Tema 7. Modificación in virtro de ácidos nucleicos (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 13
Fecha de subida 13/06/2017
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FRACCIONAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 1.1 MÉTODOS EN SOLUCIÓN En la célula los ácidos nucleicos se asocian a proteínas. Después de la ruptura celular, se desproteínan los ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos se pueden desproteinar: A. Agitando el complejo proteína-ácido nucleico con una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico. Nos quedamos con una fase orgánica hidrofóbica, con una fase acuosa con ácidos nucleicos y con proteínas. Se extraen las proteínas mediante centrifugación.
B. Con agentes desnaturalizantes como detergentes o sales en alta concentración.
C. Mediante la degradación enzimática con proteasas.
Los ácidos nucleicos se pueden aislar con precipitación con etanol: 1.
2.
3.
El RNA puede recuperarse del precipitado por tratamiento con DNasa pancreática que permite eliminar el DNA.
El DNA puede obtenerse libre de RNA mediante tratamiento con RNasa.
El RNA y DNA pueden separarse alternativamente por ultracentrifugación.
Para proteger los ácidos nucleicos usamos EDTA, que atrapa iones de metales necesarios para la actividad de las nucleasas.
NOTA: los ácidos nucleicos son más fáciles de manipular que las proteínas, porque no tienen estructura terciaria compleja.
1.2 CROMATOGRAFÍA Los ácidos nucleicos de mayor tamaño suelen separarse por procedimientos como cromatografía de intercambio iónico y filtración por geles.
A. La hidroxiapatita puede usarse para aislar y fraccionar DNA. El DNA de doble cadena se une a la hidroxiapatita con mayor fuerza que otras moléculas. Después de una columna de hidroxiapatita lavamos con un buffer de fosfato con concentración lo suficientemente baja como para eliminar solo RNA y proteínas. El ssDNA eluye de la hidroxiapatita a una concentración de fosfatos menor que el dsDNA.
B. El mRNA puede aislarse por una cromatografía de RNA. Sirve para aislar mRNA específicos, por ejemplo muchos con cola poliA en el extremo 3’, por lo que pueden aislarse covalentemente usando las colas poliU complementarias en presencia de alta concentración salina y bajas temperaturas.
Si conocemos la secuencia parcial, podemos sintetizar la cadena complementaria de DNA.
1.3 ELECTROFORESIS Para DNA pequeños usamos poliacrilamida. Pero para DNA con más de unos pocos miles de pares de bases usamos geles con bajo contenido en agarosa, que permiten el fraccionamiento de las moléculas de DNA relativamente grandes.
A. El DNA de doble cadena puede detectarse por tinción selectiva con agentes de intercalación. Las distintas bandas de DNA deben detectarse para ser aisladas. El dsDNA se tiñe por cationes aromáticos planares (etidio, naranja de acridina o proflavina).
Estos se intercalan entre los pares de bases y son fluorescentes bajo los rayos UVA.
B. El DNA muy grande puede separarse por electroforesis en un gel de campo pulsado. En gel convencional podemos hasta 100.000 pares de bases, hasta cuando los geles contienen solo un 0,1% de agarosa.
En la de campo pulsado (EGCP) se puede hasta 10M de pares de bases. Esta electroforesis requiere que las moléculas sigan la dirección aproximada entre el cátodo y el ánodo. Si la dirección del campo cambia bruscamente, las moléculas lineales se deben reorientar para seguir atravesando el gel. El DNA más corto migra más rápido que el DNA más largo.
1.4 ULTRACENTRIFUGACIÓN Mediante CsCl 1 MODIFICACIÓN IN VITRO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 2 Aislamiento y purificación de ácidos nucleicos 2.1 TIPO DE ÁCIDO NUCLEICO A PURIFICAR 2.1.1 DNA genómico. Es aquel DNA cromosómico nuclear que ha sido aislado directamente de células o tejidos.
Con el DNA genómico podemos observar una nube de hilillos cuando hay mucha cantidad. El DNA se recupera por centrifugación.
No debemos usar Vortex para que el DNA se fragmente porque renaturalizaría.
