Tema 2 - Cultius cel·lulars (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2016
Páginas 19
Fecha de subida 19/03/2016
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

Tema 2. El laboratori de cultiu cel·lular instrumental (asèpsia, incubació i observació) El medi de cultiu no solament compren el medi líquid sinó també la fase gas i la fase sòlida.
L’objectiu d’obtenir un entorn adequat és aconseguir que la cèl·lula estigui feliç: “happy” environament.
Comencem des de les cèl·lules cap a fora: primer l’entorn de la cèl·lula, on ho incubem, els aparells on ho manipularem i les instal·lacions de cultiu.
Medi de cultiu Fase de substrat + fase gas + fase líquida.
Fase de substrat  format per materials que poden ser molt diversos, - - - Per exemple les plaques de petri format de plàstic anomenat poliestirè, Però també podem cultivar cèl·lules sobre vidre, aquestes permeten muntar-ho sobre portaobjectes i veure-ho en un microscopi d’alta resolució. Actualment on cultivem més és sobre plàstic.
Però a més podem utilitzar molts altres materials, per exemple sobre metalls, per exemple quan fem un treball per una indústria que ens pregunta que el material sobre una pròtesi ens pregunten si és tòxic o no per les cèl·lules, doncs fem créixer cèl·lules i mirem si és tòxic.
Podem fer-les créixer també sobre microcarriers, que són boletes recobertes de cèl·lules que s’agiten en un reactor per augmentar la capacitat de cultiu del reactor.
Podem sembrar les cèl·lules sobre interfases, per exemple de líquid-aigua.
Hi ha un concepte important que és “Feeder layers” que significa superfície d’alimentació, això vol dir que aporta alguna cosa que el cultiu necessita, per exemple factors, poden ser moltes coses diferents, per exemple un altre tipus cel·lulars que formen una capa i sobre posem el nostre cultiu, quan creixem cèl·lules mare embrionàries, també pot ser una capa de cèl·lules disperses quan fabriquem la pell, - queratinòcits, pot ser una capa de no cèl·lules però que han fabricat alguna cosa per exemple la matriu que és rica de factors de creixement, adhesió... les cèl·lules Superfícies tractades: les cèl·lules s’adhereixen a la matriu extracel·lular, no al plàstic! La MEC és la que s’uneix a les càrregues del plàstic. Proteïnes com la vitronectina, la làmina s’hi uneix per adhesió. Aleshores les cèl·lules, que sí que tenen receptors per les proteïnes de les MEC, s’hi adhereixen.
o Si jo volgués separar cèl·lules amb receptors per proteïnes de la matriu diferents, puc jugar amb el recobriment de la placa per seleccionar.
Plàstic poliestirè Polímer de poliestirè, molècula que té la forma: quan polimeritza forma el poliestirè, polímer que no té carrega elèctrica, molècules sense grups carregats, doncs és altament hidrofòbic, doncs com enganxarà proteïnes que enganxen a la seva vegada les cèl·lules? No poden, doncs hauran d’aconseguir que tingui carrega, aleshores fem una sèrie de tractaments que generaran una sèrie de grups carregats. No nosaltres, sinó la casa comercial que tracta el plàstic, de manera que aconsegueixen que la superfície adopti una carrega neta negativa.
Si utilitzem les mateixes plaques que utilitzem en pràctiques per créixer bacteris, les fem servir per créixer cèl·lules, no ho faran, solament ho faran les que creixin les dilucions. El plàstic per bacteris és el poliestirè no tractat, que és hidrofòbic. Si fem el tractament obtenim el 3, que és el poliestirè tractat estàndard, aquest és hidrofilic i iònic. Quan el tractem menys agressivament tenim el de baixa adhesió, amb carrega, amb tractament més agressiu tenim alta adhesió. Però si volem de carrega positiva per unir altres materials li posem poli-lisina per revertir la carrega.
És important que cada casa comercial aplica un tractament diferent, doncs el nivell de carrega és diferent, doncs no és el mateix utilitzar qualsevol tipus de plàstic. Doncs en un laboratori fem servir diversos plàstics i comprovem quin ens va millor.
