l’amino i la ceto, la qual cosa està demostrada perquè si estiguessin de l’altra forma tautomèrica els ponts d’hidrogen no podrien formar-se correctament i contradirien les lleis de Chargaff.
Se sap que entre G i C hi ha 3 ponts i entre A i T 2. També se sap que els aparellaments són Pu-Py perquè així es compensa el volum d’una base gran (Pu) amb una de petita (Py).
5 LLEIS DE CHARGAFF 6 PER QUÈ UNA HÈLIX? Entremig de les bases contígues hi ha un forat. Una manera de resoldre’l és agafar la doble cadena per dalt i per baix i estirar-la de biaix. Però això no és viable per a la molècula de DNA, per tant haurem de recórrer a una torsió (twist) perquè la molècula pugui conservar la linealitat.
1.2.1 estructura del DNA B en dissolució aquosa.
1 Es forma una hèlix perquè si posem les dues cadenes, tot respectant les proporcions de Chargaff i les distàncies d’enllaç entre els àtoms queda un buit. Una de les possibles solucions per eliminar aquest buit és fixar una part de l’estructura de dalt i enroscar per baix. Així es preserva la longitud d’enllaç ésterfosfòric i aconseguim que dues parelles de bases contígues estiguin en contacte i no hi hagi cap buit. La conseqüència de tot plegat són dues hèlixs enrotllades sobre el mateix eix.
2 Amb aquest model del DNA, es va concebre que perquè les dues hèlixs estiguessin aparellades i no hi haguessin impediments estèrics aquestes havien de ser antiparal·leles.
Exercici: localitzar els extrems 5’ i 3’ de la molècula i identificar els àtoms.
3 És difícil definir el diàmetre del DNA, però si agafem un cilindre que envolti imaginàriament la doble hèlix ens dóna un diàmetre de 2nm. En realitat, però, aquest diàmetre és més petit perquè té “entrades”. Del C1’ d’una ribosa a l’altre hi ha la distància d’1nm. Si sumem el que ocupen els fosfats, arribem a sumar en total 2nm.
4 Els fosfats estan cap a fora, indicats de color blanc, a la perifèria de la molècula. Això és perquè els fosfats tenen càrrega negativa i per tant són hidrofílics.
5 Les parelles de bases estan apilades a la zona interna. Són hidrofòbiques i volen estar molt en contacte entre elles per no permetre l’accés a l’aigua. Les bases soles sense la ribosa segurament no es dissoldrien en aigua.
6 Les parelles de bases són gairebé perpendiculars a l’eix de la doble hèlix.
7 Les parelles de bases estan separades entre elles 0,34nm. Ho sabem pel difractograma, és l’estructura que es veu més (taques negres grans).
8 El nombre de parells de bases per volta de doble hèlix és d’aproximadament 10nm. Això és perquè una volta completa són 3,4nm. Això en termes estructurals és el que anomenem pas de rosca o “pitch”. En un cargol de mecànic és la distància que has de pujar un cargol perquè faci una volta completa.
9 Angle de twist o “angle d’enroscament”. Són els graus que gira l’hèlix per cada parell de bases. Si una volta completa són 360º, com que hi ha 10 pb per volta l’angle de twist és de 36º/pb.
10 La doble hèlix de DNA B té un avanç cap a la dreta (“right helix”). El DNA té propietats quirals. Tant si la mires per dalt com per baix és dextrògira.
11 El solc gran i el solc petit (major i minor groove) són espais amples que s’intercalen amb espais petits. Els espais amples fan una “depressió”, que és el solc gran, i a darrere d’un solc gran sempre hi ha un solc petit i a l’inrevés. Els solcs són importants perquè les proteïnes que interaccionen amb el DNA en el procés de reconeixement. El solc petit és generat perquè tenen els dos C1’ de la ribosa d’una parella de bases encarats. La cara del revés genera el solc gran. Aquesta forma la genera la forma assimètrica d’unir-se covalentment les bases amb les riboses.
La doble hèlix del DNA és un model estructural, una hipòtesi. A partir dels anys 80, però, es van fer anàlisis directes que van permetre determinar que realiment el DNA s’estructurava en una doble hèlix.
Als anys 90, s’havien desenvolupat tècniques de microscòpia STM i AFM. Amb aquestes es van poder fer els estudis que inferien directament l’estructura del DNA.