Primero tiene lugar el crecimiento celular mediante un cultivo bacteriano. Después este es centrifugado, donde se separan las células que se apelmazan, y se rompen las células en suspensión hasta formar un extracto. Este DNA es ahora purificado desde el extracto y más tarde se vuelve a concentrar.
2.1.1.1 PURIFICACIÓN 1.
Cultivo celular: Primero tenemos una fase en la que la concentración de células permanece constante LAG. Después tiene lugar un crecimiento exponencial de células hasta que tiene lugar una saturación y se llega a una fase estacionaria. Una vez superada esta tiene lugar la muerte, y decrece el número de células.
2.
Obtención del extracto celular: Tiene lugar la lisis de la célula; se rompen la pared celular y la membrana.
Hay diferentes métodos de lisis, contenidos en la imagen siguiente. Funcionan en conjunto con la proteinasa K.
3.
4.
Centrifugación: a partir del extracto celular llevamos a cabo la centrifugación para remover los restos cellulares.
Purificación: la mezcla se desnaturaliza con una mezcla de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico (25:24:1). Así obtenemos una capa de DNA y RNA en la parte superior del tubo de ensayo (capa acuosa), fenol en la parte inferior y una interfaz de proteínas coaguladas. Realizamos un tratamiento con RNAsa si queremos obtener el DNA solo.
5.
Concentración del DNA por precipitación. Para obtener el DNA concentrado añadimos etanol (2-3V) / isopropanol (0,6.1V), que disminuyen la constante dieléctrica. Con una varilla de vidrio puedes extraer las fibras de DNA, por lo que el resultante son dos fases; el etanol y el DNA precipitado debido a la centrifugación.
2 Lo hacemos en presencia de sales alcalinas como Acetato de sodio 0.3M, Cloruro de sodio 0.2M, Acetato de amonio 2.5 M, Cloruro de litio 0.8M. Su labor es apantallar cargas 2.1.2 DNA plasmídico Es un DNA circular, que se diferencia del genómico por el tamaño. El plásmido es una molécula pequeña de DNA, separada físicamente del DNA cromosómico, que se puede replicar independientemente. Normalmente contienen información necesaria para situaciones específicas.
Hay más de una copia de DNA plasmídico por célula.
Las ventajas del DNA plasmídico son su fácil purificación y manipulación.
Tabla 1. Purificación de DNA plasmídico por lisis alcalina 2.1.2.1 PURIFICACIÓN POR LISIS ALCALINA 1.
Cultivo celular. Tiene lugar el crecimiento del cultivo y obtenemos el pellet bacteriano 2.
Eliminación del RNA. Resuspendemos el pellet bacteriano y eliminamos el RNA.
3.
Lisis alcalina. Usamos SDS para llevar a cabo la lisis de las células. Este proceso ha de llevarse a cabo en condiciones alcalinas para que el DNA esté desnaturalizado (NaOH).
4.
Neutralización. Añadimos acetato de sodio para la renaturalización (pH 4,5).
3 5.
Eliminación del DNA genómico. Después de la adición de acetato de sodio, las moléculas de DNA plasmídico pequeñas se pueden renaturalizar, mientras que las del genómico, que son grandes, se quedaban formando agregados.
6.
Limpieza de la preparación. Eliminamos las proteínas con fenolcloroformo, y se concentra el DNA por precipitación (se forma un precipitado de DNA de cadena sencilla con SDS y acetato). Si realizamos una columna, colocamos una sustancia con alta afinidad (básica o con carga positiva), lo que permite que el DNA puro se quede unido, y al lavar la columna con etanol nos deshacemos del impuro. Para volver a separar el puro de la columna añadimos agua.
Tabla 3. La unión ocurre en presencia de alta concentración de sal, y es interrumpida por la elución con agua.
Tabla 2. Purificación del DNA plasmídico después de la lisis alcalina y neutralización 7.
Concentración. El DNA plasmídico se recupera por precipitación. Obtenemos un plásmido de DNA parcialmente puro, preparado para la digestión enzimática y análisis de gel.
2.1.3 RNA y sus fracciones Es un ácido ribonucleico, y por lo tanto inestable en medio alcalino debido a su OH 2’. Para su purificación tenemos en cuenta que es inestable químicamente y que las RNAsas son extremadamente resistentes.