Utilitzem aquest plàstic perquè és relativament barat, és modelable i tenen és bastant transparent. L’utilitzem en diverses formes, ja que és modelable: plaques de petri, botelles rouz, botelles roller, spinner flask (permeten el cultiu de cèl·lules en tota la paret, no l’omplim de medi, sinó que les fem rodar de manera que el medi esta constantment tocant tota la paret) i bioreactors. Cada reactor té un rendiment proporcional a la seva superfície. Té a més un volum recomanat de medi, no ens podem passar, ja que sinó evita el contacte d’oxigen a les cèl·lules.
Fase gas  aquesta intervenen diferents gasos, oxigen, nitrogen (més del 70% inert per nosaltres), diòxid de carboni, si hi hagués monòxid de carboni també seria important. Però per les cèl·lula sobretot tindrem en conte dos gasos: 1. Oxigen: amb un 20% d’oxigen en aire i respecten els coloms de treball, tindrem suficient perquè arribi oxigen a les cèl·lules, pel que no el pujarem, ja que si el pujem comencen a aparèixer reaccions químiques no desitjades, ja que obtenim productes tòxics per les cèl·lules que generen problemes. Doncs no tocarem el contingut d’oxigen (no perquè no ens agradi, sinó perquè generi problemes).
2. El CO2 està aproximadament al 0’1-0’2% a l’atmosfera, però en els incubadors es treballa al 5% per sobre del que hi ha en l’atmosfera, pel que hi ha sistema d’injecció i control del diòxid de carboni. Gastem molts diners, això vol dir que és molt important, el pujem, la resposta habitual és perquè necessitem controlar el pH (això és una conseqüència secundaria), però no és la raó, sinó que necessitem l’ió bicarbonat, necessari extracel·lularment, ja que els sistemes de transport de membrana ho utilitzen, ja que si no el tenim hi ha sistemes de cotransport que no funcionen, i doncs la cèl·lula no obtindrà certs materials. I com l’obtenim? Ja que fem una sal que es descompon i l’obtenim, aquesta és el bicarbonat sòdic, en aigua fa bombolles, ja que fa un ió que es descompon en aigua i CO2, doncs no ens interessa aquests, sinó que volem l’ió bicarbonat, i el que hem de fer és posar més concentració de CO2 per desplaçar el equilibri. En 2% necessitem menys bicarbonat que al 5%. Com efecte secundari, es pot ajustar el pH a neutre, però l’ió bicarbonat és un tampó molt dolent a pH neutre, per tamponar bé s’utilitza HEPES que és bon tamponant aquesta zona, substància similar al tris.
Fase líquida  tres taules amb llista de components que formen el medi, cada columna és la concentració que necessitem depenent del medi. Als que tenen molts components els anomenem medis rics, però un medi pobre igualment pot tenir des de 30 components. Doncs és un gran treball fabricar-los, per això els comprem fets. El medi té color vermellós que és un indicador de pH fent que sigui neutre (vermell neutre). La botella abans d’utilitzar-la se li afegeixen algunes coses, aquelles que no poden tenir de sèrie perquè o bé és inestable o per varietat de aplicació.
- - Li afegim antibiòtics, Li afegim sèrum  una fracció líquida obtinguda de la sang on no hi ha present les proteïnes de coagulació, doncs amb sang, si hi posem un anticoagulant i centrifuguem obtenim plasma, però el sèrum s’obté sense anticoagulant, ja que ho deixem coagular, ja que les proteïnes ens molesten.
A més normalment afegim un tercer component que és la glutamina  que és un aminoàcid, la raó és perquè aquesta és inestable en solució i es descompon de manera espontània en glutàmic i amònic, aquesta descomposició es produeix i la cèl·lula és incapaç de revertir-ho perquè no presenta glutamina sintasa, la majoria de cèl·lules no en presenten, per aquesta raó preparem la glutamina concentrada i l’afegim en medis de cultiu a la concentració que necessitem, i aquest medi l’utilitzem com a màxim una setmana. Però no sempre l’afegim perquè alguna casa comercial ha fet un mecanisme per tal de que no es descompongui, perquè en comptes de posar-la com a aminoàcid el posa en dipèptid que és estable i la cèl·lula l’introdueix i el pot utilitzar. Aquest dipèptid s’anomena glutamax, i està patentat per això no poden utilitzar-lo altres cases comercials, fins d’aquí uns anys.