STM o microscopi d’efecte túnel. Consisteix en un sensor que ressegueix l’estructura de la mostra sense tocar-la. Mesura la conductivitat elèctrica de la mostra, i en funció de la diferència de conductivitat de les diferents regions d’aquesta ens crea una imatge.
Les zones més o menys brillants que veiem a la imatge corresponen a zones més o menys protuberants respectivament: són el major groove i el minor groove del DNA B.
AFM o microscopi de força atòmica. La mostra és palpada per una punta molt fina que en ressegueix el relleu.
Al revés de la punta hi ha un mirallet, al qual hi apunta un làser. Segons si la mostra té protuberàncies o forats, el mirallet es desplaçarà més cap a dins o més cap a fora. Aquest canvi d’orientació del mirallet farà que l’angle de reflexió del làser canvï. Aquest canvi d’angle serà medit molt lluny respecte el punt on es generi per un detector. Gràcies a això podem obtenir una imatge de la topologia de la mostra.
1.3 DESNATURALITZACIÓ I RENATURALITZACIÓ DEL DNA: EFECTE DE LA TEMPERATURA I DEL PH.
ESTABILITZACIÓ DELS PARELLS DE BASES.
René Thomas el 1951 va fer uns experiments de la seva tesi doctoral. Ell tenia dades sobre l’absorbància d’un mol d’A,T,G,C a les longituds d’ona UV-visible, i en analitzar el mateix paràmetre en molècules de DNA veia que els resultats experimentals no s’adeien amb els resultats esperats. Ell sabia la composició de bases del DNA que analitzava, i el què ell esperava trobar era un espectre d’absorbància que seria la suma dels espectres de cada base. Però no va ser així, doncs li va sortir una absorbància un 30% més alta del què esperava. Va hidrolitzar el DNA amb HCl concentrat a alta temperatura. Amb això va hidrolitzar el DNA, sense malmetre les bases. Això va portar a que el DNA mostrés una absorbància tal i com ell havia previst: si el DNA deixa de tenir la continuïtat covalent dels enllaços fosfodiéster es comporta amb una absorbància diferent. Cal fer notar que en aquella època encara no s’havia publicat la hipòtesi de la doble hèlix.
Després de fer aquest experiment, va agafar la solució de DNA original i li va augmentar la temperatura. Va veure que era un 30-40% més alt que el que va obtenir en un principi. També va baixar-ne una mica el pH però sense provocar la hidròlisi.
Ni ha temperatura ni el pH podien trencar la covalència de l’enllaç éster-fosfòric. Això li va portar a pensar que el DNA tenia una conformació sensible a aquests dos factors. En el DNA hi havia d’haver interaccions secundàries no covalents que mantenien la seva estructura. Amb aquell experiment es va descobrir que el DNA tenia estructura secundària, en el benentès que l’estructura primària és la covalent.
L’explicació a tot això és que en augmentar la temperatura, el que fem és passar de doble cadena a cadena simple. Aleshores les bases queden més exposades al medi i això augmenta la seva absorbància. En hidrolitzar (alta concentració d’àcid) el que fem és que les bases quedin exposades, perquè el DNA queda en trossets lliures i això permet l’exposició de les bases.
Corba de fusió –si posem una mostra de DNA a l’espectofotòmetre i en mesurem l’absorbància a 260nm, tot això augmentant la temperatura progressivament, podem apreciar que el conjunt de resultats dónen una gràfica corba. És el que anomenem corba de fusió del DNA. A temperatura baixa, hi ha molt poca absorbància.
A partir d’una temperatura determinada, la temperatura augmenta fins assolir un màxim. Quan arribem al 50% d’increment d’absorbància, el valor de T que tinguem per aquesta Abs l’anomenem Tm o “melting temperature” (temperatura de fusió). És un valor característic de cada DNA. A la pràctica, per calcular aquest paràmetre fem aquesta corba i després en calculem la derivada. Per a cada punt, trobem el valor de ∆Abs360/∆T. Just al punt del 50% tenim un canvi de pendent (la derivada passa de positiva a negativa), és a dir, un màxim; aquest punt és la Tm.