El tiocianato de guanilina: agente desnaturalizante que se usa para la lisis. Añadimos una mezcla de fenolcloroformo (pH ácido), porque a pH ácido los fosfatos se protonan. Centrifugamos a 4ºC y obtenemos dos fases diferentes: - El DNA se ubicará en la fase orgánica.
El RNA al ser de cadena sencilla, puede formar puentes de hidrógeno con la fase acuosa.
Extraemos la fase acuosa y diluimos en isopropanol. Llevamos a centrifugación y obtenemos un pellet de RNA, que resuspendemos en agua destilada.
Tabla 4. Purificación de RNA total 4 2.1.3.1 PURIFICACIÓN DE mRNA Cromatografía de afinidad El mRNA es el RNA minoritario. Esta purificación nos permite saber si un gen se expresa más o menos según la cantidad de este que haya.
La mayoría de mRNAs eucariotas tienen cola poliA.
Se usa una columna de agarosa, y las bandas más intensas se corresponden al 28S y 16S.
Purificación magnética En este método añadimos oligo dT (complementarios a las colas poli A) con MagnelightTM, lo que nos permite lavar la muestra mientras mantenemos fijos los mRNA con un imán.
Ventajas de la purificación magnética del mRNA: • • • • • No se necesitan solventes orgánicos No hay necesidad de precipitar transcritos de poliA.
Obtenemos RNA con cola poliA en menos de una hora La contaminación de DNA genómico es negligible Reusable beads.
Tabla 5. Purificación del mRNA con magnelightTM 5 3 Análisis de ácidos nucleicos 3.1 ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO Este tipo de análisis nos informa sobre la concentración de un ácido y su pureza. El espectro de absorción a 260nm nos informa de la concentración.
3.2 ELECTROFORESIS Esta técnica nos permite separar las moléculas según su migración al aplicar un campo eléctrico.
Generalmente se usa una matriz porosa como soporte, como los genes de agarosa (moléculas entre100bp y 20kbp) o poliacrilamida (entre 10 bp y 1kbp).
3.2.1 Geles de agarosa La agarosa es un gel inerte y transparente. Es además relativamente resistente al pH, la temperatura, y agentes desnaturalizantes.
Según la concentración de agarosa que tengamos en el gel, varía el tamaño del poro.
Por lo general usamos baja concentración de agarosa (obtenemos bandas pequeñas), pero no demasiado poca, puesto que si no se pegaría y no habría migración.
Visualizamos el resultado con bromuro de etidio (SYBr), observamos una fluorescencia rosada.
Necesitamos un tampón de corrida (TAE 1x, TBE 0,5) y un tampón de carga.
Aplicamos alrededor de 1-5 volts/cm.
6 3.2.2 3.2.2.1 Factores que afectan la movilidad en geles de agarosa EL TAMAÑO DE LA MOLÉCULA La migración de moléculas de DNA lineales es proporcional a su talla, de forma que según cuál haya sido su migración, podremos estimar el tamaño de un fragmento de DNA. Para ello creamos mapas de restricción.
3.2.2.2 LA CONFORMACIÓN DE LA MOLÉCULA Las moléculas del mismo tamaño migran diferencialmente de acuerdo con su conformación: en los topoisómeros vemos cómo el DNA superenrollado migra muchísimo más que el DNA en estado relajado. En la conformación plasmídica vemos también que la migración sigue este orden (de menor a mayor); multímeros, circular abierta, lineal, superenrollada. En el caso de estas conformaciones no vemos tanta diferencia.
3.2.2.3 LA CONCENTRACIÓN DE AGAROSA Según la resolución que necesitemos usamos diferentes concentraciones. A mayor resolución, menor concentración.
Para recuperar los fragmentos de DNA de geles de agarosa podemos realizar tres técnicas; electroelución, tratamiento con agarasa, o usar agarosa de bajo punto de fusión.