Components que formen un d’aquests medis, si els hagués d’agrupar sortiria: 1. El primer que decidim al fer un medi és la composició de sals que formarà la concentració salina, s’anomena concentració salina equilibrada. Hi ha diferents solucions salines, per exemple de Earle’s, PBS-A, PBS-S... cada solució s’utilitza com a base per formar diferents medis. Responsable sobretot del control osmòtic, a més aporta la major part dels ions.
2. Sistema tampó de pH, que és el carbonat/bicarbonat de sèrie, però tampona malament per això s’acostuma a afegir HEPES, i també una substància com a indicador de pH, el vermell fenol: vermell neutre, groc a l’àcid i blau a alcalí. Això varia doncs durant el creixement cel·lular, així sabem a quin pH ens trobem.
3. En el medi també afegim una font de carboni i energia, normalment és un carbohidrat, el 99% dels casos és glucosa, solament en alguns casos posem galactosa (i encara menys freqüentment fructosa). Normalment de 1 a 4’5 g/L.
4. També necessita vitamines, que podem posar-ho en el medi o formar part del sèrum i ja tenim suficient. Familia de vitamina B, vitamina A i E, precursors de nombrosos cofactors, el sèrum és la font principal.
5. Proteïnes i pèptids, aquests formen part del sèrum.
6. Igual passa amb els àcids grassos i elements traça.
7. L’últim element important és l’aigua, tot això ho preparem sobre líquid, sobre aigua que ha de ser molt pura i especial per cultiu cel·lular, això no significa que sigui diferent a H2O, però ha de tenir una neteja especial de certs tipus de components, són carbohidrats que responen al nom de pirògens, aquests són elements que injectats a un animal provoca febre, això significa que és una infecció, doncs un tros de paret bacteriana. Les cèl·lules en cultiu si detecten que arriben bacteris, es suïciden, doncs si està contaminat el medi per paret cel·lular, doncs les cèl·lules no viuran. Doncs hem d’evitar-ho. Hi ha molts problemes de manipulació de materials. Els carbohidrats de bacteris s’uneixen fortament al vidre, doncs és molt important no utilitzar les mateixes ampolles per bacteris i cultius.
Tenim l’homogeneïtat assegurada, el problema és quan s’acaba. Hem d’assegurar que la transició entre lot i lot sigui el més homogènia possible. Es fan molts experiments, s’agafa una línia cel·lular i s’ha vist com es comporta amb diferents sèrums, sense sèrums no creix, volem el que s’assembla més. Al final trobem un que respon al nostre patró, es busca homogeneïtat.
Intentes reproduir les mateixes condicions que van fer fa dos anys.
Experiment agafat d’un llibre clàssic d’enginyeria de teixits. En cada columna tenim cinc plaques diferents en les quals s’han sembrat el mateix número de cèl·lules. S’ha intentat veure quin nivell de factors té el sèrum. En cada columna posem el medi amb sèrum diferent, si té molts factors doncs podrà compensar aquells factors que no pot secretar les cèl·lules. Si el sèrum és pobre no podrà donar aquells factors que els hi falta a les cèl·lules, ja que no s’ho donen entre elles.
Quin és el sèrum més ric de la imatge? El 3r. però si el sèrum que teníem originalment és un altre, doncs compraríem el 1, 2 i 3. El més homogeni seria el 1 i 2. S’intenta veure el grau de riquesa. Queden proteases de complement, que hidrolitzen part del coàgul i ataquen part de patogen, si s’activen al cultiu poden atacar a la nostre cèl·lula. doncs normalment per evitar-ho s’activa el complement. Comprem botelles individuals i fem la inactivació de complement, que és de 56º 30min, això solament es fa si es requereix, ja que destrueix una bona part de les propietats del sèrum. Destrueix les característiques que té, doncs solament es fa quan és imprescindible.