S’ha trobat la Tm de moltes espècies, i s’ha trobat que el percentatge de C-G respecte la Tm segueix un comportament lineal positiu: com més alt és el percentatge de C-G més alta és la Tm.
La Tm també depèn de les condicions iòniques, de manera que si representem l’absorbància del DNA a 260nm en funció de la Tm en diferents concentracions salines tenim diferents corbes. Com més molaritat tingui la dissolució salina (és a dir com més concentrada sigui) més augmentarà la Tm. En augmentar la concentració de cations, més apantallats estan els fosfats. La molècula es torna més estable perquè no hi ha tanta repulsió entre càrregues negatives de les cadenes complementàries. Això es manifesta amb un augment de la Tm. Si el medi no té gens de cations, això és perillós per al DNA. Es pot tornar tan inestable que podrien arribar a dissociar-se les dues cadenes, si el DNA és prou curt.
Disposem de fórmules que ens dónen aproximadament la Tm de qualsevol DNA, i es té en compte empíricament el contingut de GC i la concentració de sodi.
𝑇𝑚 = 41,1𝑋𝐺𝐶 + 16,6 log[𝑁𝑎] + 81 On 𝑋𝐺𝐶 és la fracció molar de GC. És una fórmula aplicable a molècules de DNA grans, no oligos.
Per què el pH afecta a l’estabilitat del DNA? Perquè si baixem el pH, els nucleòtids d’adenina, guanina i citosina pateixen una protonació, guanyen una càrrega positiva. Si apareixen càrregues en cadenes antiparal·leles això provoca repulsió electrostàtica, la qual cosa indueix la separació de les dues cadenes. En augmentar el pH podem fer exactament l’oposat: perdre protons i generar repulsió per proximitat de càrregues negatives. Les bases són insolubles en solució aquosa a pH neutre, però a pH àcid o bàsic són solubles.
Quan dissocio les cadenes, desapareixen els ponts d’H? No, els ponts ara es fan entre les bases desaparellades i l’aigua de l’entorn. El que estabilitza el DNA de doble hèlix són els ponts d’hidrogen entre les bases complementàries i l’apilament d’aquestes per interacció hidrofòbica.
És possible passar de DNA monocatenari a DNA bicatenari? En altres paraules, és possible renaturalitzar el DNA? Tenim una mostra de DNA desnaturalitzat perquè li hem apujat la temperatura. Quan el refredem, el DNA es pot tornar a renaturalitzar. En l’experiment de la gràfica superior, veiem que tenim una corba de fusió corresponent a la desnaturalització (a) i una recta corresponent a la renaturalització del mateix DNA (b).
L’experiment està fet amb DNA de vedella, un organisme complex, i només es va aconseguir una renaturalització parcial. Per demostrar que es pot renaturalitzar completament, es va fer un altre experiment: en lloc de treballar amb DNA de mamífer es va treballar amb el DNA del virus bacteriòfag M13. És un DNA de 7000 pbs aproximadament. Es va fer una electroforesi en gel d’agarosa. El DNA monocatenari del fag migra poc (posició més alta) i el bicatenari migra més ràpid (posició més baixa). Es va fer una dissolució del DNA a 100ºC al bany maria, perquè les cadenes es separessin. Nota: En el bany maria, l’aigua del bany bull però no la de la mostra, perquè aquesta té sals i això augmenta el punt d’ebullició. Si bullís, es farien bombolles i exercirien massa tensió superficial sobre el DNA. S’agafava una alíquota d’aquesta mostra de DNA cada un cert temps: des de 0,25 fins a 180 minuts. Es posava en un eppendorf en un bany de gel perquès es parés la desnaturalització. Finalment es carreguen les butxaques per fer una electroforesi amb cadascuna de les alíquotes. Veiem que les alíquotes de DNA extretes a temps curts les bandes estan a la part superior del gel, i a mesura que passa el temps van baixant. Les bandes centrals corresponen al DNA mig renaturalitzat. Són formes intermèdies que s’hauran de desfer per acabar obtenint el producte final, que és el DNA 100% renaturalitzat perfectament. Per tant, podem concloure que el DNA es pot renaturalitzar i a més això és un procés espontani: les bases es troben per agitació tèrmica i no en falla cap ni una. Això és una base tècnica imprescindible per a l’enginyeria genètica.
...