3.2.3 Electroforesis de RNA 7 El RNA también puede ser separado por electroforesis, tanto el de cadena simple como el de cadena doble. Puede formar estructuras (pliegues sobre sí mismo); en este caso añadiríamos formaldehído para desnaturalizarlo y hacerlo lineal, y después usaríamos el procedimiento electroforético para estimar su peso molecular (Northern Blot).
3.3 EMSA/ GELES DE RETARDO Puedo saber si una proteína puede interaccionar con un DNA por la secuencia específica.
Mediante la electroforesis del DNA determinamos si hay interacción entre algunos DNA y proteínas, mediante ensayos como EMSA (geles de retardo). Estos se fundamentan en que disminuye la movilidad cuando se forma un complejo DNA-proteína: si hay interacción, veremos el DNA con la proteína en una banda más retrasada. La banda inferior se corresponde con el DNA, la del medio con una interacción DNA-proteína y la superior con proteínas.
En la figura de la derecha desaparece el complejo porque el DNA no marcado está en mayor cantidad.
En la 4a posición tenemos el DNA que no contiene la secuencia que estamos buscando.
En el último carril añadimos un anticuerpo contra la proteína analizada; cuando el anticuerpo está formando un complejo ternario con proteína y DNA, avanza mucho más.
8 4 Endonucleasas de restricción Las endonucleasas de restricción cortan el DNA. Son de origen bacteriano y forman parte del sistema de defensa de las bacterias.
Las bacterias reconocen secuencias específicas y metilan aquel DNA que las tenga. Cuando está metilado no se puede digerir.
Cuando viene un DNA externo este no se metila y se puede digerir.
Nota: M+R+ tiene metilación y restricción 4.1 TIPOS DE ENZIMAS Tipo I Es un enzima bifuncional, con centros catalíticos que permiten hacer o la metilación o la restricción. Los sitios son asimétricos y están separados. No es preciso, cortan muy lejos de la secuencia.
Tipo III Reconoce una secuencia asimétrica y recorta unos 20 o 30 pares de bases después.
Ambos requieren ATP, Mg, SAM (para la metilación de las secuencias del DNA).
Tipo II Están separados en enzima que metila y el que corta. Reconoce una secuencia que tiene entre 4 y 6 pares de bases. Corta donde reconoce. Este sistema sirve para diseñar a medida un proceso de clonaje. No necesita ATP, solo necesita de Mg como cofactor.
Estos reconocen secuencias entre 4 y 6 nucleótidos y casi siempre palidrómicos (leemos la cadena en 5’-3’ y tiene la misma secuencia de DNA).
• Extemos generados 9 Los enzimas pueden producir extremos cohesivos o extremos romos (ambas cadenas terminan cortantes y en el mismo nucleótido). Dependiendo de los tipos de extremos que se generen se usarán o no para clonaje. Si vuelvo a juntas los extremos generados, regenero el sitio de restricción original.
• Nomenclatura de los enzimas EcoRI (E de género, Co de especie, R de la cepa, I porque es el primer enzima que se aisló de esa cepa).
Las flechas en la secuencia in dican el tipo de corte. Los asteriscos son las posiciones que podrían ser metiladas.
• Compatibilidad de extremos Entendemos como extremos compatibles aquellos cuya parte de cadena sencilla puede complementarse para facilitar la ligación.
En el caso de los enzimas de tipo II los extremos son compatibles: 1.
Hay enzimas que a pesar de ser diferentes generan extremos cohesivos que se complementan mediante el apareamiento de bases.
2.
Pueden ser generados por un enzima que tenga diana de 4 bases y otro enzima de diana que tenga 6 bases, pero deben compartir la secuencia de la parte del DNA que sobresale.
10 3.
También puede ser que las dianas sean de 6 nucleótidos diferentes pero que compartan la parte central de la secuencia y sitio de corte.
Casos especiales: tenemos enzimas de restricción con dianas múltiples Isosquizómeros: tienen la misma diana de reconocimiento (pueden tener el corte en sitios diferentes).
4.2 APLICACIONES Las aplicaciones consisten en el clonaje, la creación de mapas de restricción y RFLP.
1.
Obtención de un mapa de restricción; consiste en poder ubicar los sitios de corte de diferentes enzimas en una molécula de DNA. Si parto de una molécula lineal y corto con el enzima 1, tendré dos bandas en electroforesis. En una circular tendré una.