Hi ha algunes cases comercials que asseguren que no tenen complement, ja que ho passen per unes columnes amb anticossos que les retenen, però aquests sèrums són unes 10 vegades més cars.
Ens diu els rangs de sèrum que posem en el cultiu final, posem més sèrum com més primària és la línia. Una línia primària necessita un percentatge de sèrum superior a una continua, moltes vegades d’un 20-25%.
El sèrum doncs és un problema, podem eliminar el sèrum en els medis de cultiu? SI. Però l’eliminació del sèrum no és una opció moltes vegades pel treball rutinari, moltes vegades el sistema no permet eliminar-lo. Per exemple si volem purificar una proteïna, és més fàcil fer-ho si en el medi no hi ha altres proteïnes, i també degut a patògens?. Tots els sistemes de producció de biofàrmics es fan en sistemes lliures de fàrmacs, això ha obligat a fer un estudi molt costós per identificar quins components s’han de purificar, sintetitzar... per tenir-los purs i afegir-los al medi com a component individual. Si necessitem albúmina, doncs ho farem recombinant, tot això s’afegeix en els medis de cultiu. Doncs finalment obtenim un medi completament definit on no existeix cap component d’origen animal.
Això es fa en els que estan completament definit, com que son productes industrials, moltes vegades els medis són de composició desconeguda pel públic, ja que és molt valuós per la indústria, doncs no diu que porta.
Tenim avantatges i desavantatges del ús lliure de sèrum. Per exemple beneficis: - Incrementa la productivitat, ja que és molt més controlat.
Menor risc de contaminació.
Més econòmic, perquè treballen amb grans volums.
Facilita enormement la purificació dels productes, ja que no hi ha moltes altres proteïnes. (diapo) Tot i això no és la millor solució, normalment és pitjor que amb un sèrum. Lliure de sèrum és específic de línia cel·lular, s’ha de fer un específic per cada línia, doncs això implica un gran esforç.
L’últim component dels medis de cultiu són els antibiòtics i antifúngics, components que s’afegeixen en el treball rutinari. A ell no li agrada utilitzar-los en les línies cel·lulars, ja que s’hauria de saber si en la població que estem analitzant hi ha cèl·lules o cèl·lules i bacteris (amb antibiòtics no som conscients de si hi ha bacteris). Veiem el efecte conjunt dels dos metabolisme, així sense antibiòtic ens assegurem de que no hi ha bacteris i aleshores veiem solament l’efecte de les cèl·lules. Tenim una llista de diferents antibiòtics.
L’estàndard de laboratori és treballar amb streptavidina i penicil·lina. Alternativament posem gentamicina és important no posar les cèl·lules sempre amb el mateix antibiòtic ja que és quan apareixen resistències. Doncs s’obliga a utilitzar diferents antibiòtics, això es fa amagant antibiòtics, i fent rotacions de tres mesos.
Els antibiòtics poden afectar al comportament de la cèl·lula? es respon mirant les dues columnes. En el cas de la eritromicina (primera columna diu si és efectiva contra bacteris), la segona columna diu si afecta a cèl·lules, doncs els primers efectes es comencen a detectar a 300, la diferència amb la concentració que afecten a bacteris no és molt gran, doncs és un antibiòtic és poc segur. La penicil·lina doncs és segur ja que el ventall terapèutic i tòxic és ampli. L’antibiòtic més perillós que coneix és ¿¿ ja que per sota i per sobre és tòxic.
INTRUMENTACIÓ/EQUIPAMENT Primer explicarà els tradicionals i després explicarà com s’organitzen en el laboratori.
Laboratori de cultiu cel·lular (animal) La naturalesa dels cultius cel·lulars implica que tingui característiques especials: - Necessitem que el cultiu es mantingui pur i estable, evitant les contaminacions  tècnica asèptica, equips Els cultius presenten un cert risc per l’operari (des de moderat a extrem)  tècnica asèptica, equips, protecció personal Els cultius presenten un risc per l’ambient i la població  tècnica asèptica, equips, instal·lacions (BSL) Tècniques per protegir: tècniques de bioseguretat.
Classifiquem equips: Comencem a entrar a un àmbit on es important de que això és legislació d’activitat laboral, controlem alguna cosa en l’àmbit de treball. Normés que cal seguir, d’obligat compliment hi ha una gran norma d’estats units NSF-49-2002, després hi ha la norma Europea EN-12469-2000 (molt més complicada).
Hem d’utilitzar un tipus de instruments que anomenarem cabines de treball: - Cabines de cultiu cel·lular: cabina en la qual podem cultivar cèl·lules. Hi ha tres grans classes: I, II i III.
Cabines de flux laminar: un sol tipus.
Cabines de seguretat biològica Totes les cabines es basen en el filtre HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters), és un filtre que reté partícules d’una mida determinada. HEPA és la barra groga de la E, arriba aire brut i quan l’aire travessa el filtre, l’aire a l’altre costat és laminar i a més lliure de partícules. Reté el 99’99% d’eficàcia tota partícula que té una mida superior a 0’12 micrometres. Reté tots els bacteris, formes esporulades.... però no elimina els virus, no es poden eliminar mitjançant filtració. No protegeix de virus de càpsides individualitzades. Treballem amb virus en solució, doncs queden retinguts en partícules d’aigua que són superiors a la mida del filtre. L’única manera de treballar amb virus és amb solució.
Els filtres HEPA són molt fràgils, si esta en un instrument, cal comprovar constantment que estigui ben muntat, acostuma a tenir sensors que ho controlen. A més fer controls anuals.
Veiem els diferents nivells de cabines de cultiu cel·lular.
CLASSE I  imaginem una cuina de casa, on tenim l’encimera on posem les olles i paelles, i sobre tenim un extractor, en l’extractor tindríem un filtre HEPA en les cabines. Doncs és semblant, aspira aire.
L’operari que està fora queda protegit de l’interior, pel moviment del flux d’aire. Però el producte no està protegir de l’exterior. No hi ha superfície estèril.
CLASSE II  intentem aconseguir una superfície de treball estèril, per això el que fem són dues possibles coses. Si el filtre el posem en la paret del fons de l’instrument (vertical), allibera l’aire a l’exterior, com que la zona interior està lliure de partícules doncs el producte queda protegir, l’ambient però no queda protegit (la persona tampoc). En l’horitzontal el filtre forma mitjançant un filtre laminar i genera una superfície estèril (es troba dalt el filtre). En el més bàsic l’aire entra per una cabina fa un “barrido”, passa per darrera i torna a fer el cicle, augmenta la pressió atmosfèrica de l’interior, doncs part de l’aire net surt. Si hi ha un tòxic l’interior està protegit de contaminació, però la persona no. Aquesta cabina no funciona, doncs a partir d’aquesta s’ha generat un nou model. L’aire passa a través del filtre HEPA, quan arriba l’aire de nou en el punt del filtre, el 70% baixa, i el 30% s’expulsa, doncs això fa que hi hagi una pressió atmosfèrica negativa. De manera que entra aire per la reixeta que s’incorpora. I que circula, doncs hi ha una entrada d’aire que fa que circuli. S’ha format una barrera que impedeix que surti res ni que entri res a la superfície de treball. Com que aquesta barrera dona protecció doncs no podem entrar i treure coses d’ella. És a dir, dins de la vertical tenim tipus I i tipus II.
Existeix una altre una mica més complexa. Tipus II-A i tipus II-B. A és la que hem vist. I el B el filtre es troba a baix.
CLASSE III  tercer tipus de cabina, completament tancada, es realitza el treball amb un guants de làtex molt gruixuts. Diferents guants per accedir a les diferents parts del sistema.
Solament es troben en instal·lacions de seguretat.
En aquesta última taula hi ha un resum, de totes les cabines en ordre. De flux laminar és sinònim a classe II, classe I és sinònim a extracció. U: usuari, P: prudcte, M: medi ambient.
Verd: protegeix, vermell: no protegeix.
(ÚLTIMA CLASSE) ...