La circular necesita dos sitios de corte para tener dos bandas.
Sumar kb en una columna.En la primera columna tengo el enzima 1, con 3, luego ha habido 2 cortes. En la segunda columna tengo enzima 2, tengo 2 bandas, luego ha habido un corte.
4.3 OTROS ENZIMAS QUE MODIFICAN LOS ÁCIDOS NUCLEICOS. Las nucleasas Hidrolizan enlaces fosfodiéster DNAsas Exonucleasas Eliminan nucleótidos del extremo uno a uno Exonucleasa III (E.Coli) BAL 31 (Alteromonas) Deleciones de DNA lineal Elimina nucleótidos del 3’ dsDNA. Funciona mal en 3’ protuberantes. No funciona en ssDNA.
Digiere 5’ y 3’ de dsDNA.
Acortar DNA por ambos sitios 11 También actúa como endonucleasa de solo el ssDNA.
DNAsa I Endonucleasa Rompe enlaces en el interior de la cadena del DNA Mung Bean Elimina DNA en protocolos de purificación de RNA o proteínas.
Corta adyacente a pirimidinas Marcaje de DNA por Nick translation Productos fundamentales di, tri y tetranucleótidos Análisis de interacciones DNAproteína por footprinting Actividad con Mg2+ o Mn2+ Formación de extremos romos Corta ssDNA y dsDNA Actúa sobre ssDNA para formar oligonucleótidos fosforilados por el 5’.
En cantidades altas degrada dsDNA y dsRNA.
Nucleasa SI Analizar híbridos DNA-RNA y para formar extremos romos A concentraciones altas degrada dsDNA y dsRNA.
A medias digiere dsDNA en nicks.
A bajas digiere ssDNA y ssRNA.
RNAsas RNAsa A RNAsa H Eliminación del RNA para purificar DNA.
Mapping de mutaciones en el DNA o RNA por Mismatch cleavage Corta ssRNA por 3’OH de residuos de pirimidina Síntesis de cDNA Digiere el RNA de un híbrido DNA:RNA Ilustración 1 12 4.3.1 FOOTPRINTING El footprinting es un método que nos permite estudiar interacciones la de proteínas con el DNA y nos permite ver la secuencia no específica de estas proteínas. Podremos ver las regiones que están realmente unidas a las proteínas (zonas protegidas por la unión a la DNAsa I) Los genes de retardo ya nos permitían ver si se formaban complejos DNA proteínas.
En este método tenemos una región de DNA que sabemos que tienen unión a esa proteína.
El DNA está marcado en un extremo de solo UNA de las dos cadenas.
Tenemos dos muestras, una solo con DNA (control, como se digiere con la DNAsa I) y en la otra tenemos el complejo que también se va a digerir con la DNAsa 1. Es una digestión parcial; el enzima está en pocas cantidades para que corte pocas veces por molécula. Nosotros veremos el fragmento que contiene la marca.
Una vez digerido electroforesis desnaturalizantes; separamos cadenas y vemos resolución a nivel de pares de bases. Usamos poliamida 20% + 8M Urea.
Los más pequeños migran más y se alejarán más del punto de aplicación. Aquella zona en la que no tengamos bandas de digestión será la zona que no se ha digerido (porque DN A está protegido por la proteína frente a la DNAsa I).
Esta proteína tiene una secuencia de reconocimiento ACGTCC-6pb-ACGTCC (repeticiones de la misma secuencia separadas).
El DNA solo se encuentra marcado en una cadena para que no veamos las dos cadenas, y así sepamos la zona de unión. No sería interpretable el resultado si estuviese en las dos.
5 • • • • • • • • - Uso de los ácidos nucleicos Clonaje Detección y/o secuenciación de genes o regiones específicas de DNA Detección de microorganismos o virus Expresión de proteínas recombinantes Mutagénesis dirigida Organismos transgénicos Aplicaciones biomédicas Análisis de la expresión génica Qué genes se están expresando Dónde y cuándo se expresan los genes Qué tasa de expresión tiene un gen? 13 ...